實(shí)驗(yàn)三血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳課件

1、實(shí)驗(yàn)三血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳,1,實(shí)驗(yàn)三 血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳,實(shí)驗(yàn)三血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳,2,注意：自己帶鉛筆、尺子,實(shí)驗(yàn)時(shí)間：第11周，星期一,實(shí)驗(yàn)三血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳,3,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1.了解電泳的基本原理； 2.掌握電泳分離蛋白質(zhì)的原理； 3.掌握醋酸纖維素薄膜電泳的方法,實(shí)驗(yàn)三血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳,4,二、實(shí)驗(yàn)原理,1.電泳的基本原理 電泳是帶電質(zhì)點(diǎn)在電場力作用下發(fā)生定向移動(dòng)的現(xiàn)象。 電泳技術(shù)是利用電泳現(xiàn)象進(jìn)行物質(zhì)分離、純化及鑒定的技術(shù),實(shí)驗(yàn)三血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳,5,電泳速度的方向,電泳速度的大小：當(dāng)F=F時(shí)，粒子在電場中勻速運(yùn)動(dòng),

2、運(yùn)動(dòng)速度,實(shí)驗(yàn)三血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳,6,E：電場強(qiáng)度; Q：粒子所帶的凈電荷; r：粒子半徑； ：溶液的粘度,在同一電場環(huán)境中，帶電粒子的遷移速率只與本身所帶電荷、粒子半徑有關(guān),實(shí)驗(yàn)三血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳,7,i）粒子所帶電荷越多，半徑越小，泳動(dòng)速度就越快 （ii）所帶電荷越少，半徑越大，泳動(dòng)速度就越慢,實(shí)驗(yàn)三血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳,8,2.電泳分離蛋白質(zhì)的原理,當(dāng)pH=PI時(shí)，所帶電荷為0，粒子是靜止的； 當(dāng)pHPI時(shí)，酸性電離，釋放氫離子，帶負(fù)電，運(yùn)動(dòng)方向是從負(fù)極向正極移動(dòng)； 當(dāng)pHPI時(shí)，堿性電離，結(jié)合氫離子，帶正電，運(yùn)動(dòng)方向是從正極向負(fù)極移動(dòng)； 當(dāng)pH距離PI越

3、遠(yuǎn)時(shí)，所帶電量越多,實(shí)驗(yàn)三血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳,9,血清蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為4.87.5，均低于8.6，因此電泳時(shí)常采用pH8.6的緩沖液。此時(shí)，蛋白質(zhì)解離帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動(dòng)。 由于各種血清蛋白的等電點(diǎn)不同，在同一pH下帶的電荷數(shù)也不同，加上各蛋白質(zhì)的分子大小也有差別，因此在電場中的移動(dòng)速度不同。 帶電荷多、相對(duì)分子量小的蛋白質(zhì)泳動(dòng)較快，帶電荷少、相對(duì)分子量大的泳動(dòng)較慢。 這樣各種血清蛋白質(zhì)在同一時(shí)間內(nèi)泳動(dòng)的距離就不同，從而可將血清蛋白分離成數(shù)條區(qū)帶,2.電泳分離血清蛋白質(zhì)的原理,實(shí)驗(yàn)三血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳,10,4.醋纖膜分離血清蛋白質(zhì)的原理,醋酸纖維素薄膜電泳是采用醋

4、酸纖維素薄膜作支持物的一種電泳技術(shù)。 醋酸纖維素薄膜是纖維素的羥基乙?；纬傻睦w維素醋酸酯，具有均一的泡沫狀結(jié)構(gòu)，滲透性強(qiáng)，對(duì)分子移動(dòng)阻力小，用它做區(qū)帶電泳的支持物，用樣量少，分離清晰，對(duì)染料無吸附作用，應(yīng)用范圍廣，快速簡便 ,且染色后的薄膜可用乙醇和冰醋酸溶液浸泡透明，透明后的薄膜便于保存和定量分析。 因此，目前被廣泛用于血清蛋白、脂蛋白、血紅蛋白、糖蛋白、酶的分離和免疫電泳等方面,實(shí)驗(yàn)三血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳,11,醋纖膜分離血清蛋白質(zhì)的方法,以醋酸纖維素薄膜作為支持介質(zhì)，于薄膜一端加微量血清，膜兩端連接于緩沖液。電泳分離后再經(jīng)染色處理，可將血清蛋白質(zhì)分成五條主要的區(qū)帶，從正極依次為

