植物花藥和花粉培養(yǎng)

1、第七章 植物花藥和花粉培養(yǎng),四分體: 醋酸洋紅染色,四分體: Alexanders 染色,單核期,雙核期,成熟花粉粒,處于不同發(fā)育時期的煙草小孢子,植物單倍體培養(yǎng)方法:,花藥培養(yǎng)、花粉培養(yǎng) 胚珠或子房培養(yǎng)（未受精）,植物花藥/花粉培養(yǎng)歷史,Guha和Maheshwari （1964） 曼陀羅花藥培養(yǎng) Nitsch 和 Norreel (1973) 煙草花粉培養(yǎng)（游離小孢子培養(yǎng)） Chu（1973）小麥花粉培養(yǎng) （早期花藥培養(yǎng)主要依靠小孢子的自然胚胎發(fā)生產(chǎn)生單倍體，能自發(fā)形成胚胎發(fā)生的基因頻率較低，效率極低） 80年代后期到90年代期間，花培技術(shù)迅速發(fā)展。許多作物小孢子培養(yǎng)已經(jīng)成功。十字花科、麥

2、類、水稻、玉米等。 90年代，一些先前被認(rèn)為是不易進(jìn)行小孢子培養(yǎng)的基因型也相續(xù)成功Konzak (1999) 。,概念：,花藥和花粉培養(yǎng)：指在合成培養(yǎng)基上，改變花粉的發(fā)育途徑，使其不形成配子，而像體細(xì)胞一樣進(jìn)行分裂、分化、最終發(fā)育成完整植株。該發(fā)育途徑被稱為“花粉孢子體發(fā)育途徑”或“雄核發(fā)育”。 兩者的異同點(diǎn) 培養(yǎng)目的相同，均獲得小孢子植株。 花藥培養(yǎng)屬于器官培養(yǎng)；而花粉培養(yǎng)屬于細(xì)胞培養(yǎng)。 花粉培養(yǎng)沒有藥壁組織干擾；可計數(shù)小孢子產(chǎn)胚率；可觀察雄核發(fā)育的全過程；單倍體產(chǎn)量高。但技術(shù)更復(fù)雜。,花藥或花粉培養(yǎng)的作用：,1、作物育種 （1）縮短育種周期：常規(guī)育種需4-6年獲得純系，而小 孢子培養(yǎng)僅需一

3、年。,例子： 二倍體供體植株基因型為AaBb，若要從后代中選擇基因為AAbb的純合單株 常規(guī)方法： AAbb出現(xiàn)的概率為1/16，并且不能將AAbb與Aabb、aAbb區(qū)分開。,（2）提高了目標(biāo)基因型的選擇效率,ABaBAbab ABAABBAaBBAABbAaBb aBaABBaaBBaABbaaBb AbAabBAabBAAbbAabb abaAbBaabBaAbbaabb,例子： 二倍體供體植株基因型為AaBb，若要從后代中選擇基因為AAbb的純合單株 單倍體方法： AAbb出現(xiàn)的概率為1/4。,（2）提高了目標(biāo)基因型的選擇效率,植株不受顯隱性的影響，在誘變育種中能在當(dāng)代及時獲得突變個體

4、，加倍后成為穩(wěn)定的純系。,（3）誘變育種中的作用,2、物種進(jìn)化研究 可探索親本染色體組的構(gòu)成。分析單倍體植物減數(shù)分裂時，形成二價體的數(shù)目和形狀，能確定染色體組內(nèi)是否存在同源染色體。 3、遺傳分析 單倍體植株中基因不受顯隱性的影響，每一個基因的作用均能表現(xiàn)出來。能用來研究基因的性質(zhì)及其作用。還可用于基因的劑量效應(yīng)分析。 4、構(gòu)建連鎖圖譜 雙單倍體（DH）群體是永久性群體，能有效地用于遺傳圖譜的構(gòu)建 5、用于遺傳轉(zhuǎn)化 能直接表達(dá)外源基因，不受顯隱性影響,花粉孢子體發(fā)育途徑（雄核發(fā)育）,一、花粉發(fā)育的階段,花粉離體培養(yǎng)時，雄核發(fā)育最適宜的時期一般是第一次有分裂或之前。,二、雄核發(fā)育途徑,1、A途徑

