《植物生理生化》實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

1、.植物生理生化實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)（適用專業(yè)：農(nóng)學(xué)類相關(guān)專業(yè)）黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)植物科技學(xué)院生理生化教研室；.目 錄生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)部分：實(shí)驗(yàn)一、氨基酸的紙層析 1實(shí)驗(yàn)二、蛋白質(zhì)含量測定（設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)） 5實(shí)驗(yàn)三、酶的基本性質(zhì) 7實(shí)驗(yàn)四、維生素C含量的測定 12實(shí)驗(yàn)五、還原糖和總糖的測定 14實(shí)驗(yàn)六、淀粉酶活性的測定 17實(shí)驗(yàn)七、脂肪浸提索氏脂肪浸提法 20實(shí)驗(yàn)八、一種簡單實(shí)用的提取植物DNA的方法 22實(shí)驗(yàn)九、聚丙烯酰胺電泳法測定大麥、小麥種子純度 24實(shí)驗(yàn)十、淀粉酶的誘導(dǎo)、提取和活性測定（綜合性實(shí)驗(yàn)） 26植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)部分:實(shí)驗(yàn)一、植物組織水勢的測定（小液流法） 28實(shí)驗(yàn)二、植物傷流量的測定 30實(shí)驗(yàn)三、

2、根系活力的測定 31實(shí)驗(yàn)四、蒸騰強(qiáng)度的測定 35實(shí)驗(yàn)五、葉綠體色素的提取、分離、性質(zhì)和定量測定（綜合性實(shí)驗(yàn)） 37實(shí)驗(yàn)六、光合強(qiáng)度的測定（改良半葉法） 39實(shí)驗(yàn)七、呼吸強(qiáng)度的測定 41實(shí)驗(yàn)八、植物抗逆性的鑒定（電導(dǎo)儀法） 43實(shí)驗(yàn)九、植物缺水程度的測定（脯氨酸法） 45生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)部分實(shí)驗(yàn)一 氨基酸的紙層析一、目的：層析分析法已廣泛用于氨基酸、核酸、激素、維生素、糖類的分離與分析。其優(yōu)點(diǎn)是能夠分離與分析在組成、結(jié)構(gòu)及性質(zhì)上極為相似的物質(zhì)；設(shè)備簡單，操作容易，樣品用量很少，結(jié)果也較明確。本實(shí)驗(yàn)的目的在于要求學(xué)生掌握紙層析法的一般原理和操作技術(shù)。二、原理：紙層析法是以濾紙作為支持物的分配層析法。分

3、配層析法是利用物質(zhì)在兩種不同混合溶劑中的分配系數(shù)不同，而達(dá)到分離的目的。通常用表示分配系數(shù)。在一定條件下，一種物質(zhì)在某溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)是一個(gè)常數(shù)。層析溶劑是選用有機(jī)溶劑和水組成的。由于濾紙纖維素對(duì)水有較強(qiáng)的親和力（紙上有很多-OH 基與水以氫鍵相連），吸附很多水分子，一般達(dá)濾紙重的22%左右（其中約有6%的水與纖維素結(jié)合成復(fù)合物），因此使這一部分水?dāng)U散作用降低形成靜止相；而有機(jī)溶劑與濾紙的親和力很弱，可以在濾紙的毛細(xì)管中自由流動(dòng)，便形成流動(dòng)相。層析時(shí)，將濾紙一端浸入層析溶劑中，有機(jī)溶劑連續(xù)不斷地通過點(diǎn)有樣品的原點(diǎn)處，使其中的溶質(zhì)依據(jù)本身的分配系數(shù)在兩相間進(jìn)行分配。分配的過程：一部分溶質(zhì)隨有

4、機(jī)相移動(dòng)離開原點(diǎn)而進(jìn)入無溶質(zhì)區(qū)，并進(jìn)行重新分配，即一部分溶質(zhì)從有機(jī)相又進(jìn)入水相。隨著有機(jī)相不斷向前移動(dòng)，溶質(zhì)不斷地在兩相間進(jìn)行可逆的分配，不斷向前移動(dòng)。各種物質(zhì)因其分配系數(shù)的不同，在兩相間分配的數(shù)量也就不同，分配系數(shù)小的溶質(zhì)在流動(dòng)相中分配的數(shù)量多，向前移動(dòng)的速度快；而分配系數(shù)大的溶質(zhì)在靜止相中分配的數(shù)量多，移動(dòng)的速度慢。所以各種溶質(zhì)在層析的過程中由于移動(dòng)的速度不同便可以彼此分開。移動(dòng)速度一般用移動(dòng)速率表示Rf 表示：各種化合物在恒定條件下，經(jīng)層析后都有其一定的Rf值，也就是說在層析譜中有一定的位置。借此可以達(dá)到分離、定性、鑒別的目的。Rf值決定于很多的因素，其中最主要的是所分離物質(zhì)的分配系數(shù)。

5、物質(zhì)的分配系數(shù)是由以下因素決定的：（1）物質(zhì)極性的大小。水的極性很強(qiáng)，一般極性強(qiáng)的物質(zhì)就容易進(jìn)入水相，非極性的物質(zhì)易進(jìn)入有機(jī)溶劑中。例如側(cè)鏈含-OH和-NH2、-COOH較多的氨基酸分配在水相中，Rf值較小，而含非極性（如-CH3 ）較多的物質(zhì)其分子的極性降低，Rf值增大。（2）濾紙的質(zhì)地以及為水分飽和的程度。濾紙的質(zhì)地必須均一、純凈、厚薄適當(dāng)，具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，層析前應(yīng)為水和有機(jī)溶劑的蒸汽所飽和。（3）溶劑的純度、pH值和含水量。pH值和含水量的改變可使氨基酸和層析溶劑極性改變，Rf值也隨之改變。（4）層析的溫度和時(shí)間。溫度改變使溶劑中有機(jī)相含水量改變，Rf值也改變。當(dāng)所有條件相同時(shí)，層析

6、時(shí)間短，測Rf值的因素必須嚴(yán)格控制。三、實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑：1、實(shí)驗(yàn)材料：在25溫箱中萌發(fā)2-3天的綠豆芽。2、儀器：（1）恒溫水浴一臺(tái)；（2）烘箱一個(gè)；（3）研缽一個(gè)；（4）三角瓶一個(gè) ；（5）蒸發(fā)皿一個(gè)；（6）50毫升分液漏斗一個(gè)；（7）量筒三個(gè)；（8） 微量吸管（或標(biāo)有刻度的毛細(xì)管）；（9）電熱吹風(fēng)機(jī)一個(gè)；（10） 層析缸及培養(yǎng)皿；（11）層析濾紙；（12）小型噴霧器一個(gè)；（13）剪刀、刀片、鉛筆、尺子、玻棒、凡士林、點(diǎn)樣瓶。3、試劑：（1）氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：濃度為0.01M，溶于10%異丙醇中。第一組：天冬氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸。第二組：鳥氨酸、甘氨酸、-氨基丁

