BD_FACSCalibur流式細(xì)胞儀操作手冊

1、.bd facscalibur流式細(xì)胞儀facs101 handbook本課程介紹表面抗原流式分析有關(guān)之基礎(chǔ)工作原理。如希望進(jìn)一步了解流式細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用，請至本公司網(wǎng)站訂閱facsinformation電子報(bào).tw/bdb/index.html。如需要本課程手冊，歡迎至本公司網(wǎng)站下載 .tw/bdb/10-5-3-1.html 。如需要免疫熒光染色方法，請至本公司網(wǎng)站下載 .tw/bdb/10-5-4-1.html 。一、bd facscalibur基本結(jié)構(gòu)1.1儀器本體：1. 電源開關(guān)：在bd facscalibur

2、儀器右側(cè)下方，先啟動(dòng)儀器本體，再打開計(jì)算機(jī)。2. 光學(xué)系統(tǒng)：bd facscalibur 基本配有一支波長488 nm 的氬離子雷射以bd facscalibur 基本型為例 fsc diode 只收488 nm波長散射光 ssc pmt 只收488 nm波長散射光 fl1 pmt 熒光光譜峰值落在綠色范圍（波長515-545 nm） fl2 pmt 熒光光譜峰值落在橙紅色范圍（波長564-606 nm） fl3 pmt 熒光光譜峰值落在深紅色范圍（波長 650 nm）精品.3. 儀器面板：儀器前方面板的右下方有三個(gè)流速控制鍵、及三個(gè)功能控制鍵。流速控制：lo： 樣品流速：12 ml /min

3、med：樣品流速：35 ml /minhi: 樣品流速：60 ml /min功能控制： run：此時(shí)上樣管加壓，使細(xì)胞懸液從進(jìn)樣針進(jìn)入流動(dòng)室。（正常顯示綠色；黃色時(shí)表示儀器不正常，請檢查是否失壓。） standby：無樣品或暖機(jī)時(shí)之正常位置，此時(shí)鞘液停止流動(dòng)，雷射功率自動(dòng)降低。 prime：去除流動(dòng)室中的氣泡，流動(dòng)室施以反向壓力，將液流從流動(dòng)室沖入樣品管，持續(xù)一定時(shí)間后，以鞘液回注滿流動(dòng)室。prime 結(jié)束，儀器恢復(fù)standby狀態(tài)。4. 儲(chǔ)液箱抽屜：在主機(jī)左下方之儲(chǔ)液箱抽屜。可向前拉開，內(nèi)含鞘流液筒、廢液筒、鞘液過濾器sheath filter，及空氣濾網(wǎng) air filter。請注意氣路

4、減壓閥vent toggle之位置。精品. 鞘液筒：位于抽屜左側(cè)，容積4升。裝八分滿鞘液筒，儀器可以運(yùn)行大約 3小時(shí)。筒上裝有液面感應(yīng)器，鞘液用完時(shí)，儀器軟件上會(huì)有顯示。鞘液筒蓋上有金屬環(huán)扣，保證鞘液筒密閉。 廢液筒：位于抽屜右側(cè)，容積4升。筒上裝有液面感應(yīng)器，廢液盛滿時(shí)，儀器軟件上會(huì)有顯示。注意廢液可能有潛在的生物傳染性。 鞘液過濾器：0.22mm過濾器，去除鞘液中的雜質(zhì)，保證進(jìn)入流動(dòng)室的鞘液是干凈的。 氣路減壓閥：沿箭頭方向移動(dòng)閥門開關(guān)，鞘液筒減壓，氣壓恢復(fù)正常。在鞘液筒添加鞘液時(shí)，需要減壓。 空氣過濾網(wǎng)：用于過濾冷卻雷射的空氣。5. 上樣品區(qū)：上樣品區(qū)是樣本管的上樣位置。它包括三個(gè)部分，

5、一個(gè)是進(jìn)樣針 sample injection tube，將樣本輸入流動(dòng)室，還有就是支撐架 tube support arm、和液滴存留系統(tǒng) droplet containment system。 進(jìn)樣針：是一根不銹鋼管，將細(xì)胞從樣本針中吸入流動(dòng)室。進(jìn)樣管外有一套管，是液滴保留系統(tǒng)的一部分。 支撐架：用于支撐樣本管、并負(fù)責(zé)啟動(dòng)液滴存留系統(tǒng)。支撐架有三個(gè)位置：位于樣本管之下的中位，樣本管左側(cè)或右側(cè)。液滴存留系統(tǒng)：系統(tǒng)由支撐架、真空幫浦和外套管組成。當(dāng)支撐架位于左側(cè)或右側(cè)位置時(shí)，真空幫浦就會(huì)啟動(dòng)，將液體從外管吸入廢液筒內(nèi)。上樣時(shí)，須注意將支撐架位于中位，以避免過多樣品被抽吸到廢液筒內(nèi)（當(dāng)支撐架位于

