病毒中和抗體檢測

1、.病毒中和抗體檢測1. 病毒TCID50檢測 TCID50 是指組織培養(yǎng)物（細胞）半數(shù)致死劑量。它有幾個性質(zhì)我們必須明白：1）它表示的是計量，不是濃度； 2）它是一個單位；3）它的值等于1，實際上問它的值等于多少是一個沒有意義的問題，就像問km的值等于多少一樣，如果非要說出的的值等于多少，那我們只能說它的值在任何情況下都等于1。理解這三個性質(zhì)對于理解TCID50非常重要，但是這三個性質(zhì)經(jīng)常被誤解，所以導(dǎo)致對TCID50的理解出現(xiàn)偏差。 首先我們來看一下這個表示法的意思：病毒滴度為108.2TCID50/ml 。它表示的是每ml病毒溶液里含有108.2個TCID50的病毒，這和氯化鈉的濃度為4.

2、5mol/L表示每L溶液中含有4.5個mol的氯化鈉是一樣的道理。經(jīng)常可以聽到人說我的病毒的TCID50是10x.x。這個說法是不科學(xué)的，應(yīng)該說我這個溶液里含有10x.x個TCID50的病毒或者說我這個溶液的病毒滴度是10xxTCID50/ml。也可以說病毒的TCID50效價是10-x.x。TCID50=105.64/0.1ml。即：將病毒懸液作105.64稀釋后，接種細胞0.1ml，可以使50%的細胞產(chǎn)生CPE。（將病毒懸液作105.64稀釋后，0.1ml中含1個TCID50，作其他一些實驗時（如中和試驗），一般常用100TCID50/0.1ml或者100TCID50/0.05ml）本方法的

3、優(yōu)缺點:.優(yōu)點:出現(xiàn)陽性結(jié)果時間較短,且較明顯;.缺點:有時候,在用槍頭吸出細胞生長液時,容易出現(xiàn)污染; 使用本方法時的注意事項:.稀釋病毒時,每做一個病毒稀釋度都需要換槍頭,減少濃度誤差;.96孔板,每孔接種的細胞量:一般在此種測定病毒滴度的方法下,要將細胞密度適當(dāng)調(diào)低,至少要比正常傳代時低一些,否則細胞生長速度過快,未到7天則細胞出現(xiàn)死亡,對觀察CPE不利.一般情況下,小塑料瓶(8-9ml液體為正常用量),培養(yǎng)長慢單層后,消化細胞,加入6ml培養(yǎng)液,吹勻,吸出其中的2ml,到另外的瓶子,在該瓶中加入14-16ml即可,如果不放心,可以用顯微鏡看一下,細胞數(shù)過多則補加培養(yǎng)液,少則補加剩余4m

4、l的細胞懸液;維持液,即病毒培養(yǎng)液,配方為:.MEM+2%小牛血清+3%谷氨酰胺+1%雙抗+NaHCO3;. MEM+3%谷氨酰胺+1%雙抗+NaHCO3;兩種維持液的不同在于是否有FBS(小牛血清).我個人曾經(jīng)做過實驗,在狀態(tài)很好的細胞上接種病毒,分別使用兩種不同的維持液,最終結(jié)果是一樣的,沒有什么不同,所以可以根據(jù)個人需要進行選擇.另外,曾經(jīng)請教過專門做中和實驗的老師,他認(rèn)為適當(dāng)?shù)腇BS對細胞有保護作用,而且他說這是國外文獻上的報道. 1） 細胞準(zhǔn)備1.1 檢查培養(yǎng)瓶中的單層細胞，以5ml胰酶EDTA輕微沖洗1.2 加入45ml 胰酶EDTA以覆蓋單層細胞1.3 放平培養(yǎng)瓶，37 5CO2