7、酸、纈氨酸。第三組：谷氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、脯氨酸。第四組：酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸、谷氨酰胺。第五組：胱氨酸、羥脯氨酸、異亮氨酸、瓜氨酸、天門冬酰胺。（2）溶液系統(tǒng)：第一向：正丁醇：甲酸：水：（15：3：2，體積），搖勻靜止備用。第二向：苯酚：水（80：20，重量）。配制方法：在分液漏斗中先計(jì)量加入少量無離子水，再加入一定量的新蒸餾的酚。根據(jù)酚量補(bǔ)足應(yīng)加入的全部無離子水，這樣可避免因酚的冷凝而造成的溶解困難。充分搖勻后靜止備用。（3）無離子水：用于實(shí)驗(yàn)中各種試劑配制。（4）10%異丙醇：用于配制氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液。（5）80%乙醇：取分析乙醇以無離子水稀釋。（6）0.25%的水合茚三酮溶

8、液。（7）活性炭。（8）石英砂。四、操作步驟：1、氨基酸的提取：取新鮮的綠豆芽下胚軸2克，加80%乙醇10毫升，加少量石英砂，在研缽研成勻漿，移入三角瓶，用少量80%乙醇淋洗研缽，一并移入三角瓶，加0.8克活性炭，置沸水浴中加熱至沸1分鐘，取下冷卻，用濾紙過濾，用少量80%乙醇沖洗濾渣。濾液收集在蒸發(fā)皿中置50-60水浴上蒸干。用1毫升10%異丙醇溶解，收集樣液，準(zhǔn)備點(diǎn)樣。2、濾紙的準(zhǔn)備：單向?qū)游鰹V紙：取2828厘米層析濾紙一張，在對(duì)應(yīng)的兩邊距每邊2厘米處，用鉛筆和直尺各劃一條平行于紙邊的直線，其中一條為溶劑前沿到達(dá)標(biāo)志，另一條為點(diǎn)樣線。在點(diǎn)樣線上每隔2厘米劃一與點(diǎn)樣線垂直的短線，標(biāo)出五組標(biāo)準(zhǔn)

9、氨基酸和樣品的點(diǎn)樣位置雙向?qū)游鰹V紙：取2828厘米層析濾紙二張，在距每邊2厘米處各劃一條平行于紙邊的直線，以“井”字格下邊緣直線左端交點(diǎn)為點(diǎn)樣原點(diǎn)，原點(diǎn)右手為第一向，另一垂直方向?yàn)榈诙?。用一張作?biāo)準(zhǔn)氨基酸圖譜，另一張作樣品圖譜。3、點(diǎn)樣：點(diǎn)樣時(shí)選用微量吸管或標(biāo)有刻度的毛細(xì)管（每小格1微升），分別在每個(gè)點(diǎn)樣處精確點(diǎn)樣4微升。必須在每一滴樣品干后再點(diǎn)第二滴。為使樣品加速干燥，可在有加熱裝置的點(diǎn)樣臺(tái)上進(jìn)行，或用吹風(fēng)機(jī)吹干，樣點(diǎn)的直徑以2-3毫米為宜，點(diǎn)樣時(shí)溫度不能過高，否則會(huì)破毀氨基酸。將點(diǎn)好樣品的單向和雙向?qū)游鰹V紙均卷成筒形，在上、中、下三處系三道線，但濾紙兩邊緣不能接觸。為了消除鹽酸的干擾，避

10、免拖尾現(xiàn)象，可將層析濾紙放入盛有濃氨水的層析缸中熏10分鐘，取出后在45烘箱中將氨驅(qū)凈，再行層析。4、層析：本試驗(yàn)采用上層析法。（1）單向?qū)游觯喝∵m當(dāng)大小的層析缸一個(gè)，缸底放一培養(yǎng)皿，向培養(yǎng)皿內(nèi)加入第一向溶劑，液層厚約1.5厘米，在培養(yǎng)皿上橫放兩根玻棒，取已點(diǎn)好的樣品的單向?qū)游鰹V紙以點(diǎn)樣端朝下放在盛有層析溶劑的層析缸內(nèi)的玻棒上，蓋上蓋子（濾紙切勿與溶劑接觸）。平衡一小時(shí)，然后將濾紙放入層析溶劑中，注意樣點(diǎn)不能進(jìn)入溶劑，以免浸脫。將層析缸密封，這時(shí)溶劑沿紙上升，待溶劑前沿到達(dá)標(biāo)志線時(shí)，立即取出，用吹風(fēng)機(jī)吹干或45下烘干，然后顯色。（2）雙向?qū)游觯喊瓷鲜鰡蜗驅(qū)游龇椒?，將點(diǎn)好標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的樣品的雙向?qū)?/p>

11、析濾紙分別用第一向溶劑進(jìn)行上行層析，到達(dá)前沿標(biāo)志線時(shí)，立即取出吹干溶劑，減去溶劑前沿以外的部分，然后將紙轉(zhuǎn)90角，以同樣的方法用第二向溶劑進(jìn)行上行層析，當(dāng)溶劑前沿到達(dá)標(biāo)志時(shí)立即取出吹干或45下烘干，進(jìn)行顯色。5、顯色：用噴霧器將0.25% 的茚三酮顯色劑均勻噴在層析濾紙上，注意不要噴得過多。用吹風(fēng)機(jī)吹干溶劑后，放在60-65烘箱中烘30分鐘或用吹風(fēng)機(jī)吹熱風(fēng)，即能顯現(xiàn)各種氨基酸的色斑。為了消除銨離子的影響，可在展開后在濾紙上噴1%的氫氧化鉀的無水乙醇溶液，在60下保持15分鐘，以使全部氨完全揮發(fā)掉，再行顯色。五、結(jié)果與計(jì)算：單向?qū)游觯猴@色完畢后，用鉛筆將各色譜的輪廓和中心點(diǎn)描繪出來，然后量出由原

12、點(diǎn)至色譜中心點(diǎn)和溶劑前沿的距離，計(jì)算出各種已知和未知的色譜的Rf值進(jìn)行比較和鑒定。各組已知氨基酸色譜順序由指導(dǎo)教師供給。雙向?qū)游觯篟f值有兩個(gè)數(shù)值組成，即要在第一向和第二向?qū)游鲋懈饔?jì)算一次，根據(jù)Rf并借助各種氨基酸的特有顏色，分別與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸對(duì)比，即可鑒定為何種氨基酸。六、附注：色素含量不高的植物樣品，可不用活性炭處理。實(shí)驗(yàn)二 蛋白質(zhì)含量測定（設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康奈覀儗⒅鸩礁淖儗?shí)驗(yàn)教學(xué)都由實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)，教師講解，學(xué)生照做的方法，盡量多給學(xué)生留下思考的時(shí)間和創(chuàng)新的機(jī)會(huì)。在教師指導(dǎo)下，查文獻(xiàn)、擬定實(shí)驗(yàn)方案、調(diào)試儀器、配制藥品、處理數(shù)據(jù)、研究和解決實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的問題，從失敗中獲得經(jīng)驗(yàn)，從成