6、中位，真空幫浦停止工作）。更換樣品時(shí)，讓儀器保持run的模式，使得進(jìn)樣針可以反沖；切換到standby模式前，確保液路已沖洗徹底以免碎片沈積到流動(dòng)室中。精品.1.2 macintosh計(jì)算機(jī)與打印機(jī)：準(zhǔn)備您的細(xì)胞樣品1. 理想樣品濃度調(diào)至1-10 x 105 cells/ml？一般實(shí)驗(yàn)只需0.5 ml的樣品。2. 細(xì)胞樣品務(wù)必放至bd falcon 352052 試管中，否則無法上機(jī)。3. 上機(jī)前務(wù)必去除樣品中之細(xì)胞團(tuán)塊，以防止管路堵塞？可使用附濾網(wǎng)bd falcon試管 (cat. no.352235) 或35-55 mm的尼龍篩網(wǎng)。4. 供流式分析的樣品是單細(xì)胞懸浮液，而且大部分樣品都需經(jīng)

7、熒光染色。表面抗原熒光染色的方法大致有兩種：直接免疫熒光、間接免疫熒光染色。研究生可至本公司網(wǎng)站下載染色方法 .tw/bdb/10-5-4-1.html 直接免疫熒光染色 lysed - no - wash procedure lysed - and - wash procedure, simultest & hla-b27 peripheral blood mononuclear cell procedure leukemia and lymphoma procedure 1 leukemia and lymphoma procedure 2, b-ce

8、ll clonality assay 間接免疫熒光染色 滴定抗體濃度 常用試劑5. 如因特殊因素?zé)o法下載上述實(shí)驗(yàn)方法，請e-mail：.tw或 austin_.tw。精品.二、開機(jī)、關(guān)機(jī)標(biāo)準(zhǔn)操作2.1 facs calibur 開機(jī)1. 開啟細(xì)胞儀電源。2. 開啟其它周邊配備電源，如打印機(jī)及mo機(jī)。3. 開啟計(jì)算機(jī)。4. 確認(rèn)鞘流液筒有八分滿的facs flow，確實(shí)旋緊 (鞘液筒容量為4l)。5. 將廢液倒掉，并在廢液筒中加入200 ml 家用漂白水 (廢液筒容量為4l)。6. 將減壓閥方向調(diào)在加壓（pressurize）位置

9、。7. 排除液流管路與過濾器中的氣泡。8. 取下樣品管，執(zhí)行 prime 功能兩次。9. 使用1ml pbs，high run 兩分鐘。10. 可開始分析樣品。2.2 facs calibur 關(guān)機(jī)關(guān)機(jī)前必要?jiǎng)幼鳎呵逑催M(jìn)樣管和外套管，防止進(jìn)樣管堵塞、或有染料殘留。1. 將樣品支持架左移，取 2 ml facsclean（10%bleach）上樣品，讓儀器的真空系統(tǒng)抽取約 1 ml 的液體。2. 將樣品支持架回正，按 hi run，然后讓 facsclean 清洗管路10分鐘。3. 按 standby，取下樣品管，執(zhí)行 prime功能兩次。4. 取 2 ml dh2o，重復(fù)上述步驟1-3。5.

10、注意最后只留約 1 ml dh2o 在試管中。6. 按 standby 五分鐘，使風(fēng)扇冷卻雷射后，關(guān)閉細(xì)胞儀（必要?jiǎng)幼鳎员Ｗo(hù)雷射光源。）7. 倒掉廢液，并回填 200 ml漂白水。8. 將減壓閥放在vent 漏氣位置。將鞘流液筒充填至八分滿。9. 退出軟件“file”“quit”(如有對話選項(xiàng)，選擇“dont save”)。確認(rèn)退出計(jì)算機(jī)中所有bd應(yīng)用軟件，所有數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)已儲(chǔ)存?zhèn)浞荨?0. 關(guān)閉計(jì)算機(jī)?！皊pecial”“shutdown”。精品.三、上機(jī)分析流程建議首次試機(jī)避免進(jìn)行大量試驗(yàn)，僅需準(zhǔn)備下列樣品。（1）negative control（不加任何抗體）。（2）cd3-fitc（fl

11、1 單染）。（3）cd19-pe（fl2 單染）。（4）cd3-fitc /cd19-pe（fl1/fl2 雙染）。3.1 calibur 開機(jī)1. 先開啟細(xì)胞儀本體再打開計(jì)算機(jī)。 *秘技1：如順序相反，儀器和計(jì)算機(jī)之間無法建立正常通訊，無法執(zhí)行“connect to cytometer”。 解決之道，兩者都關(guān)機(jī)、然后以正確方式重開。2. 向前拉開儲(chǔ)液箱抽屜，檢查鞘液筒、廢液筒水量，如需充填鞘液，將減壓閥方向調(diào)在vent位置（箭頭方向）。3. 儀器會(huì)對鞘流液筒打氣加壓，請確認(rèn)筒蓋確實(shí)旋緊。 *秘技2：將減壓閥方向調(diào)在加壓（向前）位置。減壓閥如在vent（箭頭方向）位置，按run功能鍵時(shí)將顯示橙

