血紅蛋白電泳的意義和判斷

1、ADULT AND NEWBORN Hemoglobin screening with capillarys,2,目的,血紅蛋白結(jié)構(gòu)和功能的回顧 Sebia CAPILLARYS 2 / Minicap血紅蛋白檢測說明 血紅蛋白臨床結(jié)果說明,3,血紅蛋白的結(jié)構(gòu),血紅蛋白分子是由4條多肽鏈(2對)和4個可以結(jié)合鐵和氧氣的血紅素.,Normal hemoglobins, contain alpha, beta, delta, and gamma globin chains.,三維結(jié)構(gòu),4 亞單位 2 alpha鏈 2 alpha genes 3 非 alpha鏈 : beta, delta, ga

2、mma 1 b gene , 1 d gene , 2 g genes,正常結(jié)果,Hb A: a2b2,Hb F: a2g2,Hb A2:a2d2,+,-,瓊脂糖凝膠 Hydrasys (Sebia) 堿性緩沖液,成人,新生兒,血紅蛋白遺傳病類型(HEMOGLOBINOPATHIES) ?,血紅蛋白疾病 血紅蛋白性質(zhì)變化 : 血紅蛋白分子病 結(jié)構(gòu)異常, 一個或數(shù)個氨基酸變異或缺失, 都將會導致血紅蛋白分子的電性發(fā)生改變 常見血紅蛋白變異體 b-globin : S C DPunjab E 血紅蛋白含量變化 : 地中海貧血 合成或合成調(diào)控異常 : b globin b Thalassemias

3、a globin a Thalassemias 合并型 : 血紅蛋白分子病Hemoglobinopathies /地貧 Thalassemias,血紅蛋白遺傳病,遺傳性疾病基因?qū)W圖譜,正常基因,異?；?異常血紅蛋白類型,目前, 已經(jīng)證實的有超過1000 種以上的變異體(a, b, g and d) 大部分變異體出現(xiàn)頻率較低, 并且沒有明顯臨床癥狀 4種主要變異體 (Hb S, Hb C, Hb E and Hb DPunjab)出現(xiàn)頻率較高 ( 特定人群) 攜帶者會出現(xiàn)健康問題 兒童可能在出生時即伴隨有嚴重癥狀,血紅蛋白疾病的區(qū)域分布圖,Thalassemias,常見與地中海區(qū)域: 意大利,

4、 西班牙,希臘, 近東地區(qū), 非洲北部. 同樣常見于東南亞 : 泰國,印度, 越南,中國, 印尼. 臨床癥狀 * Beta 地貧重癥型 - 嚴重貧血 (需要長期輸血治療) * Beta 地貧中間型 * Beta 地貧輕微型 - 無臨床癥狀,Beta 地中海貧血,常見區(qū)域,bo 沒有Beta鏈合成 b+ 合成能力下降,Alpha 地中海貧血,臨床癥狀: 根據(jù)Alpha基因的表達狀態(tài), 有4個不同程度的Alpha地貧癥狀 * 1 個基因表達沉默: 靜止型 (非常難檢測到, 在出生會測到Hb Barts 1-2% ) * 2 個基因表達沉默: 輕型alpha地貧,在出生會測到Barts 2-10%

5、* 3 個基因表達沉默: 血紅蛋白Hb H病, 出生時出現(xiàn)2-30% Barts, 兒童-成人出現(xiàn) 10-15% Hb H * 4 個基因表達沉默: Hb Barts胎兒水腫綜合征 (死胎),常見區(qū)域 常見與遠東地區(qū),非洲和地中海區(qū)國家,鐮刀型紅細胞血癥,變異體出現(xiàn)在 6 GAG (谷氨酸) GTG (纈氨酸),C型血紅蛋白分子病,變異體位置:AA 6: GAG (谷氨酸) AAG (Lys),Htrozygote composite,AC,SC,Chromosomes 16,a2,a1,a2,a1,Homozygote,Chromosomes 11,Htrozygote,d,b,d,b,A,