5、清蛋白、1-球蛋白、2-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白,實(shí)驗(yàn)三血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳,12,三、主要試劑與器材,試劑：血清 巴比妥緩沖液 染色液，漂洗液 器材：電泳儀，電泳槽 醋酸纖維素薄膜（28cm） 血清加樣器,實(shí)驗(yàn)三血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳,13,四、操作步驟,1.浸膜：將裁好的醋酸纖維素薄膜浸泡于緩沖液中，充分浸透后用鑷子取出用兩片濾紙吸干（約20min，直到膜上沒有斑點(diǎn)，中間沒有氣泡為止）。 2.點(diǎn)樣：毛面向上，用點(diǎn)樣器，在距膜一端約2cm處，與邊緣平行直線狀點(diǎn)加35L待分離血清。注意取樣適量、均勻；血清線位置適當(dāng)，粗細(xì)均勻，不能有明顯擴(kuò)散現(xiàn)象,實(shí)驗(yàn)三血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電

6、泳,14,不同的點(diǎn)樣方式,正確點(diǎn)樣：直、細(xì),2cm,實(shí)驗(yàn)三血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳,15,錯(cuò)誤的點(diǎn)樣方式：量多、條帶粗,結(jié)果,實(shí)驗(yàn)三血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳,16,錯(cuò)誤的點(diǎn)樣方式：量少，條帶不清晰,結(jié)果,實(shí)驗(yàn)三血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳,17,如何正確點(diǎn)樣,13mm寬的細(xì)長、均勻、連續(xù)條帶,1）移液器的尖嘴：旁邊不沾液滴； （2）移液器的尖嘴蘸點(diǎn)血清后，較快劃一次,血清的高度：決定尖嘴液面的高度決定血清線漫開的寬度,實(shí)驗(yàn)三血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳,18,3.搭橋：首先將雙層濾紙鋪好，分別放置于電泳槽兩端，其下端要浸入緩沖液中。注意：無光澤面朝下；血清線不碰到鹽橋上的濾紙；膜的+”

7、“-”與電泳槽的“+”極、“-”極方向一致,醋酸纖維素薄膜電泳裝置示意圖,實(shí)驗(yàn)三血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳,19,水平電泳槽,實(shí)驗(yàn)三血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳,20,4.電泳：紅正黑負(fù)。 電壓：100V。 電泳時(shí)間約 60min,每人只能放一張膜，最后有空位才可放第二張膜,實(shí)驗(yàn)三血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳,21,5.染色：氨基黑10B, 染色35min. 鑷子夾膜的兩邊，不夾中間 浸泡時(shí)，一條一條地浸，確保每條膜都被染色液完全包裹,實(shí)驗(yàn)三血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳,22,6.漂洗：在裝有漂洗液的2個(gè)漂洗缸中，依次漂去多余染料，直到背景漂白為止。 盡量滴干染色液 一條一條地移 漂洗液的作用：洗去未結(jié)合蛋白質(zhì)的游離染料,染色皿,漂洗皿,實(shí)驗(yàn)三血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳,23,五、結(jié)果與分析,1.定性觀察：指出薄膜上可顯現(xiàn)清楚的五條區(qū)帶分別是什么,實(shí)驗(yàn)三血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳,24,吸水紙上：逐一擺開，找到自己的那條,實(shí)驗(yàn)三血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳,25,六、注意事項(xiàng),1.點(diǎn)樣時(shí),毛面向上,要求樣線粗細(xì)均勻，無明顯擴(kuò)散現(xiàn)象。 2