12、黃色（表示儀器不正常，請檢查是否失壓），正常為綠色顯示。3.2開啟cellquest 軟件、編輯實(shí)驗(yàn)文件4. 在蘋果菜單下點(diǎn)擊cellquest 啟動(dòng)軟件。桌面會(huì)出現(xiàn)一untitled 實(shí)驗(yàn)文件，可點(diǎn)擊實(shí)驗(yàn)文件的右上角的放大鈕，將實(shí)驗(yàn)文件窗口放大。精品.5. 從工具板中點(diǎn)擊散點(diǎn)圖圖示。在實(shí)驗(yàn)文件的空白區(qū)點(diǎn)擊，拖曳對角線至適當(dāng)大小，然后放開鼠標(biāo)。出現(xiàn)散點(diǎn)圖對話方框。6. 在出現(xiàn)的散點(diǎn)圖對話方框中點(diǎn)擊plot source，選擇acquisition (收取) ，確認(rèn)x和y軸參數(shù)預(yù)設(shè)為fsc-h 1024、ssc-h 1024。在顏色方框中點(diǎn)擊multicolor gating（收取樣品時(shí)，門內(nèi)細(xì)

13、胞將出現(xiàn)顏色）。點(diǎn)擊ok。此時(shí)實(shí)驗(yàn)文件會(huì)出現(xiàn)fsc/ssc散點(diǎn)圖。7. 說明：散點(diǎn)圖（dotplot），又稱二維散點(diǎn)圖是流式分析最常用圖譜，它可以顯示兩個(gè)獨(dú)立參數(shù)的相互關(guān)系。在圖中，橫坐標(biāo)x軸為為熒光1強(qiáng)度的相對值，單位是道數(shù)，縱坐標(biāo)y軸則通常表示熒光2或光散射強(qiáng)度的相對值。儀器使用者可因應(yīng)實(shí)驗(yàn)需求來修改所有圖譜中顯示之參數(shù)。第一圖x和y軸參數(shù)分別設(shè)為fsc-h 1024、ssc-h 1024；第二圖x和y軸參數(shù)分別設(shè)為fl1-h 1024、fl2-h 1024。修改動(dòng)作為輕擊圖譜上x和y軸參數(shù)，并依需要選擇之（fsc：細(xì)胞大小，ssc：細(xì)胞折射率，fl1：fitc綠色熒光，fl2：pe橙色熒

14、光，fl3：percp紅色熒光）。精品.8. 從屏幕上方plots菜單中選擇dot plot功能，可復(fù)制一個(gè)同樣大小的散點(diǎn)圖，在出現(xiàn)的對話方框內(nèi)選擇x軸：fl1-h 1024，y軸：fl2-h 1024。點(diǎn)擊ok，fl1/fl2的散點(diǎn)圖出現(xiàn)。完成后可將重制圖移至原圖右方。9. 在工具板中選擇四象限工具，在fl1/fl2散點(diǎn)圖上拖動(dòng)quadrant的中心將它設(shè)定在（x，y）（101，101）處，這些象限將指定陰性/陽性區(qū)域。建立儀器和計(jì)算機(jī)之間通訊10. 從acquire菜單中選擇connect to cytometer，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)acquisition control 對話方框。如果無法選擇c

15、onnect to cytometer，參考秘技 #1。如果沒見到acquisition control 對話，可到屏幕上方windows菜單中選擇show acquisition control。儀器設(shè)置文件精品.注意：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)質(zhì)量，取決于最適化儀器設(shè)定文件。儀器設(shè)定文件不能在數(shù)據(jù)收取后再更改，研究人員必須在第一次就使用正確的儀器設(shè)定文件。儀器設(shè)定文件（instrument settings），含信號器高壓（detector/ amps），閾值（threshold），熒光補(bǔ)償（compensation）等儀器條件的組合。一般而言，儀器設(shè)定的順序?yàn)閐etector/amps - thresho

16、ld - compensation。11. 檢查現(xiàn)有儀器條件，從cytometer菜單中選擇detectors/amps。出現(xiàn) detectors/amps窗口。在detectors/amps窗口確認(rèn)fsc與ssc為lin（線性放大），其它fl1-3為log（對數(shù)放大），將其拖至空白區(qū)。12. 從cytometer菜單中選擇threshold，出現(xiàn) threshold 窗口在threshold 窗口：確認(rèn)fsc為設(shè)閾參數(shù)，初步確認(rèn)預(yù)設(shè)閾值52。將其拖至空白區(qū)。13. 從cytometer菜單中選擇compensation，確認(rèn)所有預(yù)設(shè)數(shù)值皆為零。將其拖至空白區(qū)。3.3 上樣品、設(shè)置儀器14.