5、培養(yǎng)箱中孵育1020min，直到細胞脫落1.4 加入510ml培養(yǎng)液，洗下細胞后移到離心管中1.5 以PBS洗細胞兩次（12000rpm, 5min）1.6 以D-MEM重懸細胞，并用血球計數(shù)板計數(shù)1.7 以D-MEM將將細胞濃度調(diào)整到1105/ml -1.5105/ml1.8 在微量培養(yǎng)板的各孔中加入100l細胞, 相當(dāng)于?104細胞/孔1.9 在37 5CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)（1822h），用處于生長相剛達到完全融合的細胞進行病毒的滴定2） 病毒制備3） 病毒稀釋3.1 取凍存的病毒，以病毒生長培養(yǎng)液（VGM）稀釋10倍，即100微升病毒液+900微升稀釋液，共1毫升。（于1.5ML EP

6、管中進行，將混合液充分吹打振蕩，很重要?。?.2 做10倍稀釋3.3 在另一新1.5ML EP管中加入100l第一管稀釋病毒液（1/10），按10的比例進行倍比稀釋，再加入900l稀釋液，將混合液充分吹打振蕩。以此類推共稀釋至1013倍。此過程中需要使用加樣器和tip頭。使用前用75%乙醇擦拭加樣器，并用紫外線照射20min，確保無菌。使用新高壓的tip頭，外包裝一定在超凈臺（或安全柜中打開）4）病毒接種：4.1取細胞培養(yǎng)板，用多道加樣器（又稱排槍）吸去96孔板中的培養(yǎng)液，吸取孵育液或無血清DMEM加在每孔中再輕輕吹打一次，然后吸出孵育液（此步目的是去除血清，因為血清能干擾病毒的吸附）。4.2

7、于各孔中加100ul各不同的病毒稀釋液，每個稀釋度做一列孔，即每個病毒稀釋度做8個平行復(fù)孔，根據(jù)觀察的習(xí)慣，一般從右到左，從上到下，從高稀釋度到低稀釋度到原液加樣。 (病毒稀釋度的選擇1031012或者1041013,因為目的基因不同，重組腺病毒滴度差距很大，應(yīng)該盡量將稀釋度加大，看到有人用的稀釋度是1061013)4.3第11列和12列為陰性對照，陰性對照孔中加入100ul含5%胎牛血清的DMEM，監(jiān)測細胞存活情況；切記：設(shè)置正常的細胞對照。每次實驗要重復(fù)4次，計算標(biāo)準(zhǔn)差。3456789101112CONCONABCDEFGH4.437CO2培養(yǎng)箱中孵育1h，取出培養(yǎng)板吸去病毒液（從低濃度向

8、高濃度吸取可避免竄孔），加入維持液200l繼續(xù)于37，5% CO2培養(yǎng)5-10天；4.5逐日觀察，5-10天后倒置顯微鏡下觀察，計算每一列中出現(xiàn)CPE（cytopathic effects，CPEs）的孔數(shù)。只要有一小點或是一些細胞出現(xiàn)CPE即為陽性，如果無法確定，可與陰性對照比較；4.6如果陰性對照中無任何CPE且細胞生長良好，最低稀釋度100%陽性而最高稀釋度100%陰性，則本試驗即為有效；4.7計算每一列中出現(xiàn)陽性的孔數(shù)；4.8用Reed-Muench法計算病毒TCID50/ml。 (1)計算各病毒稀釋度陽性孔數(shù)目（1）和陰性孔數(shù)目（2） (2)計算陽性和陰性孔的累積數(shù)。 陽性孔累積數(shù)由

9、下向上累計（3）；陰性孔累積數(shù)由上向下累計（4） (3)計算陽性孔的百分比：比率（5）=（3）/（3）+（4），（6）=（5）100 (4)計算距離比例（PD）=（大于50%的陽性百分比50）/（大于50%的陽性百分比小于50%的陽性百分比）TCID50的對數(shù)=大于50%的陽性百分比的最高稀釋對數(shù) + 距離比例稀釋系數(shù)的對數(shù)（稀釋系數(shù)的對數(shù) 1:10稀釋為1，半對數(shù)稀釋為0.5，倍比稀釋為0.3，1:5稀釋為0.7）舉例計算：TCID50的測定和計算（Reed-Muench法）病毒液稀釋度細胞管觀察結(jié)果累計細胞官數(shù)細胞管總數(shù)出現(xiàn)CPE的細胞管所占的出現(xiàn)CPE管不出現(xiàn)CPE管出現(xiàn)CPE管不出現(xiàn)C

