山羊抗小鵝瘟高免血清的制備及臨床試驗

1、山羊抗小鵝瘟高免血清的制備及臨床應用試驗王文強1，王開功2，田新平 3（1.銅仁職業(yè)技術學院，貴州銅仁；2.貴州大學動物科學學院，貴陽花溪3.；銅仁市畜牧獸醫(yī)局，貴州銅仁）摘要小鵝瘟是雛鵝感染鵝細小病毒 (Goose plaguevirus，GPV)，所引起的一種急性敗血型傳染病。本病病程短而且死亡率高，主要侵害1月齡以內的雛鵝和雛番鴨。10日齡以下的雛鵝發(fā)病后，其死亡率可能高達100%。目前，許多養(yǎng)鵝場大多使用市場上銷售的抗小鵝瘟血清對鵝進行免疫和治療，但是市場上銷售的抗小鵝瘟血清其產量低、成本高，且容易導致某些鵝源疫病的傳播。本文采用從貴州麻江縣等地的養(yǎng)鵝場采集的病鵝分離出的小鵝瘟野生強毒

2、株接種于9日齡的鵝胚尿囊液制備了小鵝瘟病毒抗原，并用小鵝瘟病毒抗原加弗氏佐劑后，分多次皮下注射結合靜脈注射小鵝瘟病毒抗原免疫貴州黑、白山羊。頸動脈一次性放血制備抗小鵝瘟異源高免血清，用瓊脂擴散進行效價的測定，結果顯示其抗體效價平均都在18以上。將制備的血清與市售的抗小鵝瘟進行了對比試驗，結果市售的抗小鵝瘟血清的保護率為85%，山羊抗小鵝瘟高免血清的保護率為95%。山羊抗小鵝瘟異源高免血清具有效價高、成本低、安全性好等優(yōu)點。關鍵詞：小鵝瘟；山羊抗小鵝瘟高免血清；抗小鵝瘟血清；對比試驗小鵝瘟又稱為Derzsys病、 鵝流感、 鵝肝炎、 鵝傳染性心肌炎、鵝腸炎、鵝腹水性肝腎炎，它是由小鵝瘟病毒 （G

3、oose plague virus)，即鵝細小病毒(Gooseparvovirus , GPV)引起小鵝和雛番鴨的一種急性或亞急性、敗血性、高度接觸性、傳染性強、病程短且死亡率高的傳染病1-4。根據(jù)貴州畜疫病志和貴州大學王開功教授9報道，2001年3月，貴州省惠水、三都、修文等縣的養(yǎng)鵝場雛鵝發(fā)生了一種疫病，病鵝的臨床癥狀和病理變化與國內的殷震和國外的Gough R. E等人10-14報道的小鵝瘟很相似。貴州大學動物科學學院疫病實驗室對從患病的鵝群中采集的病鵝心、肝和脾等組織觸片染色鏡檢未見細菌，同時接種血瓊脂平板作需氧和厭氧培養(yǎng)，結果為陰性。隨后將病料進行處理接種于15日齡鵝胚尿囊腔，分離到一

4、株小鵝瘟野生強毒，同時證明了貴州省已經有本病的存在。隨著貴州省養(yǎng)鵝業(yè)的迅猛發(fā)展，小鵝瘟的發(fā)生和流行，對貴州省的養(yǎng)鵝業(yè)造成了巨大的威脅。大多數(shù)養(yǎng)殖場鵝病的發(fā)生集中在每年的34月份；3周齡的小鵝易發(fā)??；發(fā)病率為80%，死亡率高達90%100%。雖然一些主要的養(yǎng)鵝場對一日齡的小鵝用抗小鵝瘟血清進行了免疫，但是隨著鵝體內抗體的消長和許多養(yǎng)殖場種鵝的免疫程序還不完善，小鵝瘟還是存在著威脅。應用高免鵝制備的血清可以對小鵝瘟進行很好的預防和治療，但是由于利用成年鵝制備高免血清產量低而且成本很高, 難以滿足生產上的需要。所以我們從生產實際出發(fā)，參考了國內外的一些經驗和技術，用從養(yǎng)殖場的病鵝分離出的小鵝瘟毒株，