17、使儀器處于high run，支撐架左移，上陰性對照管樣品，支撐架回位。確認(rèn)acquisition control 窗口中 setup前需打叉或打勾 (即不儲(chǔ)存數(shù)據(jù))，點(diǎn)擊acquire。 精品.調(diào)節(jié)fsc/ssc探測器（電壓）15. 觀察fsc/ssc圖的變化。fsc電壓(voltage)預(yù)設(shè)為e00，可調(diào)節(jié) amp gain 從1.009.99 使主要細(xì)胞群得以清楚顯示（如細(xì)胞較大，將fsc電壓設(shè)置于e-1；較小細(xì)胞，將fsc電壓設(shè)置于e01）。調(diào)節(jié)ssc電壓使主要細(xì)胞群得以清楚呈現(xiàn)。調(diào)節(jié)fsc/ssc圖的原則，在于能得到一獨(dú)立離散的細(xì)胞族群，該細(xì)胞群不與其它族群、細(xì)胞碎片有重迭現(xiàn)象。調(diào)整定

18、位后，點(diǎn)擊acquisition control 窗口中的pause。gating 圈選細(xì)胞檢品中，常含有大小不同、性質(zhì)相異的細(xì)胞群體。我們常用前方散射與側(cè)方散射的二維位圖，即散射光圖譜（scatter plot），來圈選出不同細(xì)胞群的范圍，選擇性顯示出有意義的細(xì)胞群體，如下圖圈選白血球之淋巴細(xì)胞族群。16. 在工具板中選擇多邊形的region，在fsc/ssc散點(diǎn)圖上劃定淋巴細(xì)胞r1 區(qū)域（如下圖）。分析樣品時(shí)，區(qū)域內(nèi)細(xì)胞應(yīng)會(huì)呈現(xiàn)成紅色，可移動(dòng)或改變形狀來圈選有意義的細(xì)胞。如果要?jiǎng)h除r1區(qū)域，您可以在工具列中點(diǎn)選gates region list ，以鼠標(biāo)點(diǎn)選 r1，再按delete 鍵刪除

19、r1 區(qū)域。刪除r1區(qū)域后，可用繪圖工具板，重畫r1。17. 選取希望gate的fl1/fl2散點(diǎn)圖，從plots菜單中選擇format dot plot。在出現(xiàn)的對話方框內(nèi)，將no gate 改選 g1=r1。點(diǎn)擊ok。 調(diào)節(jié)fl1、fl2的探測器（電壓）精品.18. 點(diǎn)擊acquisition control 窗口中的restart。在detector/amps 窗口中調(diào)節(jié)fl1、fl2的電壓，使negative control細(xì)胞群著落在所選直方圖或散點(diǎn)圖之100-101處。19. 在threshold 窗口，適當(dāng)?shù)靥岣遞sc閾值52，以去除碎片或低階噪音。唯需注意不要切掉主要細(xì)胞族群。

20、 20. 點(diǎn)擊acquisition control 窗口中的pause、abort。移去陰性對照管，關(guān)閉detector/amps、threshold窗口，我們已設(shè)定好有意義細(xì)胞群之自體熒光。調(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償說明：最適化的最后一步是調(diào)節(jié)光譜重迭。（如是單色熒光實(shí)驗(yàn)可跳過此步驟）如是2色樣本，必要時(shí)需調(diào)節(jié)fl2-%fl1，fl1-%fl2（若3色樣本，必要時(shí)需調(diào)節(jié)fl2-%fl1、fl1-%fl2、fl3-%fl2、fl2-%fl3的補(bǔ)償）。精品.21. high run，換上單染cd3-fitc管。點(diǎn)擊acquisition control窗口中的acquire。調(diào)節(jié)fl2-%fl1使fitc陽

21、性細(xì)胞在fl1/fl2散點(diǎn)圖的右下象限。補(bǔ)償調(diào)節(jié)可通過點(diǎn)擊來選擇或直接拖動(dòng)滑標(biāo)上下移動(dòng)。調(diào)節(jié)完畢，點(diǎn)擊acquisition control窗口中的pause。22. 移去單染cd3，換上單染cd19-pe管。點(diǎn)擊acquisition control窗口中的restart。調(diào)節(jié)fl1-%fl2使pe+細(xì)胞在fl1/fl2散點(diǎn)圖的左上象限。調(diào)節(jié)完畢，點(diǎn)擊acquisition control窗口中的pause。23. 最后以cd3-fitc/cd19-pe雙染樣本上機(jī)，點(diǎn)擊acquisition control窗口中的restart，確定三群細(xì)胞工整垂直。當(dāng)您已完成2色熒光之光譜重迭時(shí)，點(diǎn)擊a

22、cquisition control窗口中的pause、abort。24. 移去樣本管，換上dh2o管，讓儀器暫且處于standby狀態(tài)。關(guān)閉compensation窗口。您已完成2色熒光之最適化。3.4收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)決定儲(chǔ)存細(xì)胞總數(shù)精品.25. 預(yù)設(shè)之儲(chǔ)存細(xì)胞總數(shù)為10000。如需修改，從acquire菜單中選擇acquisition & storage，并在出現(xiàn)的窗口功，確認(rèn)collection criteria從10000 of all，再點(diǎn)擊ok。 26. 找個(gè)檔案匣準(zhǔn)備儲(chǔ)存數(shù)據(jù)。從acquire 菜單中選擇parameter description，出現(xiàn)parameter descri

23、ption對話方框。點(diǎn)擊folder，并在隨后出現(xiàn)之對話方框，選擇your folder或新建活頁夾，點(diǎn)擊此對話方框的select your folder。27. 命名即將儲(chǔ)存之文件名：點(diǎn)擊parameter description對話方框的file，出現(xiàn)文件名編輯窗口。在custom prefix中：輸入文件名20031231，點(diǎn)擊此對話方框的ok。日期為最常用之文件名系統(tǒng)。精品.28. optional：如有需要，可選擇或在p1-p5后的空格中輸入相關(guān)參數(shù)名。如p1：size, p2：granularity, p3：cd3 fitc。輸入?yún)?shù)名會(huì)存入實(shí)驗(yàn)檔案中，顯示在圖譜上。計(jì)數(shù)器coun

