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文檔簡介
1、hoechst染色:hoechst可以穿過活細(xì)胞膜與細(xì)胞核結(jié)合 (主要為凋亡活細(xì)胞)在紫外光下將核染為藍(lán)色. hoechst染細(xì)胞核會(huì)影響共聚焦顯微鏡對(duì)該樣本其他熒光的觀察效果.hoechst有hoechest33342和hoechst33258兩種 hoechsts33258,hoechst33342二者區(qū)別不大,但是hoechst33342對(duì)細(xì)胞的毒性作用更小一些,所以一般來說hoechsts33258用于細(xì)胞固定后再染色,而hoechst33342則可以對(duì)活細(xì)胞直接進(jìn)行染色!染色步驟pi (propidium iodide碘化丙啶)染色: 是一種可對(duì)dna染色的細(xì)胞核染色試劑,常用于細(xì)胞
2、凋亡檢測. 碘化丙啶(propidium iodide, pi)是一種核酸染料(紅色),它不能透過完整的細(xì)胞膜,但凋亡中晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞由于細(xì)胞膜通透性的增加,pi 能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅.用pi單一染色觀測培養(yǎng)細(xì)胞,只能表示細(xì)胞的壞死情況,而不是凋亡(當(dāng)然晚期凋亡pi亦可著色)。但是如果您只是想知道細(xì)胞的死亡情況,而不是仔細(xì)區(qū)分壞死或凋亡,那么pi單一染色也可以。但是如果您一定要認(rèn)定細(xì)胞的凋亡,那么pi單一染色顯然不夠!annexin-v染色細(xì)胞凋亡早期,細(xì)胞膜標(biāo)志發(fā)生改變.其中,磷脂酰絲氨酸(annexin-v,ps)外翻 ,annexin-v 在ca+存在的條件下與其高親和力特
3、異性結(jié)合.這樣,annexin-v 染色陽性,表示細(xì)胞處于早期凋亡狀態(tài).annexin-v結(jié)合不同的熒光抗體,就可以利用流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡以及共聚焦激光掃描顯微鏡檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。annexin v用fitc標(biāo)記發(fā)綠色熒光;如果用pe標(biāo)記就發(fā)紅色熒光。jc-1染色 jc-1是一種陽離子染料,可以在線粒體內(nèi)聚集,低濃度時(shí)主要以單體(monomer)存在,發(fā)射光以綠光(525nm)為主;而在高濃度時(shí)則可以形成多聚體(aggregation),發(fā)射光以紅光(-590nm)為主。線粒體本身存在一定的極性(polarization),其外膜為負(fù)極,內(nèi)膜為正極。電位差由ca2+、na+和h+流調(diào)控。
4、當(dāng)線粒體狀態(tài)良好時(shí)對(duì)jc-l攝取量少,因而在線粒體內(nèi)主要以單體的形式存在綠光強(qiáng)度/紅光強(qiáng)度的比值較高。在線粒體發(fā)生去極化(depolarization)時(shí),線粒內(nèi)jc-l的濃度較高,多以多聚體的形式存在,綠光強(qiáng)度/紅光強(qiáng)度的比值降低。jc-1染色的綠光強(qiáng)度/紅光強(qiáng)度僅取決于線粒體的膜電勢(membrane potential),而與線粒體的形態(tài)、體積和密度都無關(guān),因而能更好地反映線粒體的功能狀態(tài)。由于凋亡發(fā)生的早期存在線粒體的去極性,因此,jc-1染色被用于檢測凋亡的早期發(fā)生。其實(shí)驗(yàn)方法如下。jc-l染色非常簡單。首先可將成品jc-1以dmso配成儲(chǔ)存液(15mg/ml),儲(chǔ)存于-20,用時(shí)以