5、將病毒接種鵝胚進行病原的增殖，收集到的尿囊液，制作了小鵝瘟病毒抗原，采用多次免疫和頸動脈一次性采血的方法制造出了適合我省預防和治療小鵝瘟的山羊抗小鵝瘟異源高免血清，并與中牧實業(yè)股份有限公司成都藥械廠生產的抗小鵝瘟血清進行了對比試驗。對防治鵝細小病毒感染的發(fā)生和流行，保障貴州省養(yǎng)鵝業(yè)的健康發(fā)展具有重要的意義。1 材料與方法1.1材料1.1.1 毒株 用從貴州省惠水、三都等縣的養(yǎng)殖場的病鵝采的心、肝、脾等病料分離出了小鵝瘟野生強毒株，由本實驗室凍干保存。1.1.2 胚胎 9日齡的鵝胚由實驗室購自烏當養(yǎng)殖場未經免疫的鵝蛋在本實驗室自行孵化。1.1.3 樣本 小鵝瘟標準抗原和陽性血清由揚州大學動物醫(yī)學

6、系王永坤教授惠贈；免疫鵝血清系采用小鵝瘟弱毒疫苗人工免疫成年鵝制備；其它常見禽病血清如新城疫病毒(NDV) 、馬立克病毒(MDV) 、減蛋綜合癥病毒( EDSV) 和傳染性法氏囊病毒( IBDV) 均由本實驗室提供；禽流感病毒（AIV）血清購自哈爾濱獸醫(yī)研究所。1.1.4 試驗用山羊 購于清鎮(zhèn)養(yǎng)羊場，一頭貴州黑山羊和一頭貴州白山羊，體重30kg以上,臨床檢查健康。1.1.5 試驗用雛鵝 由銅仁市川主科技助農有限公司提供。1.1.6 抗小鵝瘟血清 中牧實業(yè)股份有限公司成都藥械廠生產，生產批號為獸藥生產（2007）。1.2 方法1.2.1小鵝瘟抗原的制備 取病毒感染鵝胚的尿囊液，經4000rpm離

7、心10min,去除細胞碎片，收集上清液。于上清液中加入等量氯仿，強烈振搖，經4000rpm離心10min，舍去有機相和中間界面的雜質，收集上層水相。反復抽提34次，直至兩相界面清晰。在水相中緩慢加入質量濃度400g/L的聚乙二醇（MW6000），使其終質量濃度達60g/L，調節(jié)氯化鈉的質量濃度達22g/L，4靜置過夜，第二天后經過10000rpm離心30min,舍去上清液，收集病毒沉淀物。取0.01mol/L的PBS (pH7. 2)適量懸浮病毒沉淀，加入0.1%的甲醛滅活后，即為尿囊液病毒抗原。正常鵝胚尿囊液的抗原制備同上述試驗方法。1.2.2小鵝瘟抗原的檢測 揚州大學提供的小鵝瘟診斷抗原、

8、本次試驗制備的尿囊液病毒抗原、正常鵝胚尿囊液抗原,分別與小鵝瘟陽性血清、免疫鵝血清、PBS 作瓊脂擴散試驗。同時取小鵝瘟病毒抗原分別與GPV、NDV、MDV、AIV、EDSV、IBDV 的血清進行瓊脂擴散試驗。1.2.4山羊抗小鵝瘟高免血清的制備與檢驗1.2.4.1 山羊的免疫 每頭山羊第一次皮下注射4ml病毒液弗氏不完全佐劑的小鵝瘟油佐劑疫苗；7天后進行第二次注射，每頭山羊皮下注射4ml病毒液弗氏完全佐劑的小鵝瘟油佐劑疫苗；再過7天后進行第三次注射，每頭山羊頸部皮下注射小鵝瘟抗原4ml/只；過7天后進行第四次免疫，每頭山羊頸靜脈注射小鵝瘟抗原4ml/只。每次注射之前都要抽血檢驗抗小鵝瘟高免血