10、PE27/27）10-28019019100(19/19)10-3711111291.6(11/12)10-435461040(4/10)10-517113140.7(1/14)10-608021210(0/21)出現(xiàn)細胞病變（CPE）以及血凝素等的細胞管數(shù)分別列于表14-2的第二和第三列,它們的累計數(shù)分別列于第四和第五列（根據(jù)箭頭所示方向）,第六列為細胞管總數(shù),第七列為出現(xiàn)細胞病變的細胞管數(shù)占細胞管總數(shù)的百分率?？梢娫摬《局甑腡CID50在10-3（91.6）和10-4（40）之間,其確切稀釋倍數(shù)可按下列公式計算：91.6（高于50的百分?jǐn)?shù)）-50 91.6（

11、高于50的百分?jǐn)?shù)）-40（低于50的百分?jǐn)?shù)）41.6/51.60.8將由上式獲得0.8加在高于50%死亡的稀釋度的對數(shù)（3）上,因此該病毒的TCID50應(yīng)是0.1ml 10-3.8稀釋的病毒液。查反對數(shù)得6310,即該病毒6310倍稀釋液0.1ml等于1個TCID50。2. 中和實驗1） 細胞準(zhǔn)備1.1 檢查培養(yǎng)瓶中的單層細胞，以5ml胰酶EDTA輕微沖洗1.2 加入45ml 胰酶EDTA以覆蓋單層細胞1.3 放平培養(yǎng)瓶，37 5CO2培養(yǎng)箱中孵育1020min，直到細胞脫落1.4 加入510ml培養(yǎng)液，洗下細胞后移到離心管中1.5 以PBS洗細胞兩次（12000rpm, 5min）1.6 以

12、D-MEM重懸細胞，并用血球計數(shù)板計數(shù)1.7 以D-MEM將將細胞濃度調(diào)整到1105/ml -1.5105/ml1.8 在微量培養(yǎng)板的各孔中加入100l細胞, 相當(dāng)于?104細胞/孔1.9 在37 5CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)（1822h），用處于生長相剛達到完全融合的細胞進行病毒的滴定2）待測血清準(zhǔn)備2.1 動物血清中，含有多種蛋白質(zhì)成分對抗體中和病毒有輔助作用，如補體、免疫球蛋白和抗補體抗體等。為排除這些不耐熱的非特異性反應(yīng)因素，用于中和試驗的血清須經(jīng)加熱滅活處理。各種不同來源的血清，須采用不同溫度處理，豬、牛、猴、貓及小鼠血清為60；水牛、狗及地鼠血清為62；馬兔血清為65；人和豚鼠血清為5

13、6。加熱時間為20-30min，60以上加熱時，為防止蛋白質(zhì)凝固，應(yīng)先以生理鹽水作適當(dāng)稀釋。2.2 取已滅活處理的血清，在96孔微量細胞培養(yǎng)板上，用稀釋液作一系列倍比稀釋，使其稀釋度分別為原血清的1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64，或者按1:10，1:20，1:40，1:80，1:160，1:320，1:640，1:1280稀釋，每個稀釋度做3-4個平行孔。3) 加入病毒,感作3.1 以VGM將病毒稀釋到100 TCID50/50l (200 TCID50/100)3.2 除細胞對照孔外每孔中加入與血清量相等的病毒液，在細胞對照孔中加入與血清量相等的VGM3.3 輕混病毒血清

