基因診斷與基因治療.ppt

1、第 二 十 一 章,基因診斷與基因治療 Genetic Diagnosis and Gene Therapy,基因變異致病類型,內(nèi)源基因的變異 由于先天遺傳背景的差異和后天內(nèi)、外環(huán)境的影響，人類的基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)的各個環(huán)節(jié)都可能發(fā)生異常，從而導(dǎo)致疾病,外源基因的入侵 如各種病原體感染人體后，其特異的基因被帶入人體并在體內(nèi)增殖而引起各種疾病,第一節(jié) 基因診斷Gene Diagnosis,一、基因診斷的概念、內(nèi)容和特點(diǎn),定義: 利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)和方法，直接檢測基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)水平是否正常，從而對疾病作出診斷的方法。 前提條件： 已明確疾病表型與基因型的關(guān)系,基因診斷的基本內(nèi)容,

2、檢測個體基因序列特征 基因突變分析 測定基因拷貝數(shù) 基因表達(dá)產(chǎn)物分析 測定是否存在外源基因,特點(diǎn): 1.以基因作為檢查材料和探查目標(biāo)，屬于“病因診 斷”，針對性強(qiáng)。 2.分子雜交技術(shù)選用特定基因序列作為探針，故具有很高的特異性。 3.由于分子雜交和聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)都具有放大效應(yīng)，故診斷靈敏度很高。 4.適用性強(qiáng)，診斷范圍廣。 5.檢測外源基因時，可以檢測出潛伏的病原體,基因變異致病類型,內(nèi)源基因的變異 由于先天遺傳背景的差異和后天內(nèi)、外環(huán)境的影響，人類的基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)的各個環(huán)節(jié)都可能發(fā)生異常，從而導(dǎo)致疾病,外源基因的入侵 如各種病原體感染人體后，其特異的基因被帶入人體并在體內(nèi)增殖而

3、引起各種疾病,二、基因診斷常用技術(shù)方法,限制性內(nèi)切酶譜分析法 DNA限制性長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism, RLFP)分析 等位基因特異寡核苷酸探針(allele specific oligonucleotide, ASO,一）核酸分子雜交技術(shù),Mst酶切位點(diǎn)(GCTNAGG,5,3,正?；?突變基因,1.15kb,1.35kb,鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析,0.2kb,1.15kb,1.35kb,正常人,突變攜帶著,患者,鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析,在人類基因組中，平均約200對堿基可發(fā)生一對變異，中性

4、變異導(dǎo)致個體間核苷酸序列的差異，稱為DNA多態(tài)性。不少DNA多態(tài)性發(fā)生在限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)上，酶解該DNA片段就會產(chǎn)生長度不的片段，稱為限制性片段長度多態(tài)性。在某一特定家族中，如果某一致病基因與特異的多態(tài)性片段緊密連鎖，就可利用這一多態(tài)性片段作為一種“遺傳標(biāo)志”，來判斷家庭成員或胎兒是否為致病基因的攜帶者,DNA限制性片段長度多態(tài)性（RFLP,RLFP分析法,二）聚合酶鏈反應(yīng) (PCR,PCR/單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析 (single strand conformation polymorphism, SSCP) PCR產(chǎn)物變性后，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，正?；蚝妥儺惢虻倪w移位置不同，借此可分析

5、確定致病基因的存在,正常人,純合突變,雜合突變,Leber 病患者 PCR/SSCP分析,PCR/等位基因特異寡核苷酸探針(allele specific oligonucleotide， ASO,三）基因測序 即測定DNA序列的技術(shù)。分離患者的有關(guān)基因，測定出堿基排列順序，找出其變異所在，是最確切的基因檢測方法。 目前用于測序的技術(shù)主要有Sanger等發(fā)明的雙脫氧鏈末端終止法和 Maxam和 Gilbert發(fā)明的化學(xué)降解法,四）基因芯片,基因芯片(gene chip)（又稱DNA芯片、生物芯片）通過與一組已知序列的核酸探針雜交進(jìn)行核酸序列測定的方法，在一塊基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探