9、清的效價。1.2.4.2抗小鵝瘟血清的制備 按照免疫程序完成的山羊，經過采血檢驗血清效價達到規(guī)定標準時采血。一般血清抗體效價高峰在最后一次免疫后的711天。采血前一天不喂飼料，只喂飲水，并在上午空腹的時候采血，以防血脂過高。采血時是在無菌環(huán)境下采用頸動脈一次性放血，以免所制備的血清受到污染。將收集到的血液靜置于室溫下等待其自然凝固析出血清。血清沒有完全析出的可以將血液置于4冰箱內讓其完全析出。將分離的血清用離心機離心10000rpm離心10分鐘，分離的血清加生理鹽水稀釋使稀釋后血清抗體效價達到16, 然后每毫升血清加青霉素、鏈霉素各1 000 IU , 再按0. 1加入硫柳汞, 充分振蕩搖勻,

10、 分裝于滅菌瓶中密封,貼上標簽。 保存在-15冰箱中備用。1.2.4.3抗體效價測定 瓊脂板制備：稱取1g瓊脂粉，加至100ml 8.5%的高滲鹽水中，煮沸使之溶解。待溶解的瓊脂溫度降至55左右的時候澆玻璃平板，每個平板澆灌的瓊脂厚度約為2mm，待瓊脂平板完全凝固后，用打孔器在瓊脂凝膠上打梅花孔，打孔之前先用一張紙做好樣本后墊在瓊脂平板下面，孔徑為2mm，中間孔和周圍孔間的距離大約為3mm。打完孔之后將瓊脂平板在酒精燈上加熱封底。在第四次免疫后的第七天，自頸靜脈按10mL/只采血。用離心機分離血清后，將小鵝瘟高免血清作2倍比稀釋，按照1：2、1：4、1：8、1：16、1：32等進行稀釋，將稀釋

11、的血清分別加至周圍孔中，中間孔加小鵝瘟瓊擴抗原，每組還要在周圍孔加標準的陰性和陽性血清對照。加完樣后將瓊脂平板置于濕盒內，37放置2448小時后觀察，結果顯示貴州黑山羊和貴州白山羊的抗體效價平均都在18以上。1.2.5 山羊抗小鵝瘟高免血清的安全試驗 試驗之前先對血清進行無菌檢驗，取1ml的抗小鵝瘟高免血清，接種于新鮮血瓊脂培養(yǎng)基上，經過37培養(yǎng)24小時，觀察有無細菌的生長，結果為陰性時才可以用。選擇1日齡小鵝16只分為四組，腹腔注射組，腹腔注射對照組，皮下注射組，皮下注射對照組，每組4只，腹腔注射組注射高免血清0.4mL/只 ，腹腔注射對照組腹腔注射生理鹽水0.4mL/只。皮下注射組皮下注射

12、高免血清0.6mL/只， 皮下注射對照組皮下注射生理鹽水0.6ml/只，注射后觀察小鵝有無異常反應，并連續(xù)觀察20天。1.2.6小鵝瘟病毒半數(shù)致死量的測定 將病毒懸液加PBS進行10倍稀釋，制成10-1的小鵝瘟病毒稀釋液。隨后將10-1的稀釋液稀釋成10-2、10-3、10-4不同稀釋度的病毒。具體操作如下：取3支滅菌試管排列于試管架上，并放于冰槽中，每一支試管內加4.5毫升滅菌的PBS，用無菌的注射器吸取10-1的小鵝瘟病毒稀釋液0.5毫升，加入第1支試管內，棄去此注射器，將第1管內的液體混勻，成為10-2病毒稀釋液；又取一注射器吸取10-2的病毒稀釋液0.5毫升，加入第2支試管內，使成10