5、培養(yǎng)液稀釋至10ug/ml終濃度。對(duì)貼壁細(xì)胞可以直接棄去培養(yǎng)液,漂洗細(xì)胞后直接加入染色液,10-30min后在熒光顯微鏡下或者激光共聚焦下觀察。線粒體狀態(tài)好時(shí)細(xì)胞以綠色為主,當(dāng)紅光信號(hào)增強(qiáng)時(shí),紅綠相疊,以橙色為主。該染色運(yùn)用于懸浮細(xì)胞時(shí)還可以通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測,收集紅/綠信號(hào)強(qiáng)度,計(jì)算其強(qiáng)度比。 鈣黃綠素-am(calcein-am):calcein -am本身并不是熒光分子,但通過活細(xì)胞內(nèi)的酯酶作用,calcein -am能脫去am基,產(chǎn)生的calcein能發(fā)出強(qiáng)綠色熒光(激發(fā):490 nm,發(fā)射:515 nm)。因此calcein -am僅對(duì)活細(xì)胞染色細(xì)胞活力鑒定臺(tái)盼藍(lán)染色法原理:細(xì)胞
6、損傷或死亡時(shí),臺(tái)盼藍(lán)可穿透變性的細(xì)胞膜,與解體的dna 結(jié)合,使其著色。而活細(xì)胞能阻止染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。故可以鑒別死細(xì)胞與活細(xì)胞。用品:1. 4%臺(tái)盼藍(lán)母液:稱取4g臺(tái)盼藍(lán),加少量蒸餾水研磨,加雙蒸水至100ml,用濾紙過濾,4度保存。使用時(shí)。用pbs稀釋至0.4%。2. 吸管、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、顯微鏡步驟:1、制備單細(xì)胞懸液。并作適當(dāng)稀釋(106 細(xì)胞/ml)2、染色:細(xì)胞懸液與0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液以9:1混合混勻。3、計(jì)數(shù):在三分鐘內(nèi),用計(jì)數(shù)板分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞結(jié)果統(tǒng)計(jì):鏡下觀察,死細(xì)胞被染成淡藍(lán)色,而活細(xì)胞拒染。根據(jù)下式求細(xì)胞活力:活細(xì)胞率(%)= 活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))10
7、0注意事項(xiàng):臺(tái)盼藍(lán)染細(xì)胞時(shí),時(shí)間不宜過長。否則,部分活細(xì)胞也會(huì)著色,會(huì)干擾計(jì)數(shù)。臺(tái)盼藍(lán)染色原理通常認(rèn)為細(xì)胞膜喪失完整性,細(xì)胞即可被認(rèn)為已經(jīng)死亡。臺(tái)盼藍(lán)(trypan blue)是檢測細(xì)胞膜完整性最常用的生物染色試劑。健康的正常細(xì)胞能夠排斥臺(tái)盼藍(lán),而死亡的細(xì)胞,膜的完整性喪失,通透性增加,細(xì)胞可被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色。依據(jù)此原理,細(xì)胞經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色后,可通過顯微鏡,直接鏡下計(jì)數(shù)或拍照后計(jì)數(shù),實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞存活率比較精確的定量分析。試述臺(tái)盼藍(lán)染發(fā)鑒別死活細(xì)胞的原理,試分析染色時(shí)間過長本來是活細(xì)胞也被染色的原因 死細(xì)胞的細(xì)胞膜無屏障作用,臺(tái)盼藍(lán)馬上進(jìn)入細(xì)胞而顯藍(lán)色?;罴?xì)胞細(xì)胞膜有選擇透性,對(duì)臺(tái)盼藍(lán)的透性小,進(jìn)入細(xì)胞慢。若染色時(shí)間過長,臺(tái)盼藍(lán)可能通過胞吞或胞飲作用進(jìn)入細(xì)胞。方法 特點(diǎn) 染細(xì)胞類型染色部位激發(fā)光顏色意義hoechst染色活細(xì)胞(主要是早期凋亡細(xì)胞)細(xì)胞核紫外激發(fā)核染藍(lán)色檢測早期凋亡pi染色壞死細(xì)胞或凋亡晚期細(xì)胞細(xì)胞核綠光激發(fā)!核染紅色檢測死細(xì)胞或凋亡晚期細(xì)胞an
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