動物肝臟DNA提取和鑒定參考PPT

1、1,實 驗 五,動物肝臟中DNA的制備和鑒定,學(xué)時：6,2,1、掌握動物組織總DNA的提取方法及其原理。 2、掌握瓊脂糖凝膠電泳分離核酸的原理和方法。 3、學(xué)習(xí)核酸染色的方法,一、實驗?zāi)康?3,二、實驗原理,要獲得純的DNA樣品，必須考慮以下幾點： 如何選材，如何破碎組織細(xì)胞？ 如何除去蛋白質(zhì)？(在真核細(xì)胞內(nèi)，DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合成核蛋白的形式存在。因此，分離DNA時必須使其與蛋白質(zhì)解離，并除去蛋白質(zhì)。) 設(shè)法除去RNA的污染； 防止DNA酶的降解作用,一）動物肝臟DNA制備原理,4,選 材,要提取動物組織DNA，一般選擇細(xì)胞膜較脆弱，容易破碎的動物臟器，如胸腺、肝臟、脾臟、胰臟等,5,研磨：將

2、剪碎的動物組織置于研缽或勻漿器中，加入少量石英砂研磨或勻漿，破碎細(xì)胞。這種方法溫和，適合實驗室使用。 組織搗碎器：較劇烈的破碎細(xì)胞的方法，為了防止發(fā)熱和升溫過高，通常是轉(zhuǎn)10秒20秒，停10秒20秒，可反復(fù)多次。 壓榨法：在1000105Pa2000105Pa 的高壓下使幾十毫升的細(xì)胞懸液通過一個小孔突然釋放至常壓，細(xì)胞將徹底破碎。溫和的、徹底破碎細(xì)胞的方法，但儀器費用較高,細(xì)胞破碎方法機(jī)械物理法,6,反復(fù)凍融法：將待破碎的細(xì)胞冷至15到20，然后放于室溫(或40)迅速融化，由于細(xì)胞內(nèi)形成冰粒使剩余胞液的鹽濃度增高而引起細(xì)胞溶脹破碎。 超聲波處理法：借助超聲波的振動力破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞器。使用時

3、注意降溫，防止過熱。 冷熱交替法：在90左右維持?jǐn)?shù)分鐘，立即放入冰浴中使之冷卻，如此反復(fù)多次，絕大部分細(xì)胞可以被破碎,細(xì)胞破碎方法機(jī)械物理法,7,有機(jī)溶劑處理法：利用氯仿、甲苯等脂溶性溶劑或SDS（十二烷基硫酸鈉）等表面活性劑處理細(xì)胞，可將細(xì)胞膜溶解，從而使細(xì)胞破裂，此法也可以與研磨法聯(lián)合使用。 溶脹法：細(xì)胞膜為天然的半透膜，在低滲溶液和低濃度的稀鹽溶液中，由于存在滲透壓差，溶劑分子大量進(jìn)入細(xì)胞，將細(xì)胞膜脹破釋放出細(xì)胞內(nèi)含物,細(xì)胞破碎方法化學(xué)方法,8,三)除去RNA的方法,脫氧核糖核蛋白在濃NaCl（1-2molL）溶液中溶解度很大，但在0.14molL NaCl溶液中溶解度很低，而核糖核蛋白

4、則溶于0.14molL NaCl溶液中，利用這一性質(zhì)可將脫氧核糖核蛋白與絕大部分核糖核蛋白分離開來,9,四)除去蛋白質(zhì)的方法,用氯仿一異成醇混合液振蕩核蛋白溶液，使蛋白質(zhì)變性，然后離心除去變性蛋白質(zhì)，此時蛋白質(zhì)凝膠停留在水相及氯仿相中間，而DNA溶于上層水相。用兩倍體積 95乙醇溶液可將DNA鈉鹽沉淀出來。 用十二烷基硫酸鈉（SDS）等去污劑使蛋白質(zhì)變性，可以直接從生物材料中提取DNA,10,純的DNA樣品的獲得,為了防止DNA酶的降解，提取時可加入適量EDTA（乙二胺四乙酸）、檸檬酸，以降低DNA酶的活性。 加入RNA酶降解剩余的RNA，獲得純的DNA。 保存：將DNA于濾紙上干燥，溶于1m