13、-3病毒稀釋液；根據(jù)這種做法稀釋10-4的小鵝瘟病毒稀釋液。然后將所得的各種稀釋度的小鵝瘟病毒感染3日齡的雛鵝，由用原病毒感染開始，每個稀釋度感染雛鵝10只。每只雛鵝接種小鵝瘟病毒0.2ml/只。觀察15天，記錄雛鵝死亡的數(shù)量。1.2.7 對比試驗 1.2.7.1試驗用的材料取體重相等的一日齡雛鵝60只、用小鵝瘟病毒在鵝胚上傳四代收集的尿囊液、生理鹽水（六枝工礦集團大華藥業(yè)有限公司）、本實驗室研制的山羊抗小鵝瘟高免異源血清、市售抗小鵝瘟血清（中牧實業(yè)股份有限公司成都藥械廠生產；預防量：0.5ml/只；治療量：11.5ml/只）、注射用青霉素鈉80萬單位（中諾藥業(yè)石家莊有限公司）、注射用硫酸鏈霉

14、素100萬單位（濟寧市洸府獸藥廠）、一次性注射器10ml 、2.5ml、1ml 的若干個。試驗之前先將購買的生理鹽水加熱煮沸6分鐘，冷卻后備用。1.2.7.2小鵝瘟病毒尿囊液的稀釋用10ml的一次性注射器抽取10ml尿囊液加90ml生理鹽水稀釋10倍；在稀釋10倍的尿囊液中加青霉素、鏈霉素各1000單位每毫升。用1ml的一次性注射器抽取1ml尿囊液加生理鹽水100ml稀釋100倍；在稀釋100倍的尿囊液中加青霉素、鏈霉素各1000單位每毫升。1.2.7.3操作過程選體重相等的1日齡雛鵝60只，隨機分為（A、B、C）3組每組20個。分組后將雛鵝隔離飼養(yǎng)，每組再分兩小組，每組10只，并用紅油漆做好

15、標志。用紅外燈炮給小鵝保溫。A組全部腿部皮下注射抗小鵝瘟血清0.6ml/只；B組全部腿部皮下注射山羊抗小鵝瘟高免血清0.6ml/只；C組全部腿部皮下注射生理鹽水0.6ml/只。第二天對每組的第1小組的小鵝皮下注射稀釋10倍的尿囊液0.2ml每只；每組的第2小組皮下注射稀釋100倍的尿囊液0.5ml每只。觀察每組小鵝的發(fā)病情況和死亡數(shù)量，觀察20天。2 結果與討論2.1結果2.1.1 小鵝瘟病毒的傳代增殖的結果用小鵝瘟野生強毒XW株通過在鵝胚上傳四代，收集了4896小時死亡的鵝胚尿囊液后，將胚體取出和正常的同日齡的鵝胚進行對照，結果見表2.1。對收集的尿囊液做的細菌檢驗，結果都為陰性。表明接種的

16、胚體不是因為細菌感染死亡，而且收集的尿囊液沒有細菌的生長。多數(shù)感染鵝胚死于7296小時之間,未接種病毒的對照組鵝胚健康存活。與對照鵝胚相比較,感染胚的肝由紅褐色變?yōu)橥咙S色,嚴重病例可見壞死灶;心肌色澤變淡,甚至顯現(xiàn)瓷白色。胚胎發(fā)育阻滯,胚體充血出血,這是禽類病毒感染胚胎的普遍現(xiàn)象;“肝土黃色,心肌蒼白”是小鵝瘟病毒感染胚胎的特征性病變。全部收集的尿囊液用雞紅細胞做了血凝實驗均未顯示出血凝特性,表明分離的毒株,沒有污染禽副黏病毒。3只鵝胚在1824小時內死亡是因為在接種尿囊液的時候針頭不小心刺破血管和胚體，導致鵝胚的死亡。表2.1 小鵝瘟野生強毒經鵝胚增殖的結果代次接種數(shù)死亡數(shù)死亡率（%）死亡時

