堿裂解法從Ecoli中制備質(zhì)粒DNA

1、質(zhì)粒DNA制備,一、質(zhì)粒簡(jiǎn)介,質(zhì)粒是細(xì)菌內(nèi)獨(dú)立于染色體并能自我復(fù)制的小環(huán)狀DNA分子 其大小范圍從lkb至200kb以上不等。 已經(jīng)在形形色色的細(xì)菌類(lèi)群中發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒. 這些質(zhì)粒都是獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外進(jìn)行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位,質(zhì)粒通過(guò)細(xì)菌間的接合作用，從雄性體轉(zhuǎn)移到雌性體，是細(xì)菌有性繁殖的性因子 1946年， Lederburg和Fatum發(fā)現(xiàn)的F因子是最早發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒，F(xiàn)因子與高等生物細(xì)胞質(zhì)中的染色體外遺傳單位極為相似。 1952年，由Lederburg正式命名為質(zhì)粒,確切地說(shuō)，質(zhì)粒是細(xì)菌內(nèi)的共生型遺傳因子，它能在細(xì)菌中垂直遺傳并且賦予宿主細(xì)胞表型，是比病毒更簡(jiǎn)單的原始生命,質(zhì)粒依賴(lài)于宿主

2、編碼的酶和蛋白質(zhì)來(lái)進(jìn)行復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。通常，質(zhì)粒含有編碼某些酶的基因，這些酶事實(shí)上在一定的環(huán)境下對(duì)細(xì)菌宿主有利。 由質(zhì)粒產(chǎn)生的表型包括對(duì)抗生素的抗性、產(chǎn)抗生素、降解復(fù)雜有機(jī)化合物，以及產(chǎn)生大腸桿菌素、腸毒素及限制酶與修飾酶等等,質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的重要媒介物，這種基因運(yùn)載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價(jià)值，而質(zhì)粒的分離與提取則是最常用、最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù),二、質(zhì)粒特性,1. 分子相對(duì)小,在5kb左右，質(zhì)粒較小，比較穩(wěn)定，不易受物理因素的損傷，此外，較小的質(zhì)粒一般有較高的拷貝數(shù),2. 含有高效的自主復(fù)制成分,質(zhì)粒的復(fù)制與宿主細(xì)胞的繁殖不相關(guān)，在抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成時(shí)，細(xì)菌染色體DN

3、A停止復(fù)制，但這種質(zhì)粒可繼續(xù)利用細(xì)菌原有的酶系進(jìn)行復(fù)制,質(zhì)粒含有復(fù)制起始點(diǎn)，此起始點(diǎn)及順式作用調(diào)控元件組成一個(gè)復(fù)制子(replicon)，能利用細(xì)菌染色體DNA復(fù)制所用的同一套酶系統(tǒng)，在細(xì)菌細(xì)胞中獨(dú)立地進(jìn)行自我復(fù)制及轉(zhuǎn)錄,根據(jù)所含復(fù)制起始區(qū)的不同，有些質(zhì)粒的復(fù)制與宿主細(xì)胞染色體的復(fù)制同步，每個(gè)細(xì)胞只含有一個(gè)或幾個(gè)拷貝的質(zhì)粒，即處于“嚴(yán)密控制,有些質(zhì)粒則處于“松弛控制”，每個(gè)細(xì)胞可含達(dá)15-20乃至數(shù)百拷貝的質(zhì)粒。這類(lèi)質(zhì)粒在宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)停止合成(加入氯霉素)、染色體DNA停止復(fù)制的條件下，拷貝數(shù)繼續(xù)增加至數(shù)千,3.不相容性,利用同一復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒不能穩(wěn)定地和平共處，可稱(chēng)之為不相容質(zhì)粒，當(dāng)兩