24、ters29. 從acquire 菜單中選擇counters. 窗口會(huì)顯示樣品分析速率、與總數(shù)進(jìn)度。收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)30. 你可以開始收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)了。high run，將第一管樣品放到檢測區(qū)，在acquisition control窗口中，將 setup 改成 setup，此時(shí)cellquest會(huì)自動(dòng)顯示 your folder：20031231.001為資料文件名。點(diǎn)擊“acquire” 便可啟動(dòng)樣品之分析測定與數(shù)據(jù)儲(chǔ)存。當(dāng)計(jì)算機(jī)成功地收取足夠數(shù)據(jù)，會(huì)自動(dòng)儲(chǔ)存數(shù)據(jù)文件20031231.001，并會(huì)以“嘟”聲告知，cellquest會(huì)自動(dòng)升冪附加檔名成20031231.002。等待下一指示。31.

25、 你可以換上下一管樣品，點(diǎn)擊“acquire” 啟動(dòng)樣品之分析測定與數(shù)據(jù)儲(chǔ)存?？衫^續(xù)分析直到所有檢品都分析完畢。3.5實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)之儲(chǔ)存與備份：精品.32. 不建議長期使用硬盤儲(chǔ)存數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)，可考慮以燒光盤（如配有 cd-rw）、口袋硬盤（flash drive）來備份大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以免占用原有硬盤的內(nèi)存，影響數(shù)據(jù)處理速度?？蓪浞莺笾?dāng)?shù)據(jù)，拿到另一蘋果計(jì)算機(jī)或個(gè)人pc進(jìn)行離機(jī)分析。33. 確認(rèn)所有檔案皆己備份后，以鼠標(biāo)圈選欲刪除數(shù)據(jù)，將其拖拉至trash筒。退出軟件34. 檢品分析完畢后，記得從屏幕上方 file 指令欄選擇 save as，儲(chǔ)存實(shí)驗(yàn)文件，以備日后使用，不需每次重新編輯。35. 從

26、屏幕上方 cytometer 指令欄，選擇instrument setting，出現(xiàn)instrument setting窗口。點(diǎn)系print打印此次實(shí)驗(yàn)條件，可貼入實(shí)驗(yàn)筆記留底，再點(diǎn)擊save以儲(chǔ)存此一實(shí)驗(yàn)的儀器條件，供日后再使用。點(diǎn)系save后會(huì)出現(xiàn)文件保存對話方框，選擇文件目錄及文件名（例：your folder：/your setting1），點(diǎn)擊save。點(diǎn)擊done。36. 檢品分析完畢后，用鼠標(biāo)從屏幕上方 acquire 指令欄中，選取disconnect to cytometer 以斷絕計(jì)算機(jī)與儀器間之聯(lián)機(jī)。之后如不分析數(shù)據(jù)，您可退出軟件“file”“quit”(遇有選項(xiàng)永遠(yuǎn)選擇

27、“dont save”)，進(jìn)行關(guān)機(jī)程序。 管路清洗37. 以2 ml 10 漂白水取代樣品，將樣品架置于左位以外管吸除約1 ml，再將樣品架置于中位 hi run 十分鐘。改用 2 ml di water。重復(fù)上述程序，樣品架上留約 1 ml di water 。按standby五分鐘。關(guān)主機(jī)、關(guān)計(jì)算機(jī)精品.四、數(shù)據(jù)分析fcs list mode數(shù)據(jù)文件：說明：fcs list mode數(shù)據(jù)文件是流式細(xì)胞儀的標(biāo)準(zhǔn)格式檔案（fcs2.0）。該文件含有從流式細(xì)胞儀收取的平均10,000個(gè)細(xì)胞數(shù)的資料，含有46個(gè)參數(shù)。一般軟件無法打開list mode數(shù)據(jù)文件，需藉助如cellquest, winl

28、ist, winmdi, 等flow 分析軟件，才可開啟、繪圖、并進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。4.1 開啟一cellquest實(shí)驗(yàn)文件1. 從屏幕上方file 菜單中選擇new。桌面會(huì)出現(xiàn)一untitled 實(shí)驗(yàn)文件，可點(diǎn)擊實(shí)驗(yàn)文件的右上角的放大鈕，將實(shí)驗(yàn)文件窗口放大。4.2散點(diǎn)圖之統(tǒng)計(jì)分析（雙色）2. 從工具板中點(diǎn)擊散點(diǎn)圖圖示。在實(shí)驗(yàn)文件的空白區(qū)點(diǎn)擊，然后拖動(dòng)對角線至適當(dāng)大小。plot 拖曳完成后可以在右方看到dot plot對話框。精品.3. 在dot plot方框中，plot source應(yīng)預(yù)設(shè)為analysis，可點(diǎn)擊 select file 鈕，并用隨后之方框來開啟預(yù)存之 sample files