17、間（d）胚胎病變血凝細菌檢驗F1221985.0（17/20）24發(fā)育阻滯F2201579.0（15/19）24胚體出血F32525100（25/25）24心肌蒼白F42828100（28/28）24肝土黃色注：“”表示無血凝現(xiàn)象；無細菌生長。有3只鵝胚在1824小時內死亡。2.1.2 尿囊液中病毒抗原的檢測結果采用小鵝瘟陽性血清、免疫鵝血清、PBS 分別檢測本次試驗制備的小鵝瘟病毒抗原、正常鵝胚尿囊液抗原，試驗結果見表2.2。采用小鵝瘟陽性血清、免疫鵝血清、PBS 分別檢測本次試驗制備的小鵝瘟病毒抗原、正常鵝胚尿囊液抗原,結果本次試驗制備的小鵝瘟病毒抗原與揚州大學提供的小鵝瘟陽性血清、免疫鵝

18、血清出現(xiàn)沉淀線,與PBS呈陰性反應，而且形成沉淀線與小鵝瘟診斷抗原相吻合,正常鵝胚尿囊液抗原與各血清均呈陰性反應。將小鵝瘟病毒抗原與GPV血清、其他禽類病毒的血清做交叉試驗，試驗結果見表2.3。交叉試驗顯示制備的小鵝瘟病毒沉淀抗原只與小鵝瘟陽性血清形成沉淀線，而與其它常見禽類病毒GPV、NDV、MDV、AIV、EDSV、IBDV 的血清不發(fā)生交叉反應。表2.2 小鵝瘟病毒抗原的檢測結果檢測樣本小鵝瘟標準抗原分離毒XW抗原正常鵝胚抗原小鵝瘟陽性血清+-免疫鵝血清+-PBS-注：“+”表示出現(xiàn)沉淀線；“-”表示未出現(xiàn)沉淀線。表2.3 小鵝瘟病毒抗原與常見禽病血清的交叉反應檢測樣本 GPV血清 ND

19、V血清 MDV血清 AIV血清 EDSV血清 IBDV血清小鵝瘟病 + - - - - -毒抗原注：“+”表示出現(xiàn)沉淀線；“-”表示未出現(xiàn)沉淀線。2.1.3 安全試驗的結果用山羊抗小鵝瘟高免血清接種1日齡雛鵝，觀察雛鵝有無異常反應，結果見表2.5。經過20天的觀察試驗的雛鵝沒有出現(xiàn)不良反應。表2.5 山羊抗小鵝瘟高免血清的安全試驗結果組別只數(shù)日齡注射方式用量反應 情況實驗組41腹腔注射0.4ml無不良反應對照組41腹腔注射0.4ml無不良反應實驗組41皮下注射0.6ml無不良反應對照組41皮下注射0.6ml無不良反應2.1.4 小鵝瘟病毒半數(shù)致死量的試驗結果用PBS對小鵝瘟病毒尿囊液進行稀釋成

20、10-1、10-2、10-3、10-4后感染3日齡的雛鵝15天后得到的結果見表2.4。由于一雛鵝接種10-3稀釋度的小鵝瘟病毒液仍然能夠生存，則這一雛鵝在接種10-4的小鵝瘟病毒稀釋液時也應當能生存，所以在積累總計欄內，各組應當存活的雛鵝的總數(shù)，是由接種較高濃度的病毒稀釋液而生存的雛鵝數(shù)，向接種較低濃度的病毒稀釋液而生存的雛鵝數(shù)累加而得的，如表2.4中箭頭所指的方向。相反的，如果一雛鵝死于10-3稀釋液的，則這一雛鵝也應死于接種10-2、10-1等比較濃的小鵝瘟病毒稀釋液，所以統(tǒng)計死亡的雛鵝的數(shù)量時，是由接種較低濃度的病毒稀釋液致死的數(shù)目，向接種較高濃度的病毒稀釋液致死的數(shù)目累加而得的，如表2