5、lTE中低溫保存,11,二）瓊脂糖凝膠電泳分離核酸的原理,瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳分離方法，是一種簡便、快速分離鑒定核酸的方法，已成為分子生物學(xué)及基因工程研究中常用實驗方法之一。 瓊脂糖英文名agarose，是從瓊脂中提取出來的，由半乳糖和3.6-脫水-L- 半乳糖相互結(jié)合的鏈狀多糖。瓊脂糖和瓊脂都可在不同濃度的水溶液下可形成多孔的凝膠，電泳中具有分子篩效應(yīng)。但瓊脂糖含硫酸根比瓊脂少，電滲作用降低，因而分離效果明顯提高,12,DNA分子在pH高于其等電點的溶液中帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動（電荷效應(yīng)） 。 DNA分子泳動速率的大小除與DNA分子的帶電量有關(guān)外，還與DN

6、A分子的大小和空間構(gòu)象有關(guān)（瓊脂糖凝膠的分子篩效應(yīng)）。 電泳時，用溴酚藍(lán)做前沿指示劑，用溴化乙啶 （ethidium bromide，EB） 指示DNA樣品在凝膠中的確切位置。 溴化乙啶是一種熒光染料，可插入DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的兩個堿基對之間，與DNA分子形成絡(luò)合物，在紫外光的激發(fā)下發(fā)出橙黃色的熒光,13,熒光來自兩方面，一是核酸吸收260nm的紫外光，并將能量傳給EB；二是EB本身吸收波長為302nm和360nm的紫外光。這兩方面的能量最終激發(fā)EB發(fā)出波長為590nm的紅橙色熒光。 溴化乙啶可加入凝膠中，也可以在電泳后，將凝膠放在含EB的溶液中浸泡. 溴化乙啶檢測DNA的靈敏度很高，可檢出10

7、ng甚至更少的DNA,14,瓊脂糖凝膠電泳分離核酸的影響因素,1）核酸大小與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系 凝膠中，DNA片段遷移率與DNA分子大小(堿基對的對數(shù))成反比( 20kb) ，因此通過已知大小的標(biāo)準(zhǔn)物移動的距離與未知片段的移動距離時行比較，便可測出未知片段的大小。 （2）核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系不同構(gòu)型DNA的移動速度次序為：閉環(huán)DNA直線DNA開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA. （3）不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離。瓊脂糖濃度/% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0線狀DNA大小/kb 60-5 20-1 10-0.8 7-0.5 6-0.4

8、3-0.2 2-0.1注：DNA片段在5-500bp之間時，一般用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）進(jìn)行電泳分離,15,瓊脂糖凝膠電泳具有以下優(yōu)點,1）操作簡單、制備容易快速、凝膠機(jī)械性能好、電泳速度快、分離DNA片段范圍廣、樣品不需事先處理就可以進(jìn)行電泳。（2）凝膠結(jié)構(gòu)均勻，對樣品吸附小，電泳圖譜清晰，分辨率高，重復(fù)性好。（3）瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結(jié)果可直接用紫外光檢測及定量測定。（4）電泳后區(qū)帶易染色，樣品極易洗脫，便于定量測定。制成干膜可長期保存。因此，瓊脂糖凝膠電泳已成為分子生物學(xué)及基因工程研究中常用實驗方法之一， DNA樣本的分離、純化、鑒定以及相對分子質(zhì)量測定常用瓊脂糖凝膠

9、電泳,16,熒光染料EB染色后，在紫外燈(305nm)下觀察到的電泳結(jié)果,17,熒光染料EB染色的原理和優(yōu)點是什么？ 1、原理： EB：即3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲錠溴鹽(Ethidium Bromide)。 EB是一種扁平分子，它可以嵌入核酸的堿基之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅橙色熒光。 激發(fā)的熒光的能量來源于兩個方面：一是核酸吸收260nm的紫外線后將能量傳遞給EB，二是EB本身吸收302nm和360nm的紫外線的能量。這兩方面的能量最終激發(fā)EB發(fā)射波長為590nm的可見光（紅橙區(qū),18,2、優(yōu)點： （1）染色比較簡便、快捷，一般在1015min就可反應(yīng)。 （2）EB對核酸分子無破

10、壞作用，這是其它染料所不能做 到的。 （3）EB靈敏度高，可檢測出10ng或更少的DNA含量。 （4）既可用于DNA也可用于RNA的檢測。 （5）EB可加到樣品中，也可加到凝膠中，可隨時用紫外 燈檢測電泳的進(jìn)程和效果。 （6）EB-DNA復(fù)合物中的EB發(fā)出的熒光比游離的EB強(qiáng)10倍， 因此不需洗凈凝膠中游離的EB也可檢測出DNA的條帶,19,3、缺點： 溴化乙啶是一種強(qiáng)的致突變劑，在操作和配制試劑時應(yīng)戴手套。含溴化乙啶的溶液不能直接倒入下水道，應(yīng)進(jìn)行處理。 （1）每100ml溶液中加入100mg粉狀活性炭； （2）室溫下放置1小時，不時的搖動； （3）用新華一號濾紙過濾，棄濾液； （4）用塑料