4、個(gè)上述質(zhì)粒被導(dǎo)入同一細(xì)胞時(shí)，它們?cè)趶?fù)制及隨后分配到子細(xì)胞的過(guò)程中彼此競(jìng)爭(zhēng),由于質(zhì)粒分子是從細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒庫(kù)中隨機(jī)選取出來(lái)進(jìn)行復(fù)制的，所以?xún)蓚€(gè)不同的質(zhì)粒在一個(gè)單細(xì)胞中的拷貝數(shù)并不總能保持相同。最初在隨機(jī)過(guò)程中產(chǎn)生的微小差異，將很快導(dǎo)致兩種質(zhì)粒在拷貝數(shù)上更嚴(yán)重地失衡,在一些細(xì)胞中，一種質(zhì)粒處于優(yōu)勢(shì)，而在另一些細(xì)胞中，與之不相容的另一種質(zhì)粒卻占盡上風(fēng)。細(xì)菌生長(zhǎng)幾代之后，占少數(shù)的質(zhì)粒將會(huì)喪失殆盡，在原始細(xì)胞的后代中可含有兩種質(zhì)粒中的任意一種，但不會(huì)兼而有之,通過(guò)檢查不同質(zhì)粒在同一細(xì)胞中共存的能力，可以把它們分為若干不相容組。帶有相同復(fù)制子的質(zhì)粒屬于同一不相容組，而帶有不可互換成分的復(fù)制子的質(zhì)粒則屬于不同

5、的不相容組?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)30多個(gè)這樣的不相容組,4. 轉(zhuǎn)移性,在自然條件下，很多質(zhì)粒都可以通過(guò)一種稱(chēng)為細(xì)菌接合的作用轉(zhuǎn)移到新宿主內(nèi),5. 選擇的標(biāo)記,質(zhì)粒應(yīng)帶有一個(gè)或幾個(gè)可供選擇的標(biāo)記，便于對(duì)轉(zhuǎn)化株的篩選,常用來(lái)作為標(biāo)記的有氨芐青霉素抗性(ampicillin resistance，ampr)基因，此基因編碼內(nèi)酰胺酶，該酶能水解氨芐青霉素的內(nèi)酰胺環(huán)使之失效，從而賦予細(xì)菌抗藥性,另一常用的抗藥性基因?yàn)樗沫h(huán)素抗性(tetracycline resistance，tetr)基因，該基因編碼一種含399氨基酸殘基的膜相關(guān)蛋白質(zhì)，能阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。 ampr基因或tetr基因若被外源基因插入，便失去相應(yīng)

6、的抗藥性，便于分子克隆的篩選,大腸桿菌的lac Z基因也常被用作為選擇的標(biāo)記，此基因編碼半乳糖苷酶，能分解一種有色基因(x)與半乳糖以糖苷鍵連結(jié)成的化合物x-gal。 半乳糖苷酶 X-gal X + gal 無(wú)色 藍(lán)色產(chǎn)物 半乳糖,若在含有X-gal的培養(yǎng)劑中，在乳糖操縱子(lac operon)誘導(dǎo)物異丙硫半乳糖苷(isopropylthiogalactoside，IPTG)的作用下，細(xì)菌合成半乳糖苷酶，分解Xgal，此菌落成為藍(lán)色。 若lacZ基因被外源DNA片斷插入而破壞，則不能制造半乳糖苷酶，菌落為白斑,6. 限制性?xún)?nèi)切酶單一切口,在質(zhì)粒復(fù)制子以外的部位具有一種或多種限制性?xún)?nèi)切酶的單一

7、切口，便于外源基因的插入。 若這種單一的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)處于選擇標(biāo)記基因的內(nèi)部，外源基因片斷插入后會(huì)導(dǎo)致該基因失活便于篩選,三、常用質(zhì)粒載體,1. pBR322,pBR322是一種使用最廣泛的質(zhì)粒，全長(zhǎng)為4 363bp，由3種野生型質(zhì)粒成分組成，ampr基因來(lái)自pRSF2124，tetr來(lái)自pSCl01，復(fù)制起始點(diǎn)來(lái)自pM9。核苷酸的序次號(hào)，以EcoRI序列GAATTC的第一個(gè)T為第一個(gè)核苷酸,2. pUC系統(tǒng),如pUCl8和pUCI9，由pBR322的ampr基因和復(fù)制子，以及大腸桿菌部分1acZ基因和一個(gè)多種限制性?xún)?nèi)切酶單一位點(diǎn)的接頭構(gòu)成，全長(zhǎng)2 666bp，pUCl8和pUCl9所含多位