29、，它們的路徑位于mac hd：bd applications：cellquest folder：sample files。連續(xù)雙擊鼠標(biāo)來打開次目錄，找到檔案后，點(diǎn)擊 open來開啟 norm001 檔案。x 與 y 參數(shù)項(xiàng)會(huì)出現(xiàn)默認(rèn)值fsc-h 256 與 ssc-h 256，在color方框中點(diǎn)擊multicolor gating，確認(rèn)無誤之后，點(diǎn)擊 ok 便完成了一個(gè) norm001 的 fsc /ssc散點(diǎn)圖。4. 工具板中選擇多角形區(qū)隔工具，將cursor 移至fsc/ssc散點(diǎn)圖上，并沿著淋巴球聚落周邊畫出范圍，連點(diǎn)擊兩次可關(guān)閉該區(qū)域。你已完成 r1區(qū)域的界定，我們將以此區(qū)域來圈選淋

30、巴細(xì)胞。(如果要?jiǎng)h除r1區(qū)域，您可以在工具列中點(diǎn)選gates region list，以鼠標(biāo)點(diǎn)選 r1，再按delete 鍵刪除r1 區(qū)域。刪除r1區(qū)域后，可用繪圖工具板，重畫r1。)5. 從plots菜單中選擇dot plot可復(fù)制一個(gè)同樣大小的散點(diǎn)圖，屏幕上會(huì)出現(xiàn)一 dot plot 對話方框。點(diǎn)擊x parameter 鈕來顯示 norm001 檔案中所有的參數(shù)項(xiàng) (fsc, ssc, fl1, fl2) 將 x 參數(shù)項(xiàng)改成fl1-h 256 gamma-1，y 參數(shù)項(xiàng)改成fl2-h 256 gamma-2。從gate輸入欄中將 nogate 改成g1= r1。精品.6. 點(diǎn)擊 ok 便

31、完成了一個(gè)以 g1 圈選的 fl1/ fl2 散點(diǎn)圖，可將復(fù)制圖移至原圖右方。norm001 檔案為本組實(shí)驗(yàn)之陰性對照組，我們將以之來界定陰性與陽性之界限。7. 從屏幕左列工具板中，選取 quadrant marker 工具，然后在 fl1/ fl2 散點(diǎn)圖中心處點(diǎn)擊并拖曳至定點(diǎn)，一般而言是緊挨著陰性細(xì)胞聚落。8. fl1/ fl2 二維散點(diǎn)圖現(xiàn)在被區(qū)隔出四個(gè)象限，欲計(jì)算各象線中細(xì)胞的數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)，從屏幕上方stats菜單中選擇quadrant stats?？梢缘玫皆搱D之四象限統(tǒng)計(jì)結(jié)果。ul：左上象限，ur：右上象限，ll：左下象限，lr：右下象限打印報(bào)告、輸出統(tǒng)計(jì)數(shù)值9. 從屏幕上方file菜單

32、中選擇print one，可以打印工作中實(shí)驗(yàn)文件。精品.10. 點(diǎn)選四象限統(tǒng)計(jì)表，從屏幕上方file菜單中選擇export statistics可輸出統(tǒng)計(jì)數(shù)值至excel檔案。在出現(xiàn)方框中命名檔案，并決定欲存放檔案匣，點(diǎn)擊save。4.3 開啟其它list mode data11. 如欲接著分析存在同一檔案匣之系列檔案，可用鼠標(biāo)以拖曳方式選取所有圖表 (文件中所有圖譜的四角會(huì)出現(xiàn)黑色方塊，表示被選擇上) ，接著從plots菜單選擇next data file，軟件會(huì)自動(dòng)以新檔案來替換現(xiàn)有檔案，您只要確認(rèn)圈選范圍、與 quadrant marker 的位置是否恰當(dāng)，即可打印報(bào)告、或輸出統(tǒng)計(jì)數(shù)值。

33、12. 對于存在不同檔案匣之系列檔案，可用鼠標(biāo)以拖曳方式選取所有圖表 (文件中所有圖譜的四角會(huì)出現(xiàn)黑色方塊，表示被選擇上) ，接著從plots菜單選擇change data files，并在隨后出現(xiàn)之對話方框，選擇所在新目錄與欲分析檔案。點(diǎn)擊open。可調(diào)整圈選區(qū)域，quadrant marker陰陽界限，軟件會(huì)重新計(jì)算、統(tǒng)計(jì)報(bào)告。13. 常規(guī)使用之實(shí)驗(yàn)文件 (內(nèi)含散點(diǎn)圖、圈選區(qū)格、四象限分界、以及統(tǒng)計(jì)報(bào)告) ，我們建議您將它另存新檔 file save as，以備后需，分析其它檔案便輕而易舉。精品.精品.4.3直方圖之統(tǒng)計(jì)分析（單色）1. 從屏幕上方file 菜單中選擇new。桌面會(huì)出現(xiàn)一u