21、.4中箭頭所指的方向。LD50值的計算：由表2.4可以知道此小鵝瘟病毒能夠致死半數(shù)雛鵝死亡的稀釋度介于10-210-3之間，而且比較接近于10-2這個稀釋度。其計算方法如下：距離比例=（高于50%的死亡百分數(shù)50）/（高于50%的死亡百分數(shù)低于50%的死亡百分數(shù)）距離比例=（6250）/（6213）=12/49=0.245高于50%死亡的稀釋度的對數(shù)（即Log102）=2距離比例（0.245）稀釋系數(shù)（10）的對數(shù)（即Log10）=0.2452+0.245=2.245，約為2.5，即為此小鵝瘟病毒的半數(shù)致死量，意思是指此小鵝瘟病毒的10-2.5的稀釋液可以使一批雛鵝在皮下接種0.2毫升后有50

22、%死亡。表2.4 以不同稀釋度的小鵝瘟病毒接種雛鵝的死亡情況病毒稀釋度接種鵝數(shù)健鵝數(shù)死鵝數(shù)積累總計死亡比例死亡率活 死原液10 01002727/27100%10-1101911717/1894%10-21046588/1362%10-310821322/1513%10-41010 02300/230%2.1.5 山羊抗小鵝瘟高免血清與市售抗小鵝瘟血清的對比試驗結果取本實驗室制備的山羊抗小鵝瘟高免血清與中牧實業(yè)股份有限公司成都藥械廠生產的抗小鵝瘟血清進行的對比試驗結果見表2.6。試驗結果顯示，對照組C組的20只雛鵝在攻毒后的第710天內共死亡18只，有1只耐過，有1只由于雛鵝的相互擠壓被壓死，

23、死亡率為95%（18/19），而且死亡的雛鵝從外觀的臨床癥狀和剖解的病例變化都與國內外報道的小鵝瘟的臨床癥狀和剖解的病例變化很相似（見附圖），功毒成功。A組的20只雛鵝在注射了市售的抗小鵝瘟血清在攻毒后的1011天內共死亡3只，保護率為85%（17/20）。B組的20只雛鵝注射山羊抗小鵝瘟高免血清的保護組在攻毒后的15天死亡1只，保護率為95%（19/20）。表2.6 山羊抗小鵝瘟高免血清與市售抗小鵝瘟血清的對比實驗結果組別只數(shù)日齡抗小鵝瘟血清異源高免血清生理鹽水攻毒保護死亡稀釋倍數(shù)用量只數(shù)百分率只數(shù)百分率A1010.6-100.2880%220%1010.6-1000.5990%110%B1

24、01-0.6-100.2990%110%101-0.6-1000.510100%00%C101-0.6100.200%9100%101-0.61000.511%990%注：“-”表示沒有注射；第三組的第1小組有一只雛鵝在育雛舍內被壓死。2.2 討論2.2.1 在貴州省惠水、三都等縣的養(yǎng)鵝場的雛鵝發(fā)生的疫病與國內外報道小鵝瘟的臨床癥狀和病理變化都很相似。開始時是零星發(fā)病，兩天后大面積爆發(fā)；患病小鵝的日齡最早為3日齡，最晚到30日齡；發(fā)病率為80%，死亡率高達100%。病鵝臨床癥狀主要表現(xiàn)為：精神沉郁，無力，常臥地不起；少食或拒食，飲欲下降；甩頭，口鼻流出無色粘液，咳嗽；拉白色或黃白色稀糞，肛門四

25、周被白色稀糞污染；發(fā)病后12天死亡，瀕死期病鵝飲欲、食欲廢絕；呼吸困難，倒地抽搐死亡。對病死的小鵝進行剖檢時發(fā)現(xiàn)：口腔、鼻腔中蓄積大量無色粘液；膽囊充盈，膽汁外溢；肝臟腫大且色深，質脆，部分病鵝肝有大小不等灰白色的壞死灶；心肌及冠狀脂肪有針尖狀出血點；十二指腸粘膜呈彌漫性出血；特征性的病變是小腸發(fā)生急性卡他性纖維素性腸炎，特別是回腸部的腸段，整段腸粘膜壞死脫落，與纖維素性滲出物凝固形成栓子或假膜包裹腸內容物，呈香腸樣栓塞；盲腸扁桃體腫大出血；泄殖腔粘膜輕度出血且腔內潴留少量黃白色液體；腎臟腫大，表面有針尖大小出血點；腦膜充血，有少量出血點。鵝群發(fā)病后曾以禽霍亂疫苗緊急免疫，并用青霉素、鏈霉素、