5、小孢子第一次有絲分裂為均等分裂，形成營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞 （1）A-V途徑 由營養(yǎng)細(xì)胞重復(fù)分裂形成單倍體 （2）A-G途徑 由生殖細(xì)胞重復(fù)分裂形成單倍體 （3）A-VG途徑（E途徑） 由營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞各自獨(dú)立分裂，共同形成單倍體 （4）C途徑 營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞通過核融合，形成多倍體植株 2、B途徑 小孢子第一次有絲分裂為均等分裂，形成大小相近的兩個細(xì)胞。然后由這兩細(xì)胞邊續(xù)分裂形成單倍體植株，或者核融合形成多倍體植株,1、雄核發(fā)育與P花粉的形成 P-花粉：具胚胎發(fā)生潛能的花粉。也稱小花粉（S-花粉）或不染色花粉（NS-花粉） 2、雄核發(fā)育與饑餓處理 饑餓處理改變了小孢子的配子體發(fā)育方向，啟動

6、雄核發(fā)育。,三、雄核發(fā)育啟動機(jī)理,1、胚狀體發(fā)育途徑 小孢子經(jīng)歷胚發(fā)生的各個階段，最后子葉展開，形成花粉植株。 2、愈傷組織發(fā)育途徑 小孢子分裂數(shù)次形成愈傷，再分化形成花粉植株。此途徑產(chǎn)生的植株會出現(xiàn)變異且倍性復(fù)雜。,四、花粉植株形態(tài)發(fā)生方式,胚狀體發(fā)育途徑,部分花藥通過胚狀體途徑形成小植株,煙草花藥培養(yǎng),通過胚狀體途徑再生形成小植株,煙草花藥培養(yǎng),胚狀體發(fā)育途徑,蕓苔屬小孢子培養(yǎng),愈傷組織發(fā)育途徑,部分花藥產(chǎn)生愈傷組織,接種在平板上的水稻花藥,水稻花藥培養(yǎng),水稻花藥培養(yǎng),花藥和花粉培養(yǎng)方法,一、花藥培養(yǎng),1、取材 鏡檢，根據(jù)花粉的發(fā)育時期，選取大小適宜的花蕾。 2、消毒 70酒精擦洗花蕾表面

7、，或70酒精浸泡30-60s后在1次氯酸鈉溶液中浸泡10-20min或在0.1的氯化汞溶液中消毒3-10min，無菌水沖洗3-5次。 3、培養(yǎng) 固體或液體培養(yǎng)基均可。先進(jìn)行脫分化培養(yǎng)，至小孢子大量分裂形成胚或愈傷，并突破花藥壁表面，形成突出物（2-3周）；后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，形成小植株。,二、花粉培養(yǎng),(一)花粉的分離與純化 1、自然散落法(漂浮培養(yǎng)散落小孢子收集法) 將花藥接種在預(yù)處理液或液體培養(yǎng)基上，待花粉自動散落后，收集培養(yǎng)。 2、擠壓法 在燒杯或研缽中擠壓花藥，將花粉擠出后收集培養(yǎng)。 3、機(jī)械游離 （1）磁攪拌法 用磁力攪拌器攪拌培養(yǎng)液中的花藥，使花粉游離出來； （2）超速旋切法 通

8、過攪拌器中的高速旋轉(zhuǎn)刀具破碎花蕾、穗子、花藥，使小孢子游離出來（此法應(yīng)用最廣）。 4、小孢子純化 對上述方法獲得的小孢子混合物進(jìn)行分級過篩、梯度離心處理純化小孢子,梯度離心前 （小孢子形態(tài)、活力不一致）,30%蔗糖梯度離心后 （獲得均一的小孢子群體）,(二)花粉培養(yǎng)方式 1、平板培養(yǎng) 花粉置瓊脂固化培養(yǎng)基上培養(yǎng)。 2、液體培養(yǎng) 花粉懸浮在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，需震蕩，以利通氣。 3、雙層培養(yǎng) 花粉置固體-液體雙層培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)基制作方法：先鋪一層瓊脂固體培養(yǎng)基，凝固后，在表面加入少量液體培養(yǎng)基。 4、看護(hù)培養(yǎng) 利用花藥或花藥愈傷組織釋放出的活性物質(zhì)促進(jìn)花粉小孢子發(fā)育。 5、微室培養(yǎng) 利用小的蓋