13、功中獲得動(dòng)力。蛋白質(zhì)含量是農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，大豆、水稻等農(nóng)作物是農(nóng)業(yè)院校學(xué)生學(xué)習(xí)研究的最重要的生物材料。農(nóng)作物品種及各個(gè)發(fā)育時(shí)期或不同栽培條件下的生理生化指標(biāo)反映了其品種特性和生長的變化規(guī)律，掌握這些生理生化指標(biāo)測定的方法對(duì)學(xué)生今后的科研實(shí)踐是非常必要的。在以往的實(shí)驗(yàn)中，我們沒有開設(shè)這樣的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)項(xiàng)目，使學(xué)生對(duì)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)在農(nóng)業(yè)研究方向的重要地位認(rèn)識(shí)不夠。所以為了將基礎(chǔ)知識(shí)與專業(yè)技術(shù)更好地銜接，使學(xué)生將生化基本實(shí)驗(yàn)技能應(yīng)用于農(nóng)學(xué)專業(yè)的科研、管理，很有必要開設(shè)此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。1.本實(shí)驗(yàn)通過比較不同大豆(或水稻等)品種或同一品種各個(gè)發(fā)育時(shí)期或不同栽培條件下的籽粒蛋白質(zhì)含量變化，來掌握測定原理

14、，學(xué)習(xí)測定方法，并通過分析得出相應(yīng)結(jié)論。2.提高學(xué)生對(duì)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)在農(nóng)業(yè)研究方向的重要地位的認(rèn)識(shí)；使學(xué)生將生化基本實(shí)驗(yàn)技能應(yīng)用于農(nóng)學(xué)專業(yè)的未來科研工作中。二、實(shí)驗(yàn)室具備的儀器設(shè)備及化學(xué)試劑等方面的條件1.儀器：電子天平、過濾裝置、移液管、滴定裝置、可見分光光度計(jì)、紫外分光光度計(jì)、離心機(jī)、水浴鍋、溫度計(jì)、烘箱、真空抽氣機(jī)、粉碎機(jī)、電爐子、實(shí)驗(yàn)室常用玻璃器皿；2.試劑：常規(guī)化學(xué)、生物化學(xué)試驗(yàn)的試劑均有，如有特殊要求請(qǐng)說明；3.實(shí)驗(yàn)材料：大豆粉、小麥、玉米等。三、整體要求1. 要求學(xué)生認(rèn)真查文獻(xiàn)、擬定實(shí)驗(yàn)方案、調(diào)試儀器、配制藥品、處理數(shù)據(jù)、盡量獨(dú)立解決實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的問題，必要時(shí)與老師商量解決，以達(dá)

15、到鍛煉提高的目的。2.書寫報(bào)告要認(rèn)真、層次清楚、整潔、對(duì)結(jié)果有客觀分析。3.最后要有總結(jié)（自我評(píng)價(jià)），包括獨(dú)立完成實(shí)驗(yàn)的收獲、教訓(xùn)、注意事項(xiàng)、實(shí)驗(yàn)過程中遇到的問題及解決的方法等。實(shí)驗(yàn)三 酶的基本性質(zhì)酶是生物體中具有催化功能的蛋白質(zhì)，因此，也叫生物催化劑。生物體內(nèi)存在多種多樣的酶，從而使生物體在溫和的條件下能夠迅速完成復(fù)雜的代謝過程。所以了解酶的基本性質(zhì)，對(duì)于揭示各種生化進(jìn)程具有非常重要的意義。酶的高效性一、目的：通過本實(shí)驗(yàn)認(rèn)識(shí)酶的催化效率比一般催化劑高。二、原理：酶作為一種特殊的催化劑，能大大降低反應(yīng)的活化能，從而極大地加快了反應(yīng)速度。這在生理上具有極其重要的意義。在生物體內(nèi)，某些代謝由于需氧

16、脫氫的結(jié)果而產(chǎn)生對(duì)機(jī)體有毒害作用的H2O2。過氧化氫酶能催化過氧化氫很快地分解成H2O和O2，使H2O2不致在體內(nèi)大量積累。鐵粉也是過氧化氫分解的催化劑，但其催化效率僅為過氧化氫酶的100億分之一。三、實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑：1實(shí)驗(yàn)材料：馬鈴薯2儀器：（1）試管：4支；（2）管架：1個(gè)；（3）研缽；（4）量筒：10毫升13試劑：（1）2% H2O2；（2）鐵粉四、操作步驟管號(hào)項(xiàng)目12342%H2O2（ml）3333生馬鈴薯糜少許熟馬鈴薯糜少許鐵 粉少許現(xiàn) 象解釋現(xiàn)象取4支試管，編號(hào)，按上表操作。酶的特異性（專一性）一、目的1. 了解酶的特異性。2. 掌握檢查酶的特異性的方法及其原理。二、原理：酶

17、與一般催化劑最主要的區(qū)別之一是酶具有高度的特異性，即一種酶只能對(duì)一種或一類化合物起催化作用。例如：蔗糖酶只能催化蔗糖的水解，而不能催化淀粉的水解；而淀粉酶能催化淀粉水解，卻不能催化蔗糖水解。本實(shí)驗(yàn)以蔗糖酶和淀粉酶對(duì)蔗糖和淀粉的作用為例來說明酶的特異性。三、儀器和試劑：1儀器：（1）研缽 ；（2）試管：6 支；（3）試管架；（4）小燒杯；（5）刻度吸管：1毫升5，2毫升1 ；（6）漏斗；（7）電熱恒溫水浴。2試劑：（1）1% 淀粉溶液（含0.3%NaCl）：將1克可溶性淀粉及0.3克氯化鈉，混懸于5毫升蒸餾水中，攪動(dòng)后緩慢倒入沸騰的60毫升蒸餾水中，攪動(dòng)煮沸1分鐘。晾至室溫后加水至100毫升，放

18、置于冰箱貯存。（2）2% 蔗糖溶液：蔗糖是典型的非還原糖，若商品蔗糖中還原糖含量超過一定標(biāo)準(zhǔn)，則呈還原性，這種蔗糖不能使用。所以，實(shí)驗(yàn)前必須進(jìn)行檢查。本實(shí)驗(yàn)用的蔗糖至少應(yīng)是分析純的試劑，要現(xiàn)用現(xiàn)配。（3）淀粉酶液：稀釋200倍的新鮮唾液。（4）蔗糖酶液：取1克新鮮酵母放入研缽中，加少量石英砂和蒸餾水，研磨10分鐘左右，用蒸餾水稀釋至50毫升，靜止片刻再過濾，濾液即為蔗糖酶提取液。（5）本乃狄（Benedict）試劑：將17.3克硫酸銅溶解于100毫升蒸餾水中。冷卻后稀釋至150毫升。取檸檬酸鈉173克及碳酸鈉（Na2CO3H2O）100克，加水600毫升，加熱使之溶解，冷卻后，稀釋至850毫升

