蛋白純化思路

1、上清純化 掛柱 不掛柱 純 不純 標簽不正常 標簽正常 無標簽 量夠 量不夠 再次掛柱 換純化方式 換純化方式 換純化方式 換純化方式 透析 透析 再次純化 純 不純 純 不純 純 不純 純 不純 純 不純 正常 不正常 量夠 換純化方式 再換純化方式 再換 再換 再換 純化 純化 純化 純 不純 方法 方法 方法 終止 純 不純 純 不純 純 不純 終止 終止 終止 包涵體純化溶解（8M尿素） 不溶解（8M尿素） 掛柱 不掛柱 溶解（6M鹽酸胍） 不溶解（6M鹽酸胍） 純 不純 標簽不正常 標簽正常 無標簽 不溶解（SDS） 溶解（SDS） 量夠 量不夠 再次掛柱 換純化方式 換純化方式 換

2、純化方式 換純化方式 復(fù)性 復(fù)性 再次純化 純 不純 純 不純 純 不純 純 不純 純 不純 終止正常 不正常 量夠 換純化方式 再換純化方式 再換 再換 再換 純化 純化 純化透析 透析 純 不純 方法 方法 方法正常 不正常 終止 純 不純 純 不純 純 不純 終止 終止 終止 上清純化(1) 上清純化：掛柱和不掛柱。(2) 當(dāng)?shù)鞍讙熘鶗r，純化所得的蛋白純度和量達標時，可進行透析試驗。透析試驗正常（濃度達標），可進行分裝；透析試驗不正常（濃度不達標），要么濃縮（離心或甘油），要么重新取樣將蛋白濃度控制高一點；透析試驗不正常（出現(xiàn)沉淀），要檢查透析時的濃度，透析Buffer，PH值是否正常，

3、不正確要改正，并結(jié)合參考文獻和客戶的要求，以確定最終的透析條件。(3) 當(dāng)?shù)鞍讙熘鶗r，純化所得的蛋白純度達標時，但是量不夠時，可重新接大瓶后再次純化以達到所需的量。與此同時可將先純化得到的不足量的蛋白去做透析小試，以便為此后的足量蛋白透析摸索條件。(4) 當(dāng)?shù)鞍讙熘鶗r，純化所得的蛋白純度不達標時，先判斷是否是洗脫時洗脫Buffer的梯度選擇有問題，或者是梯度沒有洗脫徹底。如果是上述原因，可將樣品再次掛柱，選擇最佳洗脫梯度并洗脫徹底?；蛘邔⒉患兊臉悠窉祀x子柱，若純度達標則進行下一步操作，若純度還不行，可將不純的樣品過分子篩，若多種純化方式結(jié)合后純度依然不達標，要么與客戶溝通，要么終止實驗。(5)

4、 當(dāng)?shù)鞍撞粧熘鶗r，目標蛋白帶標簽的要考慮一下標簽是否正常。通過Western blot等方法檢測標簽是否正常，如果標簽正常，有可能是蛋白的標簽沒有暴露，可以加入足量的還原劑等使其標簽暴露，也可以通過掛離子柱和過分子篩來純化蛋白；如果標簽不正常，有可能是在樣品處理時將其所帶的標簽斷裂，其與不帶標簽的蛋白處理方法一樣，通過掛離子柱和過分子篩來純化蛋白；以上的方法純化的蛋白純度達標可進行下一步，若已經(jīng)通過組合純化的方式純度不達標，要么與客戶溝通，要么終止實驗。(6) 在純化上清時，會經(jīng)常出現(xiàn)蛋白不穩(wěn)定（降解或沉淀）的情況，所以在處理樣品時就可以另外加入12mM DTT，或者在收集時在洗脫Buffer

5、中加入12mM DTT。并且純化時的速度要快，且全程必須在冰浴中進行。 包涵體純化（1） 包涵體純化：溶解（8M尿素） 和 不溶解（8M尿素）； 溶解（6M鹽酸胍）和 不溶解（6M鹽酸胍） 溶解（1%2%SDS） 和 不溶解（1%2%SDS） 掛柱 和 不掛柱（2） 當(dāng)8M尿素溶解好的蛋白掛柱時，純化所得的蛋白純度和量達標時，可進行復(fù)性透析試驗。復(fù)性透析試驗正常（濃度達標），可進行分裝；復(fù)性透析試驗不正常（濃度不達標），要么濃縮（離心或甘油），要么重新取樣將蛋白濃度控制高一點；復(fù)性透析試驗不正常（出現(xiàn)沉淀），要檢查透析時的濃度，復(fù)性透析Buffer，PH值是否正常，是否加入肌氨酸鈉等，不正確要

6、改正，并結(jié)合參考文獻和客戶的要求，以確定最終的復(fù)性透析條件。（3） 當(dāng)8M尿素溶解好的蛋白掛柱時，純化所得的蛋白純度達標時，但是量不夠時，可重新接大瓶后再次純化以達到所需的量。與此同時可將先純化得到的不足量的蛋白去做復(fù)性透析小試，以便為此后的足量蛋白復(fù)性透析摸索條件。（4） 當(dāng)8M尿素溶解好的蛋白掛柱時，純化所得的蛋白純度不達標時，先判斷是否是洗脫時洗脫Buffer的梯度選擇有問題，或者是梯度沒有洗脫徹底。如果是上述原因，可將樣品再次掛柱，選擇最佳洗脫梯度并洗脫徹底?；蛘邔⒉患兊臉悠窉祀x子柱，若純度達標則進行下一步操作，若純度還不行，可將不純的樣品過分子篩，若多種純化方式結(jié)合后純度依然不達標，

7、要么與客戶溝通，要么終止實驗。（5） 當(dāng)8M尿素溶解好的蛋白不掛柱時，目標蛋白帶標簽的要考慮一下標簽是否正常。通過Western blot等方法檢測標簽是否正常，如果標簽正常，有可能是蛋白的標簽沒有暴露，可以加入足量的還原劑等使其標簽暴露，也可以通過掛離子柱和過分子篩來純化蛋白；如果標簽不正常，有可能是在樣品處理時將其所帶的標簽斷裂，其與不帶標簽的蛋白處理方法一樣，通過掛離子柱和過分子篩來純化蛋白；以上的方法純化的蛋白純度達標可進行下一步，若已經(jīng)通過組合純化的方式純度不達標，要么與客戶溝通，要么終止實驗。（6） 當(dāng)8M尿素不溶解蛋白（溶解率低），首先分析是否是在處理樣品時沒有研磨充分，如果研磨不充分，會導(dǎo)致蛋白膠質(zhì)化，難以溶解。如果研磨充分，還是不溶解，就該用溶解性更高的6M 鹽酸胍溶解。（7） 如果6M 鹽酸胍溶解蛋白充分，下面的步驟和8M尿素充分溶解蛋白的步驟一樣。（8） 當(dāng)6M 鹽酸胍不溶解蛋白（溶解率低），若是操作原因可改正，若不是操作原因，需要用溶解性能更高的1%2%SDS溶解。（9） 如果1%2%SDS溶解蛋白充分，下面的步驟和8M尿素充分溶解蛋白的步驟一樣。（10） 如果1%2%SDS不溶解蛋白（溶解率低），若能從低溶解率的蛋白溶液中純化得到