6、g,A,g,G,g,G,g,d,b,d,b,A,g,A,g,G,g,G,g,Chromosomes 16,a2,a1,a2,a1,SC heterozygote compound,Chromosomes 11,Heterozygote,d,b,d,b,A,g,A,g,G,g,G,g,d,b,d,b,A,g,A,g,G,g,G,g,D型血紅蛋白分子病,常見區(qū)域: 常見于印度.,特點: 變異體位置 b121 Glu (谷氨酸,負電荷) Gln (谷氨酰胺, 不帶電荷) (D- Los Angeles = D-Punjab) (6 different Hb D according to the po

7、sition of the mutation) 堿性緩沖液中: 電荷下降 M電泳速度變度變慢,靠近Hb S,臨床癥狀:,基因雜合體: 無癥狀 (僅在電泳中發(fā)現(xiàn)D區(qū)帶) Hb A fraction: 65 70 % Hb D fraction: 30 35 %,基因純合體: 輕微貧血 Hb A fraction: absence Hb D fraction: 100 %,E型血紅蛋白分子病,常見區(qū)域: 常見與東南亞地區(qū).,特點: 變異位點 b26 Glu (谷氨酸,負電荷) Lys (賴氨酸,正電荷) 堿性緩沖液: 總體帶電荷下降 凝膠電泳中,出現(xiàn)在HbC附近,臨床癥狀:,雜合體: 無癥狀 Hb

8、 A fraction: 65 70 % Hb E fraction: 30 35 %,基因純合體: 輕微貧血 Hb A fraction: absence Hb E fraction: 100 %,下列情況下,需要進行血紅蛋白檢測,臨床和遺傳問題 (產(chǎn)前診斷) 貧血,小紅細胞癥 新生兒篩查 對來自地貧高發(fā)區(qū)人口,進行篩查 對診斷有幫助的其他信息 患者臨床癥狀,年齡,籍貫和其他相關(guān)的背景 (輸血記錄) 血液全套檢測, 網(wǎng)狀細胞級別和進行細胞形態(tài)鏡檢 Hb電泳 (EDTA抗凝管) 離子平衡和溶血情況,血紅蛋白檢測的幾種方法,目前, 血紅蛋白檢測步驟如下: - 電泳法對Hb進行檢測 或者使用等電聚

9、焦電泳法 - 使用 HPLC法進行確認.,20,凝膠電泳結(jié)果識別表,21,在pH梯度的凝膠片上, 根據(jù)蛋白不同的等電點,對蛋白進行分離 Hb電泳位置取決于緩沖液PH值 蛋白電泳至其等電點位置后,停止泳動 At pI=pH, Hb does not have a net charge and stops migrating 電泳分離效果好, 但時間長.需要經(jīng)驗豐富才能獲得良好結(jié)果及進行結(jié)果判斷,等電聚焦電泳法,介于普通電泳和等電聚焦電泳之間的新方法: - 通過毛細管電泳法, 即可以獲得與IEF方法一樣的分辨率,同時檢測結(jié)果量值Hb A2/Hb F同樣精確. - 出現(xiàn)異常變異體后: 使用下列方法確

10、認: * ITANO test (solubility test) * HPLC液相色譜 * Genotyping基因篩查,Capillarys 2,Minicap,全自動毛細管電泳法進行血紅蛋白檢測 Capillarys 2 / Minicap,毛細管電泳法原理,此時,電滲力(EOF)遠遠強于電場力. 因此,蛋白被動從正極向負極端移動.,正電極 +,EOF,負電極 -,Electro migration,蛋白電泳,DETECTION,INJECTION,Capillarys/Minicap血紅蛋白電泳,血紅蛋白條帶,在電滲力的作用下,8分鐘即完成電泳過程, 然后,在415nm紫外光下被檢測并

11、顯示出來. 正常質(zhì)控品 必須在每天檢測前使用 Capillarys : - 檢測速度: 40 樣品/小時 試管架1 至 7號位放置樣品, 8號位放 4ml溶血素 Minicap : - 檢測速度: 10 樣品/小時 試管架1 至 26號位放置樣品, 27號位放溶血素(8個樣品消耗5ml溶血素),Capillarys/Minicap血紅蛋白檢測標本要求,抗凝管采血 (EDTA, heparin, citrate). 如果需要對輸血患者采血, 需要在輸血前采集血液. 使用去除血漿后的紅細胞(隔夜或5000 rpm,5分鐘離心后樣品) + 4C以上, 標本最多存放7天. 需要長期存放, 可以洗滌紅細