19、。最后把硫酸銅溶液緩緩傾入檸檬酸鈉碳酸鈉溶液中，邊加邊攪拌，如有沉淀可過濾。此試劑可長期保存。四、操作步驟：取6支試管編號(hào)，按下表操作： 編號(hào)操作項(xiàng)目1234561%淀粉（ml）1112%蔗糖（ml）111淀粉酶液（ml）11蔗糖酶液（ml）11蒸餾水（ml）11反應(yīng)搖勻，放入37水浴中保溫10分鐘木乃狄試劑（ml）222222反應(yīng)搖勻，放入沸水加熱數(shù)分鐘結(jié)果解釋實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象溫度對(duì)酶活力的影響一、目的：通過檢驗(yàn)不同溫度下淀粉酶的活性，了解溫度對(duì)酶活性的影響，并進(jìn)一步明確酶的最適溫度的概念。二、原理：酶的催化作用受溫度的影響很大。在一定溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，酶的熱變性不顯著，而酶促反應(yīng)速度增加

20、，直至達(dá)到最大值。由于酶是一種蛋白質(zhì)，溫度過高會(huì)引起酶的急劇變性，導(dǎo)致酶失活，因此，反應(yīng)速度達(dá)到最大值以后，隨著溫度的升高，反應(yīng)速度急劇下降，以至完全停止酶促反應(yīng)。反應(yīng)速度達(dá)到最大值時(shí)的溫度稱為酶作用的最適溫度。大多數(shù)動(dòng)物酶的最適溫度為3740，植物酶的最適溫度為5060。本實(shí)驗(yàn)以不同溫度條件下淀粉酶作用于淀粉，并用碘液檢查酶促淀粉水解程度，來說明溫度與酶活力的關(guān)系。三、儀器和試劑：1儀器：（1）刻度吸管：1毫升2，2毫升1；（2）試管：3支；（3）試管架；（4）恒溫水?。?個(gè)；（5）冰浴2試劑：（1）1%淀粉溶液（含0.3%NaCl）：配法如前。（2）pH7.0磷酸鹽緩沖液：配法同前。（3）

21、碘液四、操作步驟：取3支試管，按下表操作：項(xiàng)目管號(hào)淀粉酶液（ml）酶液處理5分鐘pH6.8緩沖液（ml）1淀粉液（ml）反應(yīng)條件10分鐘冷卻3分鐘碘液（滴）結(jié)果110210流動(dòng)水冷卻1213721371317021701解釋實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。酶的激活和抑制一、目的：了解酶促反應(yīng)的激活和抑制作用；學(xué)習(xí)激活劑和抑制劑影響酶促反應(yīng)的方法和原理。二、原理：酶的活力常受某些物質(zhì)的影響，有些物質(zhì)能使酶的活力增加，稱為激活劑；有些物質(zhì)能使酶的活性降低，稱為抑制劑。值得注意的是激活劑和抑制劑不是絕對(duì)的，有些物質(zhì)在低濃度時(shí)為某種酶的激活劑，而在高濃度時(shí)則為該酶的抑制劑。例如，氯化納達(dá)到1/3飽和度時(shí)就可抑制唾液淀粉酶的

22、活力。三、儀器和試劑：1儀器：（1）試管：3支；（2）試管架；（3）漏斗；（4）燒杯；（5）刻度吸管：1毫升4，5毫升1；（6）恒溫水浴；（7）10毫升1四、操作步驟：取3支試管，按下表操作 管 號(hào)項(xiàng) 目1231%NaCl（ml）1蒸餾水（ml）11%CuSO4（ml）1唾液淀粉酶（ml）111將上述各管試劑混勻0.1淀粉（ml）333保溫反應(yīng)檢驗(yàn)淀粉水解程度搖勻后放入37水浴中保溫反應(yīng)1分鐘左右，從1號(hào)試管取出1滴溶液置白瓷板上，用碘液檢查淀粉的水解程度，待試液不再變色時(shí)，取出所有試管?，F(xiàn)象解釋現(xiàn)象實(shí)驗(yàn)四 維生素C含量的測定一、目的：維生素C是人類營養(yǎng)中最重要維生素之一，缺乏時(shí)會(huì)產(chǎn)生壞血病。

23、水果、蔬菜是供給人類維生素C的主要來源。通過對(duì)維生素C含量的測定，可以了解果品質(zhì)量的高低，并掌握這一測定方法。二、原理：利用染料2,6-二氯酚靛酚作氧化劑，可將還原態(tài)的維生素C氧化成脫氫維生素C，而染料本身被還原成無色的衍生物。2,6-二氯酚淀粉在酸性條件下呈紅色。在滴定終點(diǎn)之前，滴下的2，6-二氯酚淀粉立即被還原成無色。當(dāng)溶液從無色轉(zhuǎn)變成為紅色時(shí)，即為滴定終點(diǎn)。三、實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑：1、實(shí)驗(yàn)材料：水果或蔬菜。2、儀器：（1）微量滴定管；500毫升1；（2）量瓶：50毫升2；（3）三角瓶；500毫升2；（4）研缽；（5）量筒； （6）刻度吸管；10毫升2；3、試劑：（1）1%草酸：秤取5.

24、0克草酸溶于少量蒸餾水中，定容至500毫升。（2）2%草酸：秤取10.0克草酸溶于少量蒸餾水中，定容至500毫升。（3）0.001N 2，6-二氯酚靛酚鈉溶液：稱取干燥的2，6-二氯酚靛酚鈉60毫克，放入200毫升量瓶中，加熱蒸餾水中100-150毫升，滴加0.01N NaOH4-5滴，強(qiáng)烈搖動(dòng)10分鐘冷卻后加水至刻度。搖勻后用緊密濾紙濾于棕色瓶中，貯于冰箱中備用，有效期一周。使用前需標(biāo)定（見附注）。四、操作步驟：1、樣品的處理和提?。悍Q取4.0克新鮮樣品，至研缽中，加5毫升2%草酸，研成勻漿。通過漏斗將樣品提取液轉(zhuǎn)移到50毫升量瓶中。殘?jiān)儆?%草酸提取2-3次，提取液及殘?jiān)徊⑥D(zhuǎn)入量瓶。2

25、%草酸總量為35毫升，最后以水定容。溶液定容時(shí)若泡沫較多，可加幾滴乙醇消除泡沫后再定容。搖勻，過濾，濾液備用。2、樣品的測定：吸取濾液10毫升，放入50毫升三角瓶中，立即用2,6-二氯酚靛酚鈉溶液滴定至出現(xiàn)明顯的紅色，并在15秒內(nèi)不消失為止。記錄所用滴定液體積。3、空白測定：在另一50毫升三角瓶內(nèi)，放入35毫升2%草酸，并用1%草酸定溶，搖勻，取此液10毫升放入另一50毫升三角瓶內(nèi)，用2,6-二氯酚靛酚鈉滴定至終點(diǎn)，記錄染料用量。結(jié)果與計(jì)算：X：100克樣品所含維生素C毫克數(shù)（毫克/100克）W：稱取樣品重（克）V1：滴定樣品所用染料毫升數(shù)V2：滴定空白所用染料毫升數(shù)V：樣品提取液稀釋之總體積

