《抗體制藥par》PPT課件.ppt

1、第四章 抗體制藥,抗體？ 1937年Tiselius用電泳法將血清蛋白分離為 白蛋白、（甲種球蛋白）、（乙種球蛋白 ）、球蛋白（丙種球蛋白），并證明抗體活 性主要存在于球蛋白組分。在相當(dāng)一段時(shí)間 內(nèi)丙種球蛋白稱為抗體的同義詞。,第一節(jié) 概 述,抗體？ 抗體是指能與相應(yīng)特異性結(jié)合的具有免疫 功能的球蛋白（Ig）。它是機(jī)體免疫系統(tǒng)受抗 原物質(zhì)刺激后，B淋巴細(xì)胞被活化、增值和分 化為漿細(xì)胞合成和分泌的球蛋白。,第一節(jié) 概 述,抗原決定簇？ 是指抗原分子中決定抗原特異性的特殊化 學(xué)基團(tuán)，又稱表團(tuán)，通常由5-7個(gè)氨基酸殘基或 5-7個(gè)多糖殘基/核苷酸組成?？乖瓫Q定蔟是T細(xì) 胞受體、B細(xì)胞受體和抗體識(shí)別結(jié)

2、合的基本單 位，他們之間的相互作用具有高度特異性。 如：菌體抗原（O抗原）、鞭毛抗原（H抗 原）等。,第一節(jié) 概 述,多克隆抗體？ 病原微生物含有多種抗原決定簇的抗原物 質(zhì)，因此這些抗體制劑也是多種抗體的混合物 ，故稱多克隆抗體，會(huì)給治療和診斷帶來(lái)誤差 。,第一節(jié) 概 述,單克隆抗體？ 1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴細(xì)胞雜 交瘤技術(shù)制備出單克隆抗體。他們將抗體產(chǎn)生 細(xì)胞于具有無(wú)限增殖能力的骨髓瘤細(xì)胞相融合 ，通過(guò)有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細(xì)胞成為 純一的單克隆細(xì)胞系，此細(xì)胞系能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和 特異性完全相同的高純度抗體。,第一節(jié) 概 述,單克隆抗體？ 由一種抗原決定簇刺激機(jī)

3、體，由一個(gè)B淋巴細(xì) 胞接受該抗原所產(chǎn)生的抗體。 單克隆抗體具有高度特異性、均一性、來(lái)源穩(wěn) 定、可大量生產(chǎn)等特點(diǎn)。,第一節(jié) 概 述,以單克隆抗體作為載體的藥物可對(duì)腫瘤進(jìn)行定向治 療。但是，臨床應(yīng)用的實(shí)踐證明，免疫導(dǎo)向法并沒(méi) 有成功，其障礙有： 單克隆抗體均是鼠源性抗體，應(yīng)用于人體內(nèi)可產(chǎn) 生人鼠抗體，加速了排斥反應(yīng)，在人體內(nèi)半衰期 只有56h，難以維持有效藥物作用靶組織時(shí)間。 完整的抗體分子，即Ig的相對(duì)分子質(zhì)量過(guò)大，難 以穿透實(shí)體腫瘤組織，達(dá)不到有效的治療濃度。,第一節(jié) 概 述,基于上述原因，需從兩個(gè)方面對(duì)單克隆抗體 加以改造： 降低單克隆抗體的免疫原性。 降低單克隆抗體的相對(duì)分子質(zhì)量。 利用基

4、因工程技術(shù)制備出基因工程抗體，即可達(dá)到上 述目的。,第一節(jié) 概 述,單克隆抗體藥的現(xiàn)狀 抗體藥的銷售額 97年99年由4.68億美元增長(zhǎng)到13億美元 03年抗體類藥物總銷售額將會(huì)達(dá)到50億美元 250多種抗體類藥物在臨床試驗(yàn)中 1/3 已進(jìn)入三期臨床 1/4 已通過(guò)臨床三期試驗(yàn) 美國(guó)市場(chǎng)上有種治療用的抗體藥物,第一節(jié) 概 述,單克隆抗體藥的現(xiàn)狀 1994年，Centocor 的Reopro一種血小板表面受體的單克隆抗體片段被批準(zhǔn)用于臨床來(lái)預(yù)防治療血栓形成 1997年批準(zhǔn)上市的12種生物新藥中有2種是抗體藥 1998年上市的12種新藥中有6種是抗體藥 2000年又批準(zhǔn)了Mylotarg用于治療急

5、性髓細(xì)胞白血病的抗CD33單克隆抗體 2001年已批準(zhǔn)及預(yù)期會(huì)被批準(zhǔn)的10多種生物新藥中，也有5種是屬于抗體類藥,第一節(jié) 概 述,抗體藥物市場(chǎng)穩(wěn)步增長(zhǎng),第一節(jié) 概 述,第一節(jié) 概 述,全球有超過(guò)200家上市或未上市公司正在研發(fā)用 于臨床診斷和治療的單克隆抗體 正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)的抗體公司（38家）,第一節(jié) 概 述,當(dāng)前美國(guó)治療性抗體市場(chǎng),第一節(jié) 概 述,當(dāng)前美國(guó)治療性抗體市場(chǎng),第一節(jié) 概 述,中國(guó)抗體研究現(xiàn)狀,第一節(jié) 概 述,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,一、抗原與動(dòng)物免疫 二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇 三、篩選陽(yáng)性克隆與克隆化 四、雜交瘤細(xì)胞抗體形狀的鑒定 五、單克隆抗體的大量制備 六、單克隆