26、土霉素等抗菌素及磺胺類藥物進行治療，均未見療效。本實驗室對從患病的鵝群中采集的病料做細菌檢驗，并接種鵝胚，將待檢抗原與標準提純抗小鵝瘟IgG、標準抗小鵝瘟陽性血清、標準抗新城疫陽性血清、標準抗傳染性法氏囊陽性血清、健康鵝對照血清及生理鹽水作瓊脂雙向擴散試驗。隨后將收集的尿囊液人工感染5日齡雛鵝試驗，結果對照組的雛鵝全部存活，而實驗組的雛鵝全部死亡，而且臨床癥狀與自然感染的小鵝瘟病例基本一致。確診此次疫病是由小鵝瘟病毒感染引起的。2.2.2 采用小鵝瘟分離毒XW株通過非免疫鵝胚傳代增殖,取感染鵝胚尿囊液制備小鵝瘟病毒抗原。關于小鵝瘟病毒抗原的制備國內資料報道了4 種方法。王永坤14等將感染的尿囊

27、液裝入透析帶經硅膠濃縮；郝虹15等采用質量濃度400g/ L 飽和度的硫酸銨鹽析處理；王新海16通過差速離心法提取抗原；程由銓17等使用聚乙二醇( PEG) 沉淀病毒。硅膠反透析是一種簡單的濃縮處理，不能有效地除去雜蛋白質。按照病毒學的理論，病毒一般在質量濃度450g/ L 以上飽和度的硫酸銨鹽析中發(fā)生沉淀，400g/ L 的飽和度似不可取18。差速離心法需要使用40000r/ min 的轉速，這不是普通實驗室的離心設備所能達到的水平。本實驗室已經采用PEG(MW6000) （水溶性的非離子型聚合物）法成功制備出了小鵝瘟病毒抗原。該抗原在瓊脂擴散的試驗中能夠與小鵝瘟陽性血清出現(xiàn)沉淀線，而且與小

28、鵝瘟標準抗原的沉淀線相吻合，而且與其它常見禽病血清不發(fā)生交叉反應。試驗結果表明，本次制備的小鵝瘟病毒抗原可以用于臨床免疫效果監(jiān)測和流行病學調查，對貴州省小鵝瘟的研究、診斷和防制具有實用價值。2.2 .3 用于預防小鵝瘟病毒感染雛鵝常用疫苗主要分為種鵝用和雛鵝用兩種疫苗。疫苗又分為鵝胚強毒疫苗和鴨胚化弱毒疫苗兩種。前者用強毒鵝胚培養(yǎng)物作疫苗，由于是強毒疫苗，因此僅限于小鵝瘟流行地區(qū)使用；后者是由強毒株經鴨胚傳代后毒力致弱育成的，弱毒疫苗免疫原性好，保護率高，在實際生產中發(fā)揮很大的作用。預防小鵝瘟最有效、最經濟的方法還是產蛋前免疫母鵝，使母鵝獲得被動免疫。Kisary19氏研究指出，產蛋母鵝免疫初

29、期產生IgM，進而產生IgG，半衰期為6天，但是雛鵝1周齡時抗體完全消失，以后就可能感染小鵝瘟。母源抗體使用強毒株疫苗對鵝進行免疫，可產生較高水平的母源抗體，但有造成強毒株擴散的危險；弱毒株疫苗又存在可能因不穩(wěn)定而發(fā)生毒力返強現(xiàn)象，造成嚴重的潛伏感染和排毒的危險。所以小鵝瘟的預防和治療目前主要依靠抗血清和卵黃抗體。小鵝瘟抗血清分為同源(鵝血清)20和異源(羊、馬、牛等血清)21-23抗血清。同源血清特異性高、可用作預防和治療，但其產量低、成本高，且容易導致某些鵝源疫病的傳播。近幾年來, 不斷有人研制了山羊、奶山羊和黃牛抗小鵝瘟高免血清, 應用于小鵝瘟的預防和治療,獲得了較好的效果。但是異源血清