8、點(diǎn)接頭的方向正好相反,3表達(dá)載體,載體含有tac啟動(dòng)子、Lac操縱基因、SD序列、Lac I阻遏蛋白基因等,四、質(zhì)粒DNA的提取和純化,一）、質(zhì)粒提取的主要步驟,1細(xì)菌的培養(yǎng),先分離單個(gè)菌落， 接種到含少量適當(dāng)抗生素的培養(yǎng)基中擴(kuò)增，隨著細(xì)菌的生長(zhǎng)，質(zhì)粒DNA也在自主復(fù)制,對(duì)于松弛型質(zhì)粒，由于它的復(fù)制在一定程度上受到宿主細(xì)胞的控制，故在細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，加入氯霉素抑制宿主蛋白質(zhì)的合成和染色體DNA的復(fù)制。質(zhì)粒DNA的復(fù)制不受影響而大量擴(kuò)增,對(duì)于新一代的質(zhì)粒如pUC系列等，由于宿主對(duì)這些松弛型質(zhì)粒的復(fù)制控制不嚴(yán)，利用氯霉素對(duì)質(zhì)粒DNA的選擇性擴(kuò)增并不十分必要,長(zhǎng)時(shí)間在氯霉素存在下，質(zhì)粒DNA合成過(guò)

9、程中，復(fù)制鏈中會(huì)摻入核糖核苷酸，對(duì)堿性條件敏感，將會(huì)導(dǎo)致大量的缺口環(huán)狀DNA和線(xiàn)性質(zhì)粒的產(chǎn)生,但有些人仍然偏愛(ài)用氯霉素選擇性擴(kuò)增質(zhì)粒，其理由是在中等體積培養(yǎng)物中能獲取與大量培養(yǎng)物等同的質(zhì)粒產(chǎn)量。而且細(xì)菌量的減少，使得裂解物的復(fù)雜性和粘稠度降低，操作更方便、有效，對(duì)煮沸法更是如此。所以使用氯霉素的主要目的，是在不減低質(zhì)粒產(chǎn)量的前提下，減少細(xì)菌的培養(yǎng)體積和細(xì)菌的數(shù)量,有時(shí)質(zhì)粒在細(xì)菌中的擴(kuò)增狀況很差，常是由于質(zhì)粒攜帶外源基因或質(zhì)粒分子量過(guò)大所致。 這種低效率擴(kuò)增，可利用高營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基促進(jìn)生長(zhǎng)，一般可增加質(zhì)粒產(chǎn)量4-6倍,2細(xì)菌的收集與裂解,細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中，排出大量代謝產(chǎn)物，為了提高質(zhì)粒DNA的純度，離

10、心棄上清，細(xì)菌沉淀最好用STE或生理鹽水懸浮，漂洗l-2次，離心管壁上的液體也應(yīng)該仔細(xì)去除干凈,細(xì)胞的裂解方法很多，如去污劑法，沸水熱裂法、堿變性法，有機(jī)溶劑法和溶菌酶法等。 不同方法各有利弊，一般要根據(jù)質(zhì)粒性質(zhì)、宿主菌的特性及后繼的純化方法等多種因素綜合后加以選擇,3質(zhì)粒DNA純化,質(zhì)粒從細(xì)菌中分離出來(lái)以后，為滿(mǎn)足有些實(shí)驗(yàn)的要求還應(yīng)進(jìn)一步純化。CsCl溴乙錠平衡超速離心法是純化質(zhì)粒的可靠經(jīng)典方法,但是由于此法費(fèi)用昂貴及流程長(zhǎng)，近年來(lái)，發(fā)展了幾種不同的方法取代了超離法。如離子交換層析法或排阻層析法，分級(jí)聚乙二醇沉淀法等，也可獲得較好質(zhì)量的質(zhì)粒DNA,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染及DNA外切酶酶切缺

11、失等實(shí)驗(yàn)，對(duì)閉合環(huán)狀雙鏈DNA的要求較高，一般還是用超速離心法純化質(zhì)粒,對(duì)于DNA片段酶切回收，內(nèi)切酶圖譜分析、細(xì)菌轉(zhuǎn)化、亞克隆及探針?lè)派湫詷?biāo)記等實(shí)驗(yàn)，直接用小量或中量提取的DNA樣品，并不需要超速離心純化，一般可滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求,二） 質(zhì)粒DNA的制備,質(zhì)粒DNA的小量制備 2-5ml 質(zhì)粒DNA的大量制備 500ml 堿裂解法 煮沸法 SDS裂解法 Triton-溶菌酶法,三）質(zhì)粒DNA提取方法的選擇,常用的煮沸法，堿法,SDS法均可獲得較滿(mǎn)意效果至于有人采用堿法提取小量細(xì)菌培養(yǎng)物的質(zhì)粒， 用煮沸法或SDS法進(jìn)行質(zhì)粒DNA的大量分離， 只是各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的習(xí)慣問(wèn)題,但是對(duì)于不同的菌株和不同大小的質(zhì)