14、混和物，37 5CO2培養(yǎng)箱中孵育2h4）接種細胞4.1準(zhǔn)備用于接種的剛達到完全融合的細胞的培養(yǎng)板，吸掉培養(yǎng)液，加入350l無血清D-MEM培養(yǎng)液以洗掉剩下的FBS4.2 病毒血清混和物孵育2h結(jié)束后，各取100l中和液到細胞培養(yǎng)板相應(yīng)的孔中4.3 37 5CO2培養(yǎng)箱中孵育2h4.4 吸掉中和液，加250l D-MEM 洗滌4.5 加200l D-MEM 在37 5CO2培養(yǎng)箱中孵育34d，檢測培養(yǎng)液中血凝活性，以能保護50細胞培養(yǎng)管不被感染的最高血清稀釋度的倒數(shù)作為中和終點。在制備細胞懸液時，其濃度以在24h內(nèi)長滿單層為度：血清病毒中和1h后取出，每孔加入100l細胞懸液。置5%CO2 3

15、7溫箱培養(yǎng)，自培養(yǎng)48h開始逐日觀察記錄，14D終判。由于各種病毒引起細胞病變時間不同，終判時間應(yīng)根據(jù)病毒致細胞病變的快慢而定。5）對照組 對照的設(shè)定：包括細胞對照（培養(yǎng)液中僅含細胞，不含病毒和血清），陰性對照（培養(yǎng)液中含有l(wèi)00TCID50病毒、細胞及陰性血清）和空白對照（培養(yǎng)基中含有100TCID50病毒及細胞，不含血清），各設(shè)3個平行孔。 為保證試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，每次試驗都必須設(shè)置下列對照，特別是在初次進行該種病毒的中和試驗時，尤為重要。 陽性和陰性血清對照：陽性和陰性血清與待檢血清進行平行試驗，陽性血清對照應(yīng)不出現(xiàn)細胞病變，而陰性血清對照應(yīng)出現(xiàn)細胞病變。 病毒回歸試驗：每次試驗每一塊板

16、上都設(shè)立病毒對照相館，先將病毒作0.1、1、10、 100、1000 TCID50稀釋，每個稀釋度作4孔，每孔加50l。然后每孔100l細胞懸液。 0.1TCID TCID50應(yīng)不引起細胞病變，而且100TCID TCID50必須引起細胞病變，否則該試驗不能成立。 血清毒性對照相：為檢查被檢血清本身對細胞有無任何毒性作用，設(shè)立被檢血清毒性對照是必要的。即在組織細胞中加入低倍稀釋的待檢血清（相當(dāng)于中和試驗中被檢血清的最低稀釋度）。 正常細胞對照相：即不接種病毒和待檢血清的細胞懸液孔。正常細胞對照應(yīng)在整個中和試驗中一直保持良好的形態(tài)和生活特征，為避免培養(yǎng)板本身引起試驗誤差，應(yīng)在每塊板上都設(shè)立這一對

17、照。 6) 結(jié)果判定和計算當(dāng)病毒回歸試驗，陽性、陰性、正常細胞對照相，血清毒性對照全部成立時，才能進行判定，被檢血清孔出現(xiàn)100%CPE判為陰性，50%以上細胞出現(xiàn)保護者為陽性；固定病毒稀釋血清中和試驗的結(jié)果計算，是計算出能保護50%細胞孔不產(chǎn)生細胞病變的血清稀釋度，該稀釋度即為該份血清的中和抗體效價。 舉例計算：用Reed和Muench兩氏法（或Karber法）計算結(jié)果，固定病毒稀釋血清法中和抗體效價計算 如表2-26血清稀釋 CPE數(shù)無 積累CPE 積累無CPE CPE比率百分?jǐn)?shù)1:4(10-0.6) 0/4 0 4 0 12 0/12 01:8(10-0.9) 0/4 0 4 0 8 0/8 01:16(101.2) 1/4 1 3 1 4 1/5 201:32(10-1.5) 3/4 3 1 4 1 4/5 801:64(101.8) 4/4 4 0 8 0 8/8 100 80%50%距離比例0.5 80%20%Ig TCID50=高于50血清稀釋度的對數(shù)距離比例稀釋系數(shù)的對數(shù)Ig TCID501.50.5（0.3）1.35（稀釋系數(shù)的對數(shù) 1:10稀釋為1，半對數(shù)稀釋為0.5，倍比稀釋為0.3，1:5