G418原理及篩選方法

1、.G418原理及篩選方法原理 分析轉(zhuǎn)化的功能和表達(dá)需要DNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞染色體。外源基因進(jìn)入細(xì)胞后，部分能夠通過細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，根據(jù)細(xì)胞類型，至多80%的進(jìn)入核內(nèi)的外源DNA得到瞬時(shí)表達(dá)。極少數(shù)情況下，進(jìn)入細(xì)胞的外源DNA通過系列非同源性分子間重組核連接，最終整合進(jìn)細(xì)胞染色體。細(xì)胞基因組自由部分表達(dá)，所以整合并不一定意味著表達(dá)，只有整合到表達(dá)區(qū)的基因才會(huì)表達(dá)，而且整合到不同的染色體區(qū)段的外源基因的表達(dá)的量也是不同的。由于攝取、整合、表達(dá)外源基因是小概率事件，通常根據(jù)新表型篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體。一般情況下這種新表型由共轉(zhuǎn)染的編碼抗生素抗性基因提供。細(xì)菌Tn5 轉(zhuǎn)座子序列（neo抗性基因）攜帶

2、的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶可以將G418轉(zhuǎn)變成無毒形式。 G418 是一種氨基糖類抗生素，其結(jié)構(gòu)與新霉素、慶大霉素、卡那霉素相似，它通過影響80S核糖體功能而阻斷蛋白質(zhì)合成，對(duì)原核和真核等細(xì)胞都有毒性，包括細(xì)菌、酵母、植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞，也包括原生動(dòng)物和蠕蟲。是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染最常用的選擇試劑。當(dāng)neo基因被整合進(jìn)真核細(xì)胞基因組合適的地方后，則能啟動(dòng)neo基因編碼的序列轉(zhuǎn)錄為mRNA，從而獲得抗性產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的高效表達(dá)，使細(xì)胞獲得抗性而能在含有G418的選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。G418的這一選擇特性，已在基因轉(zhuǎn)移、基因敲除、抗性篩選以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等方面得以廣泛應(yīng)用。 在進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞膜受到影響，抗生素

3、可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生較大影響，加上G418有殺菌作用，所以有人主張轉(zhuǎn)染時(shí)不加其它抗生素。其實(shí)G418本身有很好的殺菌效果，在用G418進(jìn)行篩選的過程中很少會(huì)發(fā)生污染。但有一點(diǎn)，其實(shí)我覺得問題也不是很大，那就是：在老外的一本實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中提到，在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染時(shí)所用培養(yǎng)基中最好不加任何抗生素。我想他的想法可能是脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞膜有影響，可能此時(shí)加抗生素對(duì)細(xì)胞損傷較大。因?yàn)閼c大霉素、鏈霉素、G418均是氨基糖甙類藥物，其藥理作用完全一樣。所以沒有必要再用，而且由于另外抗生素的添加實(shí)際增加氨基糖甙類藥物的濃度，劑量有誤差，不利于各實(shí)驗(yàn)室之間的交流，在實(shí)際操作中，培養(yǎng)液中有抗生素對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)與篩選影響不大。 有人認(rèn)為用磷

4、酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染法篩選穩(wěn)定整合子較好，但這種觀點(diǎn)是很多年以前的觀點(diǎn)了，而且只是少數(shù)人的觀點(diǎn)。我兩種方法都用過，但沒有特異的比較過，感覺都可以。磷酸鈣便宜，但對(duì)溶液配置和實(shí)驗(yàn)操作要求很高，尤其是溶液的pH值，要求精確到小數(shù)點(diǎn)后2位。脂質(zhì)體是現(xiàn)在主流的轉(zhuǎn)染試劑，從沒有人說這種方法做整合穩(wěn)定表達(dá)不行。非脂質(zhì)體是這幾年發(fā)展很快的技術(shù)，轉(zhuǎn)染效率低，細(xì)胞毒性小，價(jià)格也不貴，Qiagen就有一個(gè)系列。我個(gè)人覺得不必要花太多時(shí)間在這方面，自己實(shí)驗(yàn)室用得好的技術(shù)可以堅(jiān)持，沒有經(jīng)驗(yàn)的可以選擇一個(gè)較著名的公司的產(chǎn)品開始，購(gòu)買之前先下載個(gè)說明書看看。有精力就比較一下幾種方法，一般的達(dá)到目的就行了。關(guān)鍵是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。 -主