12、粒DNA分子及以后進(jìn)行的不同實(shí)驗(yàn)等具體情況，選擇哪種方法制備質(zhì)粒DNA，應(yīng)考慮以下因素,1菌株類(lèi)型,大量提取HB101，TGl菌株中的質(zhì)粒不提倡選擇煮沸法，這類(lèi)細(xì)菌富含糖類(lèi)，在煮沸或去污劑裂解細(xì)菌時(shí)，大量釋放出來(lái),若用CsCl-EB梯度平衡超速離心， 糖類(lèi)的密度平衡區(qū)域與閉環(huán)共價(jià)質(zhì)粒DNA帶非常鄰近，在抽取閉環(huán)質(zhì)粒DNA時(shí)， 不可避免地污染有糖類(lèi)，它們可抑制許多DNA限制性?xún)?nèi)切酶的活性,另外，HB101及其它含有endA+基因型的菌株表達(dá)中的核酸內(nèi)切酶A，在煮沸時(shí)不能完全失活， 在以后操作中，只要有Mg2+存在(如內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液)，核酸內(nèi)切酶A就可將質(zhì)粒DNA降解，而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,若一定要用

13、煮沸法提取這類(lèi)菌株的質(zhì)粒DNA，不管是大量還是小量制備，必須用酚、氯仿反復(fù)抽提幾次以去除該酶,2質(zhì)粒的大小,大于15kb的質(zhì)粒DNA易被強(qiáng)烈的物理或化學(xué)作用損壞，所以常選用操作過(guò)程較溫和的SDS法。細(xì)菌懸浮液中含有10%蔗糖以提高溶液的滲透壓，減輕細(xì)菌裂解時(shí)DNA泄漏過(guò)快產(chǎn)生的機(jī)械剪切力,在溶菌酶消化細(xì)菌壁與膜后，再加SDS解聚蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合。 整個(gè)操作中物理剪切力小， 適用于大分子量的質(zhì)粒DNA的提取,3細(xì)菌染色體DNA變性條件強(qiáng)弱的控制,堿法是目前實(shí)驗(yàn)室中最常用的質(zhì)粒DNA提取方法。它對(duì)細(xì)菌的裂解，細(xì)菌染色體DNA及蛋白質(zhì)變性充分，所以提取的質(zhì)粒DNA產(chǎn)量高純度好,但是暴露在強(qiáng)堿性環(huán)

14、境中時(shí)間過(guò)長(zhǎng)， 共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA可發(fā)生不可逆的變性，導(dǎo)致內(nèi)切酶切割困難，質(zhì)粒DNA遷移速度降低1倍左右，EB染色效率低,1966年Vinograd等人對(duì)這個(gè)問(wèn)題作過(guò)報(bào)道，但目前，仍有些實(shí)驗(yàn)人員，對(duì)這一關(guān)鍵問(wèn)題并沒(méi)有足夠的重視。如出現(xiàn)這種狀況，在下次提取時(shí)，可以適當(dāng)縮短堿變性時(shí)間，不必按某些書(shū)籍中規(guī)定的10分鐘時(shí)間操作,在煮沸法中，過(guò)長(zhǎng)時(shí)間，過(guò)高熱度也會(huì)導(dǎo)致類(lèi)似問(wèn)題的出現(xiàn)，這種影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的操作細(xì)節(jié)應(yīng)根據(jù)具體的菌株和質(zhì)粒情況加以適當(dāng)改進(jìn),4細(xì)菌的培養(yǎng)與收集,細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中的代謝廢物和脫落的細(xì)胞壁成分，也會(huì)影響到質(zhì)粒的質(zhì)量和內(nèi)切酶酶解效果。所以離心收集細(xì)菌時(shí)，上清液應(yīng)去除干凈，最好用STE或生理鹽水再懸浮，漂洗菌體1-2次,四）堿裂解法原理,在pHl2.0-12.6堿性環(huán)境中，線(xiàn)性的大分子量細(xì)菌染色體DNA變性，而共價(jià)閉環(huán)(CC)質(zhì)粒DNA仍為自然狀態(tài),將pH調(diào)至中性并有高鹽濃度存在的條件下，染色體DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。大部分DNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而CC質(zhì)粒DNA仍然為可溶狀態(tài),