6、針。當(dāng)溶液中帶有熒光標(biāo)記的核酸序列與基因芯片上對應(yīng)位置的核酸探針產(chǎn)生互補(bǔ)匹配時，通過確定熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的探針位置，獲得一組序列完全互補(bǔ)的探針序列。據(jù)此可重組出靶核酸的序列。 應(yīng)用領(lǐng)域:基因表達(dá)譜分析、基因突變及多態(tài)性分析、基因組文庫作圖、疾病診斷和預(yù)測、藥物篩選、基因測序等,三、基因診斷的應(yīng)用,遺傳性疾病 腫瘤 感染性疾病，傳染性流行病 判斷個體疾病易感性 器官移植組織配型 法醫(yī)學(xué)中個體識別、親子鑒定,第二節(jié) 基因治療Gene Therapy,定義 早期是指將外源正?；?qū)氚屑?xì)胞，整合入細(xì)胞基因組，糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常引起的疾病以達(dá)到治療的目的一種治療方法,目前廣義上來講是指將某種遺傳物

7、質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細(xì)胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，以達(dá)到治療疾病目的的方法。通過基因水平的操作而治療疾病的方法,一、基因治療的概念,1、基因修正（gene correction） 2、基因替代（置換） （gene replacement） 3、基因增強(qiáng)（補(bǔ)償） （gene augmentation） 4、基因抑制（gene constraint）和/或 基因失活（gene inactivation） 5、免疫基因治療 6、活化前體藥物基因（自殺基因）治療 7、耐藥基因治療,二、基因治療的策略,三、基因治療的種類,1、生殖細(xì)胞（germ cell）基因治療,理論上將正常細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移到患者的生殖細(xì)胞 （精細(xì)

8、胞，卵細(xì)胞早期胚胎）使其發(fā)育成正常個體。這是理想的治療方法，從根本上治療遺傳病，使其有害基因不能在人群中播散,2、體細(xì)胞（somatic cell）基因治療,是指將正?；蜣D(zhuǎn)移到體細(xì)胞，使之表達(dá)基因產(chǎn)物，以達(dá)到治療的目的。但有害基因能遺傳給后代,四、基因治療方式 一、體內(nèi)療法（in vivo、一步法） 將攜帶有治療基因的載體直接導(dǎo)入體內(nèi)有關(guān)的組織器官，使其進(jìn)入相應(yīng)的組織并進(jìn)行表達(dá)。 二、體外療法（ex vivo、二步法） 先把待接收基因的靶細(xì)胞從體內(nèi)取出，將攜帶有治療作用的載體導(dǎo)入培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)，篩選、增殖，再回輸體內(nèi)有關(guān)組織中,目的基因+載體 重組DNA 受體細(xì)胞 外源基因表達(dá)的篩選 回輸體內(nèi),

9、五、基因治療的基本程序,1、為致病基因 2、遺傳分子機(jī)制清楚 3、該基因已被克隆，一級結(jié)構(gòu)和表達(dá)調(diào)控機(jī) 制清楚 4、可在體外操作，而且安全有效 5、轉(zhuǎn)移基因能完整地、穩(wěn)定地整合，并能適時適量表達(dá),一）目的基因的選擇原則,1、基因組DNA文庫 2、cDNA（complementary DNA） 3、人工合成基因片段 4、PCR擴(kuò)增,目的基因的來源,二）受體細(xì)胞的選擇原則,1、最好選擇組織特異性細(xì)胞 2、容易取出 3、具有較長的壽命 4、離體細(xì)胞能高效導(dǎo)入目的基因 5、經(jīng)體外操作后能存活并安全回輸 常用的的受體細(xì)胞： 淋巴細(xì)胞、造血干細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、呼吸道上

10、皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞,三）載體的選擇和外源基因的導(dǎo)入,病毒載體 RNA病毒載體（逆轉(zhuǎn)錄病毒） DNA病毒：常用的有腺病毒、皰疹病毒、 SV40病毒、巨細(xì)胞病毒、 腺相關(guān)病毒、單純皰疹病毒等 非病毒載體 質(zhì)粒、脂質(zhì)體、受體介導(dǎo)的蛋白,目前應(yīng)用最多的最成功的是逆轉(zhuǎn)錄病毒，病毒感染細(xì)胞后，其基因組RNA 經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生雙鏈DNA拷貝，插入宿主染色體形成前病毒（provirus），前病毒轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的正鏈既是病毒RNA，再與前病毒編碼的外殼蛋白包裝成新的病毒顆粒。 完整的病毒顆粒具有插入宿主染色體必需的全套酶系統(tǒng)，適用于介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移,逆轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus,1、主要來自莫洛尼氏小鼠白血病病毒（Molo