26、（即50毫升）K：1毫升染料液所能氧化維生素C之毫克數(shù)，可由標(biāo)定算出六、附注：（1）2,6-二氯酚靛酚鈉溶液的標(biāo)定：準(zhǔn)確稱取維生素C20毫克，用1%草酸溶解定容至200毫升。吸取此液10毫升，以1%草酸再次稀釋定容至200毫升。吸取此液10毫升，放入50毫升三角瓶中（同時(shí)吸取10毫升1%草酸于另一個(gè)50毫升三角瓶中，做空白對(duì)照立即用所要標(biāo)定的2，6-二氯酚靛酚鈉滴定至粉紅色出現(xiàn)15秒不消失，記錄所用毫升數(shù)，按下式計(jì)算K值（即1毫升染料所能氧化抗壞血酸的毫克數(shù)）。(式中：G為稱取維生素C的毫克數(shù)。V為滴定10毫升標(biāo)準(zhǔn)維生素C時(shí)所用去染料的毫升數(shù)，與滴定空白所用毫升數(shù)之差值)（2）操作要盡可能快，

27、并防止與鐵銅器具接觸，以減少維生素C的氧化。（3）草酸及樣品的提取液避免日光直射。（4）當(dāng)樣液本身帶色時(shí)，測定前于提取液中加2-3毫升二氯乙烷。在滴定過程中當(dāng)二氯乙烷由無色變粉紅色時(shí)，即達(dá)終點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)五 還原糖和總糖的測定一、目的：掌握還原糖和總糖定量測定的基本原理，學(xué)習(xí)比色定糖法的基本操作，熟悉721型分光光度計(jì)的使用方法。二、原理：各種單糖和麥芽糖是還原糖，蔗糖和淀粉是非還原糖。利用溶解度不同，可將植物樣品中的單糖、雙糖和多糖分別提取出來，再用酸水解法使沒有還原性的雙糖和多糖徹底水解成有還原性的單糖。在堿性條件下，還原糖將3,5-二硝基水楊酸還原為3-氨基-5-硝基水楊酸（棕紅色物質(zhì)），還原

28、糖則被氧化成糖酸及其它產(chǎn)物，在一定范圍內(nèi)，還原糖的量與棕紅色物質(zhì)深淺的程度呈一定的比例關(guān)系，在540nm 波長下測定棕紅色物質(zhì)的消光值，查對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算，便可分別求出樣品中還原糖和總糖的含量。多糖水解時(shí)，在單糖殘基上加了一分子水，因而在計(jì)算中須扣除已加入的水量，測定所得的總糖量乘以0.9 即為實(shí)際的總糖量。三、實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑1、實(shí)驗(yàn)材料：面粉。2、儀器： (1) 25ml 血糖管或刻度試管11；(2) 大離心管或玻璃漏斗2；(3) 燒杯：100ml1；(4) 三角瓶：100ml1；(5) 容量瓶：100ml3；(6) 刻度吸管：1ml11、2ml4、10ml1；(7) 恒溫水?。?8)

29、 沸水浴；(9) 離心機(jī)(過濾法不用此設(shè)備)；(10)電子天平；(11)分光光度計(jì)；3、試劑：(1) 1mg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱取 100 mg分析純葡萄糖(預(yù)先在 80 烘至衡重)，置于小燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，定量轉(zhuǎn)移至100ml的容量瓶中，以蒸餾水定容至刻度，搖勻，冰箱中保存?zhèn)溆谩?2) 3,5-二硝基水楊酸試劑：將6.3g 3,5-二硝基水楊酸和262ml 2NNaOH 溶液，加到500ml含有185g酒石酸甲鈉的熱水溶液中，再加5g結(jié)晶酚和5g亞硫酸鈉，攪拌溶解。冷卻后加蒸餾水定容至1000ml，貯于棕色瓶中備用。(3) 碘-碘化鉀溶液：稱取5g碘和10g碘化鉀，溶于100

30、ml 蒸餾水中。(4) 酚酞指示劑：稱取0.1g酚酞，溶于250ml 70%乙醇中。(5) 6NHCl(6) 6NNaOH四、操作步驟1、制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：取7支具有25ml刻度的血糖管或試管，編號(hào)，按下表所示的量，精確加入濃度為1mg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和3,5-二硝基水楊酸試劑。數(shù)量 管號(hào)項(xiàng)目0123456葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（ml）00.20.40.60.81.01.2蒸餾水（ml）2.01.81.61.41.21.00.83,5-二硝基水楊酸試劑（ml）1.51.51.51.51.51.51.5將各管搖勻，在沸水浴中加熱5分鐘，取出后立即放入盛有冷水的燒杯中冷卻至室溫，再以蒸餾水定容至25

31、ml刻度處，用橡皮塞塞住管口，顛倒混勻（如用大試管，則向每管加入21.5ml蒸餾水，混勻）。在540nm波長下，用0號(hào)管調(diào)零，分別讀取1-6號(hào)管的消光值。以消光值為縱坐標(biāo)，葡萄糖毫克數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、樣品中還原糖和總糖的測定：（1）樣品中還原糖的提?。簻?zhǔn)確稱取2g食用面粉，放在100ml的燒杯中，先以少量的蒸餾水調(diào)成糊狀，然后加50ml蒸餾水，攪勻，置于50恒溫水浴中保溫20分鐘，使還原糖浸出。離心或過濾，用20ml蒸餾水洗殘?jiān)?，再離心或過濾，將兩次離心的上清液或?yàn)V液全部收集在100ml的容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，混勻，作為還原糖待測液。(2)樣品中非還原糖的水解和提?。簻?zhǔn)確稱

32、取1 g食用面粉，放在100ml 的三角瓶中，加入10 ml 6NHCl及15ml 蒸餾水，置于沸水浴中加熱水解30分鐘。取12 滴水解液于白瓷板上，加1滴碘-碘化鉀溶液，檢查水解是否完全。如已水解完全，則不顯藍(lán)色。待三角瓶中的水解液冷卻后，加入一滴酚酞指示劑，以6NNaOH中和至微紅，過濾，再用少量蒸餾水沖洗三角瓶及濾紙，將濾液全部收集在100ml的容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，混勻。精確吸取10ml定容過的水解液，移至另一100ml的容量瓶中，定容，混勻，作為總糖待測液。(3)顯色和比色：取5支25ml刻度的血糖或刻度試管，編號(hào)，按下表所示的量，精確加入待測液和試劑。數(shù)量 管號(hào)項(xiàng)目還原糖測

33、定管號(hào)總糖測定管號(hào)還原糖待測液（ml）22000總糖待測液（ml）00110蒸餾水（ml）001123,5-二硝基水楊酸試劑（ml）1.51.51.51.51.5加完試劑后，其余操作均與葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線是相同，測定各管消光值。五、結(jié)果與計(jì)算：以管、的消光值平均值和管、的消光值的平均值，分別在標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的還原糖毫克數(shù)。按下式計(jì)算出樣品中還原糖和總糖的百分含量。六、附注：1、用血糖管比大試管方便。2、離心比過濾易得清液。3、標(biāo)準(zhǔn)曲線制作與樣品含糖量測定應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，一起顯色和比色。實(shí)驗(yàn)六 淀粉酶活性的測定一、目的：植物中的淀粉酶能將貯藏的淀粉水解成麥芽糖。淀粉酶幾乎存在于所有植物中，其中以禾谷類