12、胞后,放置于 -80C (可存放至少 3個月),Capillarys Minicap 血紅蛋白條帶識別表,Capillarys/Minicap區(qū)帶識別表,Z 15 : Hb H Z 14 : / Z 13 : Hb-J Rovigo, Hb N-Baltimore, J-Kaoshiung Z 12 : Hb Barts, Hb Providence, Hb J-Mexico, Hb J-Baltimore. Z 11 : Hb Kaoshiung(New York),denaturated Hb A Z 10 : Hb Hope, Hb M-Iwate Z 9 : Hb A, Hb Camp

13、erdown, Hb Phnom Penh Z 8 : Acetylated Hb F, Hb Altanta, Hb Athens-GA Z 7 : Hb F, denaturated Hb S, Hb Porto-Allegre. Z 6 : Hb D-Punjab, Hb Philadelphia, Hb Korle-Bu, Hb Lepore, Hb Kln,denaturated Hb E. Z 5 : Hb S, Hb Hasharon, Hb Handsworth, denaturated Hb O-Arab. Z 4 : Hb E, denaturated Hb C, Hb K

14、ln, Hb A2 variants, M-Iwate Hb A2 variants Z 3 : Hb A2, Hb O-Arab Z 2 : Hb C, Hb Constant Spring, Setif HbA2 variant Z 1 : Hb dA2 Hb aA2, Hasharon Hb A2 variant, Winnipeg Hb A2 variant,30,正常Hb A2 質(zhì)控品,條帶結(jié)果可錄為QC,31,Hb AFSC質(zhì)控品, 可用來作為參照曲線,便于異常結(jié)果的判斷,32,Hbs A, F,A2 檢測結(jié)果可通過顏色進行區(qū)分,異常區(qū)帶顯示為灰色,主要異常血紅蛋白變異體,Z15

15、Hb H Z12 Hb Bart Z10 Hb Hope Z9 Hb A Z7 Hb F Z6 Hb D Punjab Z5 Hb S Z4 Hb E Z3 Hb A2 Z2 Hb C,HbE,HbS,HbH,34,HbS 變異體, Hb A2 正常值 6 Glu Val,Hb A = 22,Hb S = 2S2,Hb A2 = 22,Capillarys/Minicap血紅蛋白試劑優(yōu)勢:,無需前處理(不需要洗血和溶血)，直接檢測 血紅蛋白C和E能從A2分離開 根據(jù)S型和D型的細微電荷區(qū)別, 進行區(qū)分. 對于處于A和S之間的F給予個性化和聚焦的精確量化. 對A2型血紅蛋白有很好的分辨率和分離效

16、果 Hb Barts 和 Hb H可以很好的檢測和量化 糖化型血紅蛋白電泳出現(xiàn)在主體峰內(nèi),不影響檢測結(jié)果,36,異常結(jié)果分析,37,Case 2:31 Y Female, 血紅蛋白 12.8, 紅細胞壓積 37.4 (I),A = 84.1 % F = 1.5% A2= 5.5%,38,31 Y Female, Hgb 12.8, Hematocrit 37.4 (II),Alk,Acid,F,S,C,A2,C,S,F,-thalassemia- 輕型,A2,A,A,A,A,C,P,C,P,A=93.4%, F=1.1%, A2=5.5%,Hb A 92.5% Hb F 2.6 Hb A2 4

17、.9%,Hb F,Hb A,Hb A2,67 Y female from Tunisia, Hgb 9.1, hematocrit 28, MCV 62,小紅細胞癥; beta thalassemia輕型,Hb H 4% Hb A 94.7% Hb A2 1.3%,Hb A,Hb A2,Hb H,Child 9 Y, from Laos, Hgb 8, hematocrit 27.9, MCV 54.1,嚴重小紅細胞癥; 血紅蛋白H病，需要基因篩查,41,Hb H and Barts - Alpha-thalassemia,H Barts,42,Case 1: 13 Y Male, Hgb 8