11、ney murine leukemia virus，MoMLV）其中三個結(jié)構(gòu)基因（gag、pol、env）被刪除 2、標(biāo)記基因（marker gene）插入空缺，供陽性選擇用。如：新霉素抗性基因（neomycin resistant gene），該基因編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（NPT），能對抗新霉素（G418）。 3、有目的基因的插入位點(diǎn),逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的優(yōu)點(diǎn),1.可插入足夠長的外源DNA（7KB） 2.基因轉(zhuǎn)移效率高，幾達(dá)100% 3.重組體可整合入宿主染色體，并穩(wěn)定表達(dá)和傳代 4.宿主范圍廣、比較安全,缺點(diǎn),1.只能整合入分裂活躍的細(xì)胞 2.靶細(xì)胞表面需要有特殊的受體 3

12、.必須使用帶有“輔助病毒”的包裝細(xì)胞系 4.病毒滴度低,包裝細(xì)胞：一種細(xì)胞，重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只能在其中包裝成沒有感染能力的病毒顆粒，但能從中釋放出去，這種細(xì)胞即包裝細(xì)胞。 1.多數(shù)由各種輔助病毒轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細(xì)胞系 NTH3T3構(gòu)成。 2.輔助病毒由MoMLV切除了病毒5端LTR至Gag起始密碼之間包裝信號等序列，雖能產(chǎn)生病毒蛋白但不能進(jìn)行包裝。 3.導(dǎo)入的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)錄出的RNA可以利用輔助病毒產(chǎn)生的病毒蛋白包裝成假病毒顆粒,包裝細(xì)胞系,四）外源基因表達(dá)的篩選 在較多的表達(dá)載體中都有neor標(biāo)記基因存在，若向培養(yǎng)基中加入藥物G418，未被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞不存在neor標(biāo)記基因，細(xì)胞不能存活，

13、最后只有轉(zhuǎn)化細(xì)胞存活下來,五） 回輸體內(nèi),1.選擇合適的疾?。簡位蜻z傳病 2.具備該病分子缺陷的知識 3.有目的基因的克隆 4.克隆基因的有效表達(dá) 5.克隆基因的有效調(diào)節(jié) 6.可利用的動物模型,遺傳病基因治療的必要條件,四、基因治療的應(yīng)用,一）遺傳病的基因治療,基因治療的部分對象,1.嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷癥（腺苷脫氨酶ADA缺乏） 2.囊性纖維變性 3.Gaucher病型（葡糖腦苷脂酶缺陷） 4.苯丙酮酸尿癥（苯丙氨酸羥化酶缺陷） 5.血友病B（凝血因子缺陷） 6.家族性高膽固醇血癥 7.地中海貧血,1.宿主的修飾：保護(hù)分裂旺盛的正常組織，如造血干細(xì)胞：導(dǎo)入二氫葉酸還原酶基因，獲得對氨甲蝶呤的抗性 2.增強(qiáng)腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL）活性： 如將腫瘤壞死因子（TNF）基因?qū)隩IL。這是目前腫瘤基因治療最常用的方法。 3.腫瘤細(xì)胞的修飾,二）腫瘤的基因治療,如： 自殺基因 + 病毒載體 轉(zhuǎn)染 重組載體,藥物前體 (無毒) Gene酶 藥物復(fù)合物(有毒,細(xì)胞死亡,例如： 單純皰疹病毒 哺乳動物細(xì)胞 HSV Gene-TK （在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，正常細(xì)胞中不表達(dá)） GeneTK GCV（胸苷類似物） TdR P p GCV-p 抑制DNA合成 脫氧胸苷酸 腫瘤細(xì)胞死亡 鄰近細(xì)胞死亡/凋亡（旁觀者效應(yīng),三）艾滋病的基因治療 （四）心血管疾病、