34、種子的淀粉酶活性最強(qiáng)。植物中有-淀粉酶及-淀粉酶，其活性因植物的生長發(fā)育時(shí)期不同而有所變化。本實(shí)驗(yàn)的目的在于掌握分別測定這兩種淀粉酶的方法。二、原理：-淀粉酶及-淀粉酶，各有其一定的特性，如-淀粉酶不耐熱，在高溫下易鈍化而-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下則發(fā)生鈍化，通常提取液同時(shí)有兩種淀粉酶存在，測定時(shí)，可根據(jù)它們的特性分別加以處理，鈍化其中之一，即可測出另一酶的活性。將提取液加熱到70維持15分鐘以鈍化-淀粉酶，便可測定-淀粉酶的活性?；蛘邔⑻崛∫河胮H3.6之醋酸在0加以處理，鈍化-淀粉酶的活性，以測出-淀粉酶的活性。淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖，可用3，5-二硝基水楊酸試劑測定。由于麥芽糖

35、能將后者還原生成3-氨基-5-硝基水楊酸的顯色基團(tuán)，在一定范圍內(nèi)其顏色的深淺與糖的深度成正比，故可求出麥芽糖的含量，以麥芽糖的毫克數(shù)表示淀粉酶活性的大小。三、實(shí)驗(yàn)材料儀器及試劑：1、實(shí)驗(yàn)材料：萌發(fā)的小麥（芽長1厘米左右）2、儀器：（1）小臺(tái)秤；（2）研缽；（3）容量瓶：100毫升1；（4）具塞刻度試管25毫升13；（5） 試管：8支；（6）刻度吸管：1毫升2，2毫升2；（7）離心機(jī)；（8） 恒溫水浴； （9）分光光度計(jì)。3、試劑：（1）1%淀粉溶液；（2）0.4 N NaOH；（3）pH5.6的檸檬酸緩沖液：A、稱取檸檬酸20.01克，溶解后稀釋至1升；B、稱取檸檬酸鈉29.41克，溶解后稀釋

36、至1升。取A液13.7毫升與B液26.3毫升混勻，即為pH5.6之緩沖液。（4）3,5-二硝基水楊酸：精確稱取3,5-二硝基水楊酸1克溶于20毫升1N氫氧化鈉中，加入50毫升蒸餾水，再加入30克酒石酸鈉，待溶解后，用蒸餾水稀釋至100毫升，蓋緊瓶塞，勿使二氧化碳進(jìn)入。（5）麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液：稱取麥芽糖0.100克溶于少量蒸餾水中，仔細(xì)移入100毫升容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度。四、操作步驟：1、酶液的提?。悍Q取2克萌發(fā)的小麥種子（芽長1厘米左右），至研缽中加一克石英砂，磨成勻漿倒入25毫升具塞刻度試管中，用蒸餾水稀釋至刻度，混勻后在室溫（20）下放置，每隔數(shù)分鐘震蕩一次，放置15-20分鐘，離心，

37、取上清液備用。2、-淀粉酶活性的測定：（1）取試管4支，注明兩支為測定管。（2）于每管中各加酶提取液1毫升，在70恒溫水浴中（水溫度的變化不應(yīng)超過0.5）準(zhǔn)確加熱15分鐘，在此期間-淀粉酶受熱而鈍化，取出后迅速在自來水中冷卻。（3）在試管中各加入1毫升pH5.6檸檬酸緩沖液。（4）向?qū)φ展苤屑尤?毫升0.4N氫氧化鈉，以鈍化酶的活性。（5）將測定管和對(duì)照管置40（0.5）恒溫水浴中保溫15分鐘，再向各管分別加入40下預(yù)熱的淀粉溶液2毫升，搖勻，立即放入40水浴中準(zhǔn)確保溫5分鐘后取出，向各測定管迅速加入4毫升0.4N氫氧化鈉，以終止酶的活動(dòng)，然后準(zhǔn)備下步糖的測定。3、-淀粉酶及-淀粉酶總活性的測

38、定：取上述酶液2-6毫升，放入容量瓶中，用蒸餾水稀釋至100毫升（稀釋程度視酶活性大小而定）混合均勻后，取4支試管，各加入稀釋之酶液1毫升及1毫升pH5.6之檸檬酸緩沖液。以下步驟重復(fù)-淀粉酶的第（4）及（5）的操作，同樣準(zhǔn)備糖的測定。4、麥芽糖的測定：（1）取25毫升刻度試管7個(gè)，編號(hào)，分別加入麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液（1毫克/毫升）0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.0毫升，置沸水浴中準(zhǔn)確煮沸5分鐘，取出冷卻，用蒸餾水稀釋至25毫升，用分光光度計(jì)在520nm波長下進(jìn)行比色，記錄消光值，以消光值為縱坐標(biāo)，以麥芽糖含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）樣品的測定：取以上各管中酶作用后的溶液及對(duì)照管中

39、的溶液各2毫升，分別放入25毫升具塞刻度試管中，再加入2毫升3,5-二硝基水楊酸試劑，混勻，置沸水中準(zhǔn)確煮沸5分鐘，取出冷卻，用蒸餾水稀釋至25毫升，混勻。用分光光度計(jì)在520nm波長下進(jìn)行比色，記錄消光值，從麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出麥芽糖含量，然后進(jìn)行結(jié)果計(jì)算。五、結(jié)果計(jì)算： A -淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖（在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得值）A -淀粉酶的對(duì)照管中麥芽糖量B （+）- 淀粉酶共同水解淀粉生成的麥芽糖量B （+）- 淀粉酶的對(duì)照管中麥芽糖量C 比色時(shí)所用樣品液毫升數(shù)實(shí)驗(yàn)七 脂肪浸提索氏脂肪浸提法一、目的：學(xué)習(xí)和掌握粗脂肪提取的原理和測定方法。二、原理：用脂肪溶劑將脂肪從樣品中浸提出來，然后將溶

40、劑蒸發(fā)除去，稱取瓶中殘留物的重量或稱量樣品損失的重量，即可求出樣品中粗脂肪的含量。在測定樣品含油量時(shí)，通常采用沸點(diǎn)低于60的有機(jī)溶劑作為脂肪溶劑 (如乙醚和沸點(diǎn)為30至60的石油醚)所提取的脂溶性物質(zhì)為脂類物質(zhì)的混合物，其中含有脂肪、游離脂肪酸、磷脂、酯、固醇、芳香油、某些色素及有機(jī)酸等，因此稱為粗脂肪。三、實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑：1、實(shí)驗(yàn)材料：（1）待測植物樣品；（2）濾紙筒。2、儀 器：（1）蘭氏脂肪浸提儀；（2）電熱恒溫水??；（3）分析天平。3、試 劑：（1）乙醚。四、操作步驟：1、儀器的安裝：將索氏脂肪浸提取儀的冷凝管及脂肪接受瓶的磨砂玻璃接口處用鉛筆編號(hào)，洗凈烘干。脂肪接受瓶放入干燥器