18、.1, Hct 24.0 (I),A2= 6.1% S = 82.8 %,43,Case 1:13 Y Male, Hgb 8.1, Hematocrit 24.0 (II),Alk,Acid,F,S,C,S,A2 + F,C,S,F,S,Hgb F/S, A2=4.6% + beta thalassemia minor,A2,A,F,A,C,P,C,P,44,Case 2:65 Y Male, Hgb 9.4, Hematocrit 27.3 (I),Co-migration with A2,A= 62.1 % A2 = 31.7%*,45,Case 2: Hb E Migrates Sep

19、arately From Hb A226 GluLys,21Y, pregnant woman,Hgb 13.1, hematocrit 38.6,Hb A 95% Hb F 2.1% Hb A2 2.9%,Normal pattern, Hb F slightly increased (pregnancy),Baby 2 months old,father from Martinique, mother from Central Africa, Hgb 11, hematocrit 29.8,Hb F 49.5% Hb S 25.9% Hb A2 1.8% Hb C 22.8%,Hb F,H

20、b S,Hb A2,Hb C,SC compound heterozygoty,Diabetic patient, 54 Y, Hgb 14.5, hematocrit 43.5, MCV 88,HbA1c measurement (HPLC Tosoh),Hb A 54.7% Hb X 41.7% Hb A2 3.6%,Hb A,Hb A2,Hb X,Normal hemogram; compatible with heterozygote A/D; To be identified by genotyping,Hb A 51.8% Hb A2 2.9% Hb C 35.9%,Hb A,Hb

21、 A2,Hb C,Diabetic patient, 61 Y, Hgb 11.6, hematocrit 34.8, MCV 85,Slight anemia; compatible with heterozygote A/C To be identified by genotyping,Adopted child, 4 Y, originated from Haiti, Hgb 10.9, Hematocrit 31.3, MCV 76.9,Hb A 97.5% Hb A2 1.4% Hb X 1.1%,Hb A,Hb A2,Hb X,Slight anemia; heterozygous

22、 Delta mutation, asymptomatic,Diabetic patient, 73 Y, Hgb 10.2, hematocrit 30.8, MCV 87.3,Alpha chain mutation; genotyping confirmation: Hb Winnipeg a 75 Asp Tyr,Hb A- Wi,Hb A2-Wi,Hb A,Hb A2,Hb A 90.3% Hb F 3.8% Hb A2 5.9%,Hb A,Hb F,Hb A2,Hb A 64% Hb S 33.1% Hb A2 2.9%,Hb A,Hb S,Hb A2,Hb A 2.2% Hb F

23、 67.3% Hb S 29.1% Hb A2 1.4%,Hb A,Hb F,Hb S,Hb A2,Father: Beta thalassemia minor Mother: Heterozygote AS,Baby 2 months old: Association S - beta thalassemia,Hb Lepore on Minicap/Capillarys,N,Ac.,A0 + Lepore,A1,Hb A2,Hb A,Hb F,Hb Lepore,AFSC control overlaying,Hb Lepore,b和d鏈重新組合形成. 在堿性緩沖液下電泳: 總體帶電荷下降

24、 電泳位置出現(xiàn) 在S型血紅蛋白附近,基因雜合體: Hb Lepore fraction: 5 15 % Clinical signs of minor b thalassemia,基因純合體: Hb Lepore fraction: about 30 % Clinical signs of homozygous b thalassemia,常見區(qū)域: Lepore (- Boston Washington): 常見于意大利人群; 同樣常見于在羅馬尼亞, 澳大利亞和墨西哥人群. 特點:,a47 AspHis,Hb Hasharon,Hb A,Hb A2,Hb F,Hb Hasharon,Hb H

25、a-A2,Hb O-Arab,b121 GluLys,Hb A2+ O-Arab,Hb F,Hb A,DIAGNOSTIC FLOW-CHART,A NEW FAST HEMOGLOBIN ELECTROPHORESIS METHOD FOR DRIED BLOOD SPOTS ON SEBIA CAPILLARYS AUTOMATED SYSTEM,現(xiàn)有的新生兒血紅蛋白篩查方法 (SCD),新生兒血紅蛋白檢測: * 等電聚焦 (IEF) * 高效離子交換液相色譜法 (CE-HPLC). 毛細管電泳方法可取代常規(guī),操作復雜的等電聚焦方法,新生兒血紅蛋白快速檢測法,取血板,BSD600 全自動打