6、抗體的純化,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,設(shè)計(jì)方案： 一個(gè)B淋巴細(xì)胞-只分泌一種特異性抗體 小鼠骨髓瘤細(xì)胞-能無(wú)限增殖,雜種細(xì)胞,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備, 雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的3個(gè)技術(shù)關(guān)鍵 1.B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的特性： B淋巴細(xì)胞（B lymphocytes）： 接受抗原刺激后，能分泌針對(duì)該抗原的特異性抗 體，在體液免疫中具有重要功能。 B淋巴細(xì)胞本身是一種終末分化細(xì)胞，通常不再 進(jìn)行細(xì)胞分裂，存活一點(diǎn)時(shí)間后便會(huì)死亡-短命 細(xì)胞,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,骨髓瘤細(xì)胞（myeloma cells）： 惡性增殖的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，只要營(yíng)養(yǎng)條件適合可永遠(yuǎn) 分裂和存活-長(zhǎng)命細(xì)

7、胞。 經(jīng)篩選與馴化，現(xiàn)已建立多種骨髓瘤細(xì)胞-沒(méi) 有抗體分泌物。,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,2. 細(xì)胞融合技術(shù)：,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,3. 雜交瘤細(xì)胞的篩選：,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,一、抗原與動(dòng)物免疫,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,1.抗原 動(dòng)物體內(nèi) 抗體 特異性差、純度低產(chǎn)量低，反應(yīng)不夠靈敏,2. 抗原 動(dòng)物體內(nèi) 抗體 抗原不純 抗體不純 篩選單一效應(yīng)B細(xì)胞 不能增殖，產(chǎn)生大量抗體,刺激,效應(yīng)B,刺激,效應(yīng)B,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,動(dòng)物

8、免疫:,特定目標(biāo)抗原,動(dòng)物,脾臟中B淋巴細(xì)胞,B淋巴細(xì)胞大量繁殖,免疫,刺激,能分泌針對(duì)于該抗原的特異性抗體,目的： 在細(xì)胞融合后獲 得盡可能多的分 泌針對(duì)于該目標(biāo) 抗原的特異性抗 體的雜交瘤細(xì)胞,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,常用免疫方法：,常規(guī)免疫法 “穩(wěn)妥；優(yōu)勢(shì)克隆” 脾內(nèi)一次性免疫法 “省時(shí)；省抗原” 短程免疫法 “省時(shí)” 體外免疫法 “操作繁瑣”,免疫途徑：,皮下注射 腹腔注射 靜脈注射,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,常規(guī)免疫法：,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,脾內(nèi)免疫法：,脾內(nèi)免疫法即在麻醉?xiàng)l件下直接把0.10.2 ml的抗原注入脾臟進(jìn)行免疫。脾內(nèi)免疫法可提 高小鼠對(duì)抗原的免疫反應(yīng)，節(jié)省

9、抗原用量，細(xì) 胞抗原只需105個(gè)左右，可溶性抗原只需10g 左右。,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,體外免疫法：,體外免疫法的優(yōu)點(diǎn)很多，所需抗原量少，一般只需幾微克，免疫期短，僅45天，干擾 因素少，已成功的制備出針對(duì)多抗原的單克 隆抗體，但融合后產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞株不夠 穩(wěn)定。,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇,細(xì)胞融合方法：,病毒介導(dǎo)的細(xì)胞融合 PEG 介導(dǎo)細(xì)胞融合 電極融合,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,細(xì)胞懸液的制備與融合, 脾細(xì)胞懸液的制備：最后一次免疫后第3天 制備 骨髓瘤細(xì)胞懸液的制備： 于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期制備 細(xì)胞融合：5% PEG （10004000），pH8.0

10、， 38， 1min,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,2. HAT培養(yǎng)基的篩選,融合后細(xì)胞混合液,HAT培養(yǎng)基,HT培養(yǎng)基,正常培養(yǎng)基,2 weeks later,1 week later,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,三、篩選陽(yáng)性克隆與克隆化,常用方法：,要求： 簡(jiǎn)便、快速、敏感； 在短時(shí)間能檢測(cè)大量樣品,酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA） 間接免疫熒光法（Indirect immunofluorescence， IFA） 放射免疫法（radioimmunoassay， RIA） 雙向擴(kuò)散法,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,酶聯(lián)免疫吸附法

11、（ELISA）,技術(shù)原理：,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,四、克隆化,常用克隆化方法：,有限稀釋法 軟瓊脂平板法 顯微操作法,80 個(gè)細(xì)/96孔 飼養(yǎng)細(xì)胞（feeder cells）,ELISA 法檢測(cè)單克隆雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清， 選出分泌特異性抗體的陽(yáng)性孔，所分泌抗體即為 單克隆抗體。,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,單克隆抗體（monoclonal antibody，MAb）,由單一克隆的雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體，只針對(duì)于一個(gè) 抗原決定簇-單克隆抗體（monoclonal antibody， MAb）,單克隆抗體優(yōu)點(diǎn)：,高度純一 高度專一,應(yīng)用：,疾病的論斷和治療（生物導(dǎo)彈） 生物大分子的鑒定、定位和分離純化 細(xì)胞器的鑒定、定位和分離 特定細(xì)胞或病毒的鑒定、定位很分離,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,五、單克隆抗體的大量制備,常用的大規(guī)模培養(yǎng)方法：,動(dòng)物接種法 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法 細(xì)胞培養(yǎng)罐法,第二節(jié) 單克隆抗體及其制備,五、單克隆抗體的大量制備,大量制備單克隆抗體的方法主要有兩種：,體外培養(yǎng)法：10g/ml 動(dòng)物體內(nèi)誘生法：520mg/ml,BALB/c小鼠 優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，比較經(jīng)濟(jì)，所得單克隆抗體較多且效價(jià)較高。缺點(diǎn)：混有雜蛋白,有血清培養(yǎng)法； 無(wú)血清培養(yǎng)法,第二節(jié) 單克隆抗體及其