34、ntitled 實(shí)驗(yàn)文件，可點(diǎn)擊實(shí)驗(yàn)文件的右上角的放大鈕，將實(shí)驗(yàn)文件窗口放大。2. 從工具板中點(diǎn)擊散點(diǎn)圖圖示。在實(shí)驗(yàn)文件的空白區(qū)點(diǎn)擊，然后拖曳對角線至適當(dāng)大小。plot 拖曳完成后可以在右方看到dot plot對話框。3. 在dot plot方框中，plot source應(yīng)預(yù)設(shè)為analysis，可點(diǎn)擊 select file 鈕，并用隨后之方框來開啟預(yù)存之 sample files，它們的路徑位于mac hd：bd applications：cellquest folder：sample files。連續(xù)雙擊鼠標(biāo)來打開次目錄，找到檔案后，點(diǎn)擊 open來開啟 norm001 檔案。x 與 y

35、 參數(shù)項(xiàng)會(huì)出現(xiàn)默認(rèn)值fsc-h 256 與 ssc-h 256，在color方框中點(diǎn)擊multicolor gating，確認(rèn)無誤之后，點(diǎn)擊 ok 便完成了一個(gè) norm001 的 fsc /ssc散點(diǎn)圖。精品.4. 工具板中選擇多角形區(qū)隔工具，將cursor 移至fsc/ssc散點(diǎn)圖上，并沿著淋巴球聚落周邊畫出范圍，連點(diǎn)擊兩次可關(guān)閉該區(qū)域。你已完成 r1區(qū)域的界定，我們將以此區(qū)域來圈選淋巴細(xì)胞。(如果要?jiǎng)h除r1區(qū)域，您可以在工具列中點(diǎn)選gates region list，以鼠標(biāo)點(diǎn)選 r1，再按delete 鍵刪除r1 區(qū)域。刪除r1區(qū)域后，可用繪圖工具板，重畫r1。)5. 從plots菜單中

36、選擇histogram，屏幕上會(huì)出現(xiàn)一 histogram 對話方框。點(diǎn)擊 select file 鈕，再點(diǎn)擊 open來開啟 norm001 檔案。說明：直方圖（histogram）表明一個(gè)參數(shù)與細(xì)胞數(shù)量之間的關(guān)系，在圖中，橫坐標(biāo)x軸為熒光或光散射強(qiáng)度的相對值，單位是道數(shù)（channel number），縱坐標(biāo)y軸則通常表示細(xì)胞出現(xiàn)的頻率，即相對細(xì)胞數(shù)。6. 點(diǎn)擊 parameter 鈕來顯示 norm001 檔案中所有的參數(shù)項(xiàng)，將參數(shù)項(xiàng)改成fl2-h 256 gamma-2。從gate輸入欄中將 no gate 改成g1= r1，點(diǎn)擊 ok 便完成了一個(gè)以g1圈選的 fl2直方圖，圖形的

37、x 軸為橙黃色熒光強(qiáng)度，y 軸為細(xì)胞頻率，norm001 檔案為本組實(shí)驗(yàn)之陰性對照組，我們將以之來界定陰性與陽性之界限。7. 從屏幕左列工具板中，選取 histogram marker 工具，然后在圖的左緣處點(diǎn)擊并拖曳至定點(diǎn)，一般而言是陰性信號的右緣。放開鼠標(biāo)后即完成marker 1(m1)。重復(fù)前述步驟以增畫另一marker，一般而言 m2 始自 m1 的右緣，終于圖的右界。8. fl2 直方圖現(xiàn)在被區(qū)隔出兩個(gè)區(qū)域，欲計(jì)算各區(qū)域中細(xì)胞的數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)，可從 stats 指令欄中選擇 histogram stats。精品.打印報(bào)告、輸出統(tǒng)計(jì)數(shù)值9. 從屏幕上方file菜單中選擇print one，可

38、以打印工作中實(shí)驗(yàn)文件。10. 點(diǎn)選四象限統(tǒng)計(jì)表，從屏幕上方file菜單中選擇export statistics可輸出統(tǒng)計(jì)數(shù)值至excel檔案。在出現(xiàn)方框中命名檔案，并決定欲存放檔案匣，點(diǎn)擊save。4.3 開啟其它list mode data11. 如欲接著分析存在同一檔案匣之系列檔案，可用鼠標(biāo)以拖曳方式選取所有圖表 (文件中所有圖譜的四角會(huì)出現(xiàn)黑色方塊，表示被選擇上) ，接著從plots菜單選擇next data file，軟件會(huì)自動(dòng)以新檔案來替換現(xiàn)有檔案，您只要確認(rèn)圈選范圍、與 quadrant marker 的位置是否恰當(dāng)，即可打印報(bào)告、或輸出統(tǒng)計(jì)數(shù)值。12. 對于存在不同檔案匣之系列檔