41、內(nèi)冷卻后稱取空瓶質(zhì)量，仍放回干燥器內(nèi)備用。將冷凝器用鐵駕臺(tái)卡夾安裝在加熱用的電熱恒溫水浴上，裝牢。在冷凝器的進(jìn)出水口分別裝上橡膠管，通向冷凝器內(nèi)蛇型管的短管為進(jìn)水口，通向外層的短管為出水口。2、樣品的稱?。喝V紙筒（2570毫米）截成35毫米的長度，用鉛筆編號(hào)，兩邊對(duì)稱的夾上一個(gè)回形針，留出一段鐵環(huán)作掛鉤用。在分析天平上稱取空濾紙筒的重量，加入經(jīng) 1 毫米篩孔制備的樣品2 3克，稱準(zhǔn)其重量，再向?yàn)V紙筒塞入脫脂棉一小塊，防止樣品散失，將已加入樣品的濾紙筒放在一個(gè)小燒杯內(nèi)，然后放入90的真空干燥烘箱內(nèi)烘56 小時(shí)，取出放入干燥器內(nèi)冷卻備用。3、脂肪的浸提：將濾紙筒掛在冷凝器內(nèi)固定在桿下端的鉤子上，

42、再將脂肪瓶加入無水乙醚70毫升，套在冷凝器下面的磨口上。把裝好冷凝器的脂肪瓶放在預(yù)先調(diào)好溫度（50-60）的電熱水浴上。松開固定桿上的止水夾，將濾紙筒浸入乙醚內(nèi)，開放冷凝水閥門，注意乙醚煮沸的情況，要求回流速度適當(dāng)，不可太快，以免冷凝不及乙醚在冷凝器上部逸失。濾紙筒內(nèi)樣品經(jīng)熱沸的乙醚浸提20分鐘后，提起濾紙筒操作桿至最高位置，冷凝后的乙醚自溢流管流入，裝滿濾紙筒，使之淋洗濾紙筒上部的筒壁，然后從乙醚逐步回收管回收乙醚，直至脂肪接受瓶中的乙醚完全蒸發(fā)干為止。關(guān)閉電源，關(guān)上冷凝水的閥門。4、脂肪瓶的干燥和濾紙筒乙醚的回收：脫下脂肪瓶，用綢布擦去手摸的痕跡及沾上的塵土，放入90的直空干燥箱內(nèi)烘45-

43、60分鐘后取出放入干燥器內(nèi)，冷卻半個(gè)小時(shí)后稱重。濾紙筒脫離掛鉤后立即放入一個(gè)空的脂肪瓶內(nèi)，一個(gè)脂肪瓶可以同時(shí)放入4-8個(gè)，套上冷卻器，開放冷卻水，打開水浴電源回收乙醚。五、計(jì)算結(jié)果：六、附注：乙醚易燃，操作時(shí)應(yīng)特別注意，加乙醚時(shí)不要打開電門，脂肪瓶與冷凝器的結(jié)合必須吻合，不能漏氣，脂肪浸提儀附近不能有明火閃動(dòng)。乙醚試劑瓶應(yīng)遠(yuǎn)離加熱器。實(shí)驗(yàn)八 一種簡單實(shí)用的提取植物DNA的方法一、目的與原理：植物DNA的提取是植物分子生物學(xué)和基因工程研究的一種基本的技術(shù)，至今已有了數(shù)種方法。此方法最大的特點(diǎn)是：將SDS同時(shí)用作細(xì)胞膜的去污劑和蛋白質(zhì)的變性劑，變性的蛋白質(zhì)通過離心而不是酚抽提除去，使得整個(gè)操作過程

44、變得簡單快捷，比較溫和，1小時(shí)左右就可以獲得純化的植物DNA。用這種方法得到的DNA能直接被限制性內(nèi)切酶酶解，純度較高，適用于分子生物學(xué)的研究。本實(shí)驗(yàn)的目的是掌握DNA提取的原理和方法。二、材料與方法：1、植物材料：螺旋藻（Spirulina platensis）、水稻（Oryza sativa）和煙草（Nicotianatabacum）.2、試劑和溶液：（1）20SSC：3molL-1檸檬酸鈉，pH8.0：（2）溶菌酶、10gl-1Rnase、10%SDS（均為Sigma產(chǎn)品）；（3）酚：氯仿：異戊醇=25：24：1（4）TE：10mmolL-1Tris-HCL、1mmolL-1EDTA，p

45、H7.6。3、提取步驟：收集對(duì)數(shù)生長期的螺旋藻細(xì)胞，懸浮于5倍體積（v/w）含2mgmL-1溶菌酶的20SSC中，室溫保持10分鐘，偶爾搖動(dòng)混勻。水稻幼苗和煙草嫩葉在液氮中研磨成粉狀后，立即用5倍體積的20SSC懸浮，并輕輕拌勻。上述懸浮液在冰上先放置3分鐘，然后加入10% SDS至終濃度為2%，混勻；繼續(xù)放置10分鐘后，在4用11000g離心15分鐘。上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，并用相同體積的TE稀釋，再加入RNase至終濃度為10gml-1，室溫放置30分鐘。11000g離心15分鐘，所得的DNA沉淀用70%的乙醇洗兩次后，真空中抽干或自然干燥，最后溶于適量的TE中。三、結(jié)果與討論：利用本方

46、法，從煙草、水稻和螺旋藻中提取了DNA。因?yàn)檎麄€(gè)過程的操作步驟較少，也較溫和，減少了DNA被弄斷的機(jī)會(huì)，所以所得的DNA分子量較大，大部分都比完整的噬菌體的DNA（48.5Kb）還大。另外，用此方法所提的DNA的OD260/OD280的比值1.8至1.9之間，并能被限制性內(nèi)切酶酶切，顯示有較好的純度。在使用本方法時(shí)，須注意下面的幾個(gè)問題。當(dāng)20SSC的懸浮液中加入SDS至2%后，溶液中會(huì)出現(xiàn)白色絮狀物質(zhì)，表明蛋白質(zhì)已經(jīng)變性，這是本方法的主要特點(diǎn)之一。它通過變性后離心而不是常用的多次酚抽方法，將絕大部分的蛋白質(zhì)除去。離心所得的上清液，需要用TE稀釋，這是因?yàn)槿芤褐械柠}濃度較高，如不稀釋，RNas

47、e就無法起作用；而且在沉淀DNA時(shí)，如用乙醇會(huì)將溶液中的鹽析出，如用異戊醇則形成兩相的界面，將溶液中鹽的濃度降低后，就解決了這些問題。但是，加大稀釋TE的體積，對(duì)于DNA的產(chǎn)量并無非常明顯的作用，用等體積的TE稀釋即可。DNA抽提液經(jīng)RNase酶解后，再用酚：氯仿：異戊醇抽提一次，用以除去剩余的蛋白質(zhì)和酶。本方法適用于大量和微量的DNA制備。大量制備時(shí)，RNase酶解和酚：氯仿：異戊醇的抽提步驟可以在DNA濃縮一些后再使用，這樣就較便于操作，并且節(jié)省RNase和酚。通常，用這種方法能從每克新鮮組織中提取到10至15g的DNA。實(shí)驗(yàn)九 聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定大麥、小麥種子純度一、目的：本實(shí)驗(yàn)采