9、玻片和凹穴載玻片形成微室進(jìn)行花粉培養(yǎng) 6、條件培養(yǎng)基培養(yǎng) 利用培養(yǎng)過花藥的液體培養(yǎng)基或含失活花藥提取物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。花藥條件培養(yǎng)基、子房條件培養(yǎng)等。,看護(hù)培養(yǎng)圖解,三、白化苗現(xiàn)象,（一）白化苗產(chǎn)生的影響因素及機(jī)理 1、內(nèi)因 供體植株基因型（如秈稻比粳稻白苗率高）、花粉發(fā)育時期。 2、外因 預(yù)處理、培養(yǎng)基成分、激素水平與種類、培養(yǎng)條件和方法、愈傷組織轉(zhuǎn)分化時間等。 3、機(jī)理 核基因起關(guān)鍵作用，導(dǎo)致質(zhì)體DNA缺失，產(chǎn)生白苗。另外地、無性系變異也可能是原因之一。 （二）白化苗的控制 通過對花粉發(fā)育時期、預(yù)處理、培養(yǎng)基成分等因素進(jìn)行調(diào)控。,四、影響雄核發(fā)育和花粉花藥培養(yǎng)的因素,（一）基因型 植物基因

10、型是影響雄核發(fā)育的最重要的因素之一。同一物種中的不同基因型對小孢子離體誘導(dǎo)反應(yīng)差異較大。 如在水稻中，秈稻花粉培養(yǎng)力遠(yuǎn)低于糯稻。,蕓苔屬植物Brassica napus不同基因型的小孢子產(chǎn)胚率比較,Topas 10,000-200,000 1-20 Westar 1000-10,000 0.1-1 Delta 100-10,000 0.01-1 Bounty 10-100 0.001-0.01,基因型胚狀體數(shù)量/106小孢子 成苗率（%）,（二）供體植株生長條件和生理狀態(tài) 1、植株生長條件 光溫等因素均能影響花藥培養(yǎng)力。一般 處于適宜生長條件（如溫室中）較好。但物種間存在差異。 2、植株生長時

11、期 一般是開花始期優(yōu)于開花末期。 3、P花粉的頻率 不同溫度、日照時數(shù)、氮饑餓及生長物質(zhì)處 理提高P花粉的數(shù)量,（三）花粉發(fā)育時期 小孢子發(fā)育時期對誘導(dǎo)雄核發(fā)育非常重要。,四分體: 醋酸洋紅染色,四分體: Alexanders 染色,單核期,雙核期,成熟花粉粒,處于不同發(fā)育時期的煙草小孢子,一般而言，單核期（第一次有絲分裂前）對誘導(dǎo)反應(yīng)最敏感，為最佳培養(yǎng)期。,形成雙核后，在合適的條件，主要由營養(yǎng)細(xì)胞分裂產(chǎn)生胚狀體。,不同物種誘導(dǎo)胚胎發(fā)生的最佳小孢子發(fā)育時期,對不同發(fā)育階段的花藥進(jìn)行培養(yǎng)測試 確定最佳小孢子發(fā)育時期的形態(tài)特征 注意形態(tài)特征會因品種、發(fā)育狀態(tài)、環(huán)境條件的變化而發(fā)生變化,處于不同發(fā)育

12、階段的煙草花芽,花粉發(fā)育時期的確定,（四）預(yù)處理 預(yù)處理是小孢子培養(yǎng)成功的前提條件 預(yù)處理目的：是改變小孢子的發(fā)育方向，使盡可能多的小孢子從配子體發(fā)育途徑轉(zhuǎn)向孢子體發(fā)育途徑（即成為具胚胎發(fā)生潛力的小孢子）。適當(dāng)?shù)念A(yù)處理能使綠苗產(chǎn)量大量增加。 預(yù)處理方法：主要是對花藥進(jìn)行適度的逆境處理，包括低溫、高溫、化學(xué)物質(zhì)、離心、射線等。,1、高低溫處理低溫預(yù)處理：指在接種之前將材料用0以上低溫處理一段時間后再接種。應(yīng)用較多。處理溫度一般在1-14，時間從幾小時至幾十天不等。不同作物所用的預(yù)處理溫度及時間差異較大。不同的處理溫度需要不同的時間。 例子:小麥穗子培養(yǎng)前4預(yù)處理幾天，花藥培養(yǎng)效率顯著提高。 十字