11、袋封裝濾紙和活性炭，作為有害廢物處理。 *溴化乙啶在260分解，在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行焚化后不會有危險性,20,一)材料：動物肝臟 (二)試劑： （1）0.14molLNaCl0.15molL EDTA-Na溶液： （2）20SDS溶液： （3）氯仿一異戊醇(24:1)混合液： （4）95乙醇溶液。 （5）80乙醇溶液。 （6） pH8.0TE緩沖液：10 mmolLTrisHCI，lmmolL EDTANa，其中含RNA酶20ugmL,二、實驗材料、試劑和儀器,21,7）電泳緩沖液：Tris-硼酸EDTA（50TBE）pH8.0。 （8）加樣緩沖液：0.25%溴酚藍(lán)（BPB）40%蔗糖。 （9）溴

12、化乙啶（EB）溶液：10g/ml。 （10）瓊脂糖凝膠：濃度為0.7%。 (三)儀器 （1）穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 （2）可調(diào)微量移液器 （3）水平電泳槽 （4）暗箱紫外透射儀等,22,移液器的使用,使用注意事項：不超量程使用；不倒置；使用完畢調(diào)至最大刻度上,23,三、實驗步驟,1取新鮮動物肝，稱取1g，切成小塊，加入2ml 0.14molL NaCl0.15molL EDTA溶液，于研缽中研磨至勻漿，再加2ml清洗轉(zhuǎn)入離心管中，以4000rmin的轉(zhuǎn)速離心 10min,24,2在上述沉淀物中加入2mL 0.14molL NaCl0.15molL EDTA溶液，然后在60下，滴加 20SDS溶液35滴

13、，邊加邊搖動，再搖動 10min，使核酸與蛋白質(zhì)分離。 3. 加固體氯化鈉0.2g混勻，使其最終濃度達(dá)到l.4molL，水浴30min,25,4加等體積的氯仿一異戊醇，混勻，搖動5min，以4000rmin的轉(zhuǎn)速離心10min。離心管內(nèi)的物質(zhì)分為三層，上層為含DNA的水相層，下層為氯仿一異成醇混合物，中間層為變性蛋白凝膠,26,5吸出上清液，加入2倍體積95乙醇溶液（預(yù)冷），產(chǎn)生沉淀。 6.再以4000rmin的轉(zhuǎn)速離心溶液10min，棄去上清液 (沉淀用80乙醇溶液離心洗滌)。 7將沉淀置于吸水紙上，除盡乙醇，室溫自然干燥后，加入200ul 電極緩沖液，使DNA充分溶解，待用,27,8.凝膠

14、板的制備： （1）取瓊脂糖0.7 g，加1TBE緩沖溶液100ml，于沸水浴中至熔化，制成0.7%的瓊脂糖膠液。 （2）膠床兩頭貼上防水膠帶，形成8mm高的擋墻，壓緊膠帶，置水平臺面上。 （3）插入梳子，梳齒下端離板底0.51mm。 （4）在膠床上滴加23滴 0.5g/mL的EB溶液。 （5）將60凝膠不間斷倒入膠床，高34mm，避免氣泡，搖勻，室溫下凝固。 （6）完全凝固后，撕掉膠帶，置于電泳槽中，加入電泳緩沖液，高于膠面12mm，從一頭輕輕斜拉出梳子，除去產(chǎn)生的氣泡,28,9.加樣： 將樣品DNA溶液與加樣緩沖液以5 ：1的體積比混合，用微量移液器加樣，每加完一個樣品，沖洗三次。加樣量1520 l （加樣時應(yīng)防止碰壞樣品孔周圍的凝膠面以及穿透凝膠底部）。 10.電泳： 為了獲得電泳分離DNA片段的最大分辨率，電場強(qiáng)度不應(yīng)高于5V/cm（兩電極間的距離）開始時用較高電壓(80V)，樣品一進(jìn)入膠內(nèi)則將電壓調(diào)至5V/cm 。當(dāng)染料前沿移至底邊1-2mm時