26、孔器,全自動溶血, 樣品稀釋和檢測,條碼識別： 取血板條碼樣品稀釋杯條碼,使用純凈水洗脫樣品,與IEF方法比較, 毛細管方法優(yōu)勢,對于常見異常血紅蛋白變異體有100區(qū)分能力 (Hb S, C, D, E) 對其他非常見變異體有良好檢測能力 對不同類型樣品擁有相同檢測能力：新生兒, 早產(chǎn)兒或者進行過輸血患兒樣品 全程檢測溯源性: 取血板和樣品稀釋杯使用條碼 高效性(48個樣品/小時), 576樣品/天 4小時人機分離操作, 最多可進行3X192個樣品檢測 可選擇使用與毛細管匹配的全自動打孔機, 完全自動化處理樣品 無需人工進行樣品轉(zhuǎn)移, 避免交叉污染 該項目檢測完全自動化: 從前處理到檢測, 直

27、到結(jié)果分析,全程無需人工干預.,使用標準取血板, 在室溫下進行干燥. 干燥的取血板可在 2-8C下,保存1個月.,新生兒血紅蛋白檢測的樣品要求,通過顏色區(qū)分正常及異常樣品,正常血樣 :with Hb F and Hb A(+ acetylated Hb F),異常血樣,提供樣品檢測完整溯源性,通過樣品 ID, 試劑杯和全自動打孔器的數(shù)據(jù)記錄完成數(shù)據(jù)交換,異常樣品自動顯示,電泳圖譜說明 : * 檢測到條帶的位置, 圖譜會自動定位 * 鼠標經(jīng)過的區(qū)帶位置, 會顯示出該區(qū)帶的所有可能出現(xiàn)的異常血紅蛋白名稱. (N1 to N13).,新生兒血紅蛋白檢測條帶名稱識別表,N 13 : Hb Barts

28、N 12 : / N 11 : Hb Hope, Gamma chain variants, denatured Hb A N 10 : Hb A N 9 : Denatured Hb F N 8 : / N 7 : Hb F N 6 : / N 5 : Hb D-Punjab, Hb G-Philadelphia, Hb Korle-Bu N 4 : Hb S, acetylated gamma chain variants N 3 : Hb E, Hb F-Ouled Rabah, gamma chain variants, Methemoglobin N 2 : Hb A2, Hb O-

29、Arab, Hb F-Ouled Rabah, gamma chain variants N 1 : Hb C,正常血樣,Birth: 19/01/06 Sample collection: 24/01/06 Term : 39 w. Weight : 3445 g,輸血后檢測結(jié)果,Birth: 29/01/06 Sample collection: 01/02/06 Term : 38 w. Weight : 3100 g,F/S homozygote,Birth: 05/01/06 Sample collection: 08/01/06 Term : 37 w. Weight : 3490

30、 g,Hb S,Hb F,Denatured Hb F,早產(chǎn)兒體內(nèi)的F/S,Denatured Hb F,Hb F,Hb S,Birth: 20/02/06 Sample collection: 23/02/06 Term : 34 w. Weight : 1300 g,F/SC compound heterozygote,Denatured Hb F,Hb F,Hb S,Hb C,Birth: 30/01/06 Sample collection: 02/02/06 Term : 40 w. Weight : 3900 g,F/AS heterozygote,Hb A,Hb F,Hb S,B

31、irth: 16/12/06 Sample collection: 19/12/06 Term : 36 w. Weight : 2780g,F/C homozygote,Hb F,Hb C,Denatured Hb F,Birth: 20/12/05 Sample collection: 24/12/05 Term: 39 w. Weight: 3160 g,F/AC heterozygote,Birth: 18/12/06 Sample collection: 21/12/06 Term: 40 w. Weight: 3035 g,F/AC in a premature newborn,Birth: 17/10/05 Sample collection: 20/10/05 Term: 30 w. Weight: 2330 g,F/AD heterozygote,Birth: 29/01/06 Sample collection: 31/01/06 Term: 37 w. Weight: 3280 g,F/E homozygote,Hb E,Hb F,Denatured Hb F,Birth: 10/11/06 Sample collection: 13/11/06 Term: 40