13、花科未經(jīng)低溫預(yù)處理的花蕾，每花藥產(chǎn)胚數(shù)為4.39個，6-9處理1天，產(chǎn)胚數(shù)提高到61.4個，預(yù)處理4天后，胚狀體產(chǎn)量降為10.47個。,預(yù)處理方法：,高溫處理（熱擊處理）：指花藥接種后，先在較高溫度下（30-35）培養(yǎng)數(shù)天，然后再移至正常溫度下繼續(xù)培養(yǎng)。 例子:如煙草，32高溫；小麥，33高溫預(yù)處理顯著地提高了小孢子胚胎發(fā)生能力（Touraev，1996）,2、化學(xué)物質(zhì)處理,包括高糖、甘露醇、秋水仙素、乙烯利等進(jìn)行處理。甘露醇僅能維持滲透壓，不能提供碳源，其主要原理是造成小孢子營養(yǎng)饑餓，從而使小孢子去分化。,3、其它,包括射線、離心、磁場等。,（五）培養(yǎng)基,1.基本培養(yǎng)基 主要為N6和MS培養(yǎng)

14、基。在此基礎(chǔ)上發(fā)展出一些其它的培養(yǎng)基。如H培養(yǎng)基（適于煙草）、C17培養(yǎng)基（適于小麥）、馬鈴署-培養(yǎng)基（適于馬鈴署）,2.碳源 包括蔗糖、麥芽糖、纖維二糖、葡萄糖、果糖、海藻糖等。不同作物所需最適的碳源種類及濃度的所差異。一般認(rèn)為單子葉植物比雙子葉植物需糖的濃度要高。玉米中蔗糖效果最好；而麥類作物中，麥芽糖似乎為最好的碳源。,3、激素 4、氨基酸 5、活性碳 6、pH,（六）培養(yǎng)條件,1、溫度 物種間有差異 2、光照 3、植板密度 植板密度與花培效率有很大的相關(guān)性。5103到2104ml密度均能有效培養(yǎng)。一般來說，足夠數(shù)量的、但相對低密度的小孢子濃度有利于小孢子競爭營養(yǎng)、氧氣、細(xì)胞分裂的空間，

15、從則有利于胚狀體發(fā)生。,（七）花藥壁因素 花藥組織的存在對小孢子的胚性分裂具有明顯的促進(jìn)作用。但花藥壁損傷會釋放有毒物質(zhì)影響小雄核的發(fā)育。,單倍體植株鑒定和染色體加倍,一、倍性鑒定 （為什么要進(jìn)行倍性鑒定？）,1、染色體直接計數(shù)法 通常取根尖、莖尖等分生組織區(qū)進(jìn)行制片，直接計數(shù)染色體數(shù)目。 2、間接鑒定 （1）掃描細(xì)胞光度儀鑒定（流式細(xì)胞儀） 主要測定葉片單個細(xì)胞中DNA的含量確定細(xì)胞的倍性，材料的使用量可少到1cm2。 （2）細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定法 葉片保衛(wèi)細(xì)胞大小、單位面積上的氣孔數(shù)及保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體的大小和數(shù)目與倍性具有高度的相關(guān)性。 （3）植株形態(tài)學(xué)鑒定法 單倍體植株瘦弱，葉片窄小，花小柱頭

16、長，花粉粒小，不結(jié)實(shí)。,（4）雜交鑒定法自交或測交鑒定，看后代分離情況確定二倍體植株是來自小孢子還是體細(xì)胞。 （5）分子標(biāo)記鑒定包括生化標(biāo)記（如同工酶標(biāo)記）和分子標(biāo)記（如RFLP、RAPD、AFLP等）,二、染色體加倍 （為什么要進(jìn)行加倍？）,（一）莖段培養(yǎng)將單倍體植株的莖段進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)愈傷組織形成。由于單倍體愈傷組織在培養(yǎng)過程中會有一定頻率的核內(nèi)有絲分裂，從而形成二倍體細(xì)胞，分化出純合的二倍體植株。,二、染色體加倍 （為什么要進(jìn)行加倍？）,（二）化學(xué)試劑誘變有秋水仙素、Oryzalin、trifluralin、APM等。 1、秋水仙素誘導(dǎo) （1）浸泡法無菌條件下以一定濃度的秋水仙素浸泡再生小植株，再轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 （2）生長錐處理 秋水仙素水溶液直接涂抹生長點(diǎn)（頂芽或腋芽）。 （3）培養(yǎng)基處理 將單倍體植株和任何一部分作為外植體，種植在附加一定濃度和秋水仙素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間后，轉(zhuǎn)入無秋水仙素的相同培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)誘