48、用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，提取分離種子中的蛋白質(zhì)，根據(jù)不同品種的蛋白質(zhì)譜帶與標(biāo)準(zhǔn)譜帶的差異，可鑒定出品種的真實(shí)性和純度。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖钦莆站郾０冯娪镜脑?、?shí)驗(yàn)方法以及此方法在種子鑒定中的應(yīng)用。二、原理：從種子中提取的醇溶蛋白在凝膠的分子篩效應(yīng)和電泳分離的電荷效應(yīng)作用下得到良好的分離，通過顯色顯示蛋白質(zhì)譜帶類型。不同品種由于遺傳組成不同，種子內(nèi)所含的蛋白質(zhì)種類有差異，這種差異可利用電泳圖譜加以鑒別，從而對(duì)品種真實(shí)性和純度進(jìn)行鑒定。三、儀器和試劑：1、儀器：電泳儀（滿足穩(wěn)壓500V）、離心機(jī)、垂直板電泳槽、鉗子、5ml、10ml移液管、微量進(jìn)樣器、聚丙烯離心管。2、試劑：尿素，乙醇，甘氨酸，甲

49、基綠，三氯乙酸，冰乙酸，過氧化氫，硫酸亞鐵，抗壞血酸，-氯乙醇。3、藥劑配制：（1）蛋白質(zhì)提取液：小麥：0.05克甲基綠溶于25毫升-氯乙醇中，加蒸溜水至100毫升。低溫保存。大麥：0.05克甲基綠溶于20毫升-氯乙醇中，加入118克尿素，再加入1毫升-巰基乙醇，加蒸溜水至100毫升。低溫保存。（2）電泳緩沖液：0.4克甘氨酸加蒸溜水溶解，加4毫升冰乙酸，定容至1000毫升。低溫保存。（3）凝膠緩沖液：1.0克甘氨酸加蒸溜水溶解，加20毫升冰乙酸，定容至1000毫升。低溫保存。（4）0.6%過氧化氫：30%過氧化氫2毫升，加蒸溜水至100毫升。低溫保存。（5）染色液：0.25克考馬斯亮藍(lán)加25

50、毫升無水乙醇溶解，加入50克三氯乙酸，加水至500毫升。（6）凝膠液：丙烯酰胺20克，甲叉雙丙烯酰胺0.8克，尿素12克，硫酸亞鐵0.01克，抗壞血酸0.2克，用凝膠緩沖液溶解并定容至200毫升。低溫保存。四、實(shí)驗(yàn)步驟：1、樣品提取：一般每個(gè)樣品測定100粒種子，若更準(zhǔn)確地估測品種純度，則需更多的種子。如果分析結(jié)果要與某一純度的標(biāo)準(zhǔn)值比較，可采用順次測定法（sepuential testing）來確定，即50粒作為一組，必要時(shí)刻連續(xù)測定數(shù)組，以減少工作量。如果只鑒定真實(shí)性，可用50粒。取小麥或大麥種子，用鉗子逐粒夾碎（夾種子時(shí)最好墊上小片清潔的紙，以便于清理鉗頭和防止樣品之間的污染），置1.5

51、毫升離心管中，加入蛋白質(zhì)提取液（小麥0.2毫升，大麥0.3毫升）充分搖動(dòng)混合，在室溫下提取24小時(shí)，然后在18000g條件下離心15分鐘。取其上清液用于電泳。2、凝膠制備：從冰箱中取出凝膠溶液和過氧化氫液，吸取10毫升凝膠溶液，加1滴0.6%過氧化氫，搖勻后迅速倒入封口處，稍加搖動(dòng)，使整條縫口充滿膠液，讓其在5-10分鐘聚合封好。吸取45毫升凝膠溶液，加3滴0.6%過氧化氫，迅速搖勻，倒入凝膠板之間，馬上插好樣品梳，讓其在5-10分鐘內(nèi)聚合。3、進(jìn)樣：小心抽出樣品梳，將玻璃板加在電泳槽上，用濾紙或注射器吸取樣品槽中多余的水分，然后用微量進(jìn)樣器吸取10-20l樣品加入樣品槽中。4、電泳：在前后槽

52、注入電極液，前槽接正極，后槽接負(fù)極。然后打開電源，逐漸將電壓增到500V電泳時(shí)，要求在15-20溫度下進(jìn)行。電泳時(shí)間一般為60-80分鐘，具體時(shí)間可按甲基綠遷移時(shí)間來推算，電泳時(shí)間為甲基綠移至前沿所需時(shí)間的2-2.5倍。5、染色：將膠板小心的取下，在染色液中染色1-2天。一般情況不需要脫色，但為使譜帶清晰，可用清水沖洗。五、鑒定：譜帶命名可采用相對(duì)遷移率法，或電泳程式法。根據(jù)醇溶蛋白譜帶的組成和帶型的一致性，并與標(biāo)準(zhǔn)樣品電泳圖譜比較，堅(jiān)定種子真實(shí)性以及測定品種純度。實(shí)驗(yàn)十 淀粉酶的誘導(dǎo)、提取和活性測定（綜合性實(shí)驗(yàn)）一、實(shí)驗(yàn)原理大麥（或小麥）種子萌發(fā)時(shí)，種胚產(chǎn)生GA3擴(kuò)散到胚乳的糊粉層細(xì)胞（被稱

53、為GA3反應(yīng)的“靶細(xì)胞”），刺激其合成或激活-淀粉酶，然后進(jìn)入胚乳，使貯藏的淀粉被水解為還原酶，因此，無胚種子不能釋放GA3，也不能形成與激活-淀粉酶。外加的GA3也可代替胚的釋放作用，從而誘導(dǎo)-淀粉酶的合成。在一定范圍內(nèi)，由去胚的吸脹大麥產(chǎn)生的還原糖量，與外加GA3濃度的對(duì)數(shù)成正比，由此可說明GA3對(duì)-淀粉酶的誘導(dǎo)形成。二、材料與用品1、材料：大麥（或小麥）種子；2、儀器：721分光光度計(jì)；超凈工作臺(tái)（或滅菌箱）；溫箱；搖床；恒溫水??；高壓滅菌鍋；棉塞；牛皮紙；刀片；鑷子；燒杯；培養(yǎng)皿；試管；移液管；玻璃棒。3、藥品：10-3mol/L乙酸緩沖液（pH 4.8）每ml含鏈霉素硫酸鹽1mg（或氯霉素40g）、10 mg/L GA310 mg，加少量95%乙醇溶解，用蒸餾水定容至1000ml、淀粉溶液（稱取可溶性淀粉0.67g和KH2PO40.82g溶于20 ml蒸餾水中不斷攪拌下加到70ml沸水中，最后加水定容至100ml）、I2- KI溶液（稱取I2 0.06g和KI 0.6g，溶于0.05mol/L HCL溶液1000ml中）、5%漂白粉溶液（W/V）、5% H2SO4溶液（W/V）、滅菌水、石英砂。三、方法與步驟1、材料準(zhǔn)備選擇對(duì)GA3敏感、萌發(fā)高、大小一致的小麥種子，用5