39、案，可用鼠標(biāo)以拖曳方式選取所有圖表 (文件中所有圖譜的四角會(huì)出現(xiàn)黑色方塊，表示被選擇上) ，接著從plots菜單選擇change data files，并在隨后出現(xiàn)之對話方框，選擇所在新目錄與欲分析檔案。點(diǎn)擊open?？烧{(diào)整圈選區(qū)域，markers界限，軟件會(huì)重新計(jì)算、統(tǒng)計(jì)報(bào)告。精品.13. 常規(guī)使用之實(shí)驗(yàn)文件 (內(nèi)含散點(diǎn)圖、圈選區(qū)格、四象限分界、以及統(tǒng)計(jì)報(bào)告) ，我們建議您將它另存新檔 file save as，以備后需，分析其它檔案便輕而易舉。五、錯(cuò)誤信號、疑難排除5.1 儀器狀態(tài)（status）： 在cellquest菜單位于cytometer菜單中。用來在收取的任何時(shí)候查看流式細(xì)胞儀的

40、運(yùn)行狀態(tài)，以利解決儀器運(yùn)行中出現(xiàn)的問題。狀態(tài)：顯示儀器運(yùn)行模式not ready：激光器正在預(yù)熱、鞘液桶空、廢液桶滿。ready：樣本管放置在進(jìn)樣區(qū)，且支撐臂位于中位，樣本管加壓，儀器在run狀態(tài)。standby：儀器在standby 狀態(tài)、或儀器在run 狀態(tài)而無樣本管在進(jìn)樣區(qū)上、或支撐架位于側(cè)位、或樣本管未完全加壓。standby時(shí)儀器的雷射電源降低。5.2 常見故障排除程序5.2.1 樣品試管上不去 誤用不適合的試管。（請用bd falcon 352052） 試管支持架需調(diào)整。旋轉(zhuǎn)調(diào)整試管支持架（順時(shí)鐘向下、逆時(shí)鐘向上）。 bal seal 磨損。（汰換 bal seal）精品.5.2.

41、2 儀器處于n0t ready狀況檢查以下情況： 鞘液筒中的鞘液是否用完。 廢液筒中的廢液是否已裝滿。 開機(jī)需要5分鐘時(shí)間預(yù)熱。 鞘液筒的液面檢測器連接是否松動(dòng)、或未連接。5.2.3 儀器處于standby狀況（儀器失壓）如果儀器未加壓，上樣管放好后，雖然控制面板處于run模式，但儀器仍未能達(dá)到ready狀況，此時(shí)儀器仍處于standby狀況。這可能是由于鞘液筒蓋漏氣、壓力閥未加壓，樣本管不能被加壓等原因造成的壓力問題。此時(shí)，樣本不能良好地進(jìn)入流動(dòng)室，無法檢測。此時(shí)，檢查以下情況： 壓力閥未加壓。 鞘液筒是否漏氣（蓋緊鞘液筒蓋）。 樣本管是否有破損。 上樣針上的bal seal是否己磨損。 鞘

42、液筒上的藍(lán)色接頭是否連接好。5.2.4 儀器訊號噪聲過高鞘液過濾器中有氣泡，儀器記錄了氣泡產(chǎn)生的信號，造成了噪聲數(shù)據(jù)的干擾。氣泡還可以改變樣本流，造成檢測結(jié)果不理想；此時(shí)，儀器需要做prime，排除液路中的氣泡干擾。如果鞘液筒吸干了，應(yīng)該重新裝滿鞘液，然后先取下樣品管進(jìn)行5-10次prime，再換上3ml dh2o上樣管hi run 30分鐘，待鞘液流中的氣泡排除之后，再進(jìn)行樣本測定。5.2.5 計(jì)算機(jī)屏幕上見不到細(xì)胞顯示精品.檢查以下情況： 如果儀器一直處于standby狀態(tài)，則檢查system status。 如果status窗日顯示ready，則檢查樣本管中細(xì)胞濃度是否夠，上樣前是否混勻

43、了。 檢查實(shí)驗(yàn)的instrument settings是否正確。 檢查閾值是否設(shè)置過高，導(dǎo)致無法檢測目標(biāo)細(xì)胞群。 檢查cellquest軟件cytometer目錄下的status窗口，是否己被更新。如果未更新，說明儀器與計(jì)算機(jī)之間的通訊發(fā)生了故障，此時(shí)，應(yīng)關(guān)閉計(jì)算機(jī)和facscalibur，重新打開儀器，繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。 prime儀器液流，去除流動(dòng)室中可能存在的氣泡。若流動(dòng)室中存在氣泡，可能使樣本流的位置偏離激光束，導(dǎo)致無細(xì)胞信號。5.2.6 加樣針有鞘液反流檢查以下情況： 檢查上樣針外管是否安好，可以將外管旋下，向上推動(dòng)，重新擰緊。 更換上樣針上部的o型膠環(huán)。 檢查液流保存系統(tǒng)的真空幫浦是否工作。如果樣本管支撐架位于旁位時(shí)，聽不到真空幫浦的工作聲音，可能是真空幫浦停了，關(guān)閉facscalibur，再啟動(dòng)；移開支撐架時(shí)，如果馬達(dá)仍然不動(dòng)，請致電bd客戶服務(wù)部門尋求幫助。精品.實(shí)驗(yàn)文件1：2 color acq精品.實(shí)驗(yàn)文件2：2 color ana精品.表一、常用熒光染劑測量參數(shù)熒光染劑吸光波長(nm)熒光波長(nm)標(biāo)示抗體用染劑fluorescein, fitc490520phycoerythrin-r, pe495578peridinin-chlo