30、對鵝體而言是一種抗原，易產生排斥反應，影響免疫效果。還有報道有開發(fā)研制基因工程活載體疫苗、基因工程亞單位疫苗等新型疫苗，此種方法可能是解決上述問題的有效手段，而且具有廣闊的發(fā)展前景，但是制作過程很復雜，而且需要很多先進的設備和儀器，成本高，很多實驗室無法完成。 2.2.4 目前，許多養(yǎng)鵝場使用市場上銷售的抗小鵝瘟血清的抗體效價都存在著差異，而且有些還存在著免疫失敗的現(xiàn)象。雖然用于預防和治療小鵝瘟的疫苗和血清都存在著缺陷，但是異源抗血清產量高，制作過程簡單，采用多次采血制備抗小鵝瘟高免血清還可以節(jié)約成本，可以批量生產。而且本實驗室用從貴州省惠水、三都等縣的養(yǎng)鵝場采集的病料分離出的小鵝瘟野生強毒X

31、W株用鵝胚尿囊液增質制備了小鵝瘟病毒抗原，并采用多次免疫貴州黑山羊和貴州白山羊制備出了抗小鵝瘟異源高免血清，其抗體效價達1：8以上。用山羊抗小鵝瘟高免血清進行了安全試驗，試驗結果顯示雛鵝未出現(xiàn)不良反應。而且還用市場上銷售的抗小鵝瘟血清與其進行了對比試驗，試驗結果顯示，山羊抗小鵝瘟高免血清的保護率比市售的抗小鵝瘟血清的保護率高出10%。說明用山羊制備的抗小鵝瘟異源高免血清可以應用于臨床預防和治療小鵝瘟。3 小結3.1 貴州省麻江分離的小鵝瘟野生強毒XW 株能夠在鵝胚上傳代增殖，它能夠致死鵝胚，引起相似而且非常典型的小鵝瘟胚胎病變。3.2 本次試驗分離的小鵝瘟野生強毒XW 株抗原與小鵝瘟陽性血清、

32、免疫鵝血清出現(xiàn)沉淀線，與PBS呈現(xiàn)陰性反應，而且與其它常見禽類病毒血清不發(fā)生交叉反應。表明本次分離的小鵝瘟野生強毒XW 株抗原可以用于山羊抗小鵝瘟異源高免血清的制備。3.3 安全試驗結果顯示本次試驗研制的山羊抗小鵝瘟異源高免血清安全有效，可以應用于臨床對小鵝瘟的預防和治療。3.4 測定病毒的半數(shù)致死量是測定病毒毒價的一個很重要的方法，LD50在病毒和血清的中和試驗中也起到很重要的作用。小鵝瘟病毒半數(shù)致死量的測定為對雛鵝的攻毒劑量時提供了依據(jù)。3.5 山羊抗小鵝瘟異源高免血清與市售抗小鵝瘟血清的對比試驗結果顯示，山羊抗小鵝瘟高免血清的保護率比市售的抗小鵝瘟血清的保護率提高了10%，說明抗小鵝瘟異

33、源高免血清的保護作用保護作用較強，用山羊抗小鵝瘟高免血清防治小鵝瘟有較好的防治效果。Study and application of High-Immunized serum fromgoat source against gosling plaguewang wen-qiangGuizhou.tongren , China )AbstractGoose Plague(GP)，an acute infectious disease lost blood type in gooes, was caused by goose parvovirus(GPV), Short course of the

34、 disease and high mortality, mainly against the less than 1 month old and young goslings Muscovy. Following the 10-day-old goslings morbidity, mortality rate could be as high as 100 percent. At present, that anti-plague serum on Goose in market was used in many Goose farm was immunized and treated to Go