5、要參考細(xì)胞培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)和分子克隆G418篩選實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 篩選之前 由于每種細(xì)胞對(duì)G418 的敏感性不同，一般變動(dòng)在100ug/ml1000ug/ml范圍。而且不同的廠家生產(chǎn)的相同濃度的G418的活性不盡相同，所以在篩選之前，一定要確定你的細(xì)胞對(duì)這一批G418的最佳篩選濃度。盡管如此，特性明確的細(xì)胞系G418 的最佳用量還是穩(wěn)定的。分子克隆給出了幾個(gè)常用細(xì)胞系所需G418 的最佳用量。細(xì)胞系或機(jī)體G418濃度（ug/ml）中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞700800 Madin-Darby犬腎細(xì)胞500人上皮A431細(xì)胞400 猿CV-1細(xì)胞500盤基網(wǎng)柄菌屬1035 植物10酵母125500 具體如下：

6、將細(xì)胞稀釋到1000個(gè)細(xì)胞/mL，在100ug/mL1mg/mL的G418濃度范圍內(nèi)進(jìn)行篩選，選擇出在1014d內(nèi)使細(xì)胞全部死亡的最低G418濃度來進(jìn)行下一步的篩選試驗(yàn)。 看下面的一個(gè)試驗(yàn)：3106個(gè)細(xì)胞電轉(zhuǎn)后，分別接種1/4000，1/1000，1/300細(xì)胞到24孔板中，48h后加藥篩選，此時(shí)1/300細(xì)胞孔內(nèi)大約50%匯合度。理論上1/4000孔內(nèi)應(yīng)有4%的匯合度。篩選9天后，觀察1/4000孔內(nèi)有兩三個(gè)克隆，按比例1/300孔內(nèi)應(yīng)該有幾十個(gè)克隆，事實(shí)上，它們幾乎全死光了，只有幾個(gè)克隆。所以匯合度對(duì)G418篩選結(jié)果的影響很大，一般篩選時(shí)匯合度不宜超過50%！加藥時(shí)間 由于基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)

7、之后要一段時(shí)間才能表達(dá)出蛋白質(zhì)。所以篩選不能太早；但是也不能太晚，因?yàn)檗D(zhuǎn)染了外源基因的細(xì)胞代謝負(fù)荷較大，增殖較慢，時(shí)間長(zhǎng)了就會(huì)被沒有外源基因轉(zhuǎn)入的細(xì)胞所淹沒，最終導(dǎo)致篩選不出陽性克隆，一般要在轉(zhuǎn)染24小時(shí)之后才開始加G418篩選。隨著細(xì)胞的代謝G418的濃度和活性都會(huì)下降，所以每35d都要更換一次含有G418的篩選液。這時(shí)藥物濃度可以降至200ug/ml。培養(yǎng)液 加藥篩選約6天左右，細(xì)胞會(huì)大量死亡，孔中只剩下的細(xì)胞寥寥無幾。這時(shí)會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)問題：1. 死亡的細(xì)胞會(huì)裂解釋放出有害物質(zhì)，導(dǎo)致那些有neo表達(dá)的陽性細(xì)胞死亡，即非選擇性死亡。2. 孔中細(xì)胞數(shù)目很少，細(xì)胞之間的信號(hào)會(huì)變得很弱，也會(huì)導(dǎo)致陽性

8、細(xì)胞的狀態(tài)不佳甚至死亡。這個(gè)時(shí)候需要一種特殊的培養(yǎng)液：假如你要轉(zhuǎn)染3T3細(xì)胞，在3T3細(xì)胞匯合度達(dá)到80%的時(shí)候，換液，培養(yǎng)過夜之后收集培養(yǎng)液，通過濾器消毒，和新鮮的培養(yǎng)液按1：1混合備用。再轉(zhuǎn)染后篩選過程中就可以應(yīng)用這種培養(yǎng)基。挑選單克隆的優(yōu)化 為了盡量減少陰性克隆的死亡給陽性克隆造成的不利影響以及增加陽性克隆的得率，可以應(yīng)用套環(huán)法或刮除法結(jié)合有限稀釋法來篩選陽性克隆。加藥后，在高倍鏡下，陽性克隆和陰性克隆很容易辨認(rèn)，在陽性克隆下用記號(hào)筆做個(gè)標(biāo)記。然后刮除陰性克隆，消化陽性克隆后繼續(xù)篩選培養(yǎng)；或者用套環(huán)套住陽性克隆，在套環(huán)內(nèi)加胰蛋白酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一個(gè)新的孔中培養(yǎng)。最后再用有限稀釋法把陽性克隆在96孔板中篩選。鑒定之后 一般經(jīng)過4周左右的篩選，得到的陽性克隆都比較穩(wěn)定。但是外源基因如果沒有整合到基因組中的話，目的基因還是很容易丟失的。但是外源基因整合到基因組中的概率太小了，而且是隨機(jī)整合，會(huì)