PCR實驗注意事項

1、PCR實驗注意事項12020 年 4 月 19 日文檔僅供參考實驗中的一些好習(xí)慣加 入 試 劑 之 前 , 把 它 混 勻一 下 , 以 免放 置 時 間 長 了濃 度 不 均移液槍用完之后要歸到最大計量的位置，防止久而久之彈簧失去彈一定要記著關(guān)水浴箱，切記性切記多和大家討論，同時多關(guān)注別人討論的經(jīng)驗，這幾乎是最快提高的捷徑了所 有 的試 劑 都自 己配 ， 出 了 問題 才 好 找 原 因防止RNA酶污染的措施1. 所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180的高溫下干烤 6hr 或更長時間。2. 塑料器皿可用 0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機(jī)玻璃 器 具 因 可 被 氯 仿 腐 蝕

2、， 故 不 能 使 用 ） 。3. 有機(jī)玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在 3% H2O2 室溫 10min ，然后用 0.1% DEPC 水沖洗，晾干。4. 配制的溶液應(yīng)盡可能的用 0.1% DEPC，在 37 處理 12hr 以上。然后用高壓滅菌除去殘留的 DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應(yīng)當(dāng)用DEPC 處理過的無菌雙蒸水配制，然后經(jīng)0.22 m濾膜過濾除菌。5. 操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實驗過程中手套要勤換。6. 設(shè) 置 RNA 操 作 專 用 實 驗 室 ， 所 有 器 械 等 應(yīng) 為 專 用 。22020 年 4 月 19 日文檔僅供參考二、常見

3、的RNA酶抑制劑1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一種強(qiáng)烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它經(jīng)過和RNA 酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。2. 異硫氰酸胍：當(dāng)前被認(rèn)為是最有效的 RNA 酶抑制劑，它在裂解組織的同時也使 RNA 酶失活。它既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白 中 解 離 出 來 ， 又 對 RNA 酶 有 強(qiáng) 烈 的 變 性 作 用 。3. 氧釩核糖核苷復(fù)合物：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和 RNA 酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA 酶的活性。4. RNA 酶的蛋白抑制劑（ RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。 RNasi

4、n 是 RNA 酶的一種非競爭性抑制劑，能夠和多種RNA酶結(jié)合，使其失活。5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。因為 DEPc不加選擇的修飾蛋白質(zhì)和RNA，因此在分離和純化RNA過程 中 不 能使 用 ，而 且它 與 一 些 緩沖 液 ( 例 如Tri) 不能 相 容在所有 RNA 實驗中，最關(guān)鍵的因素是分離得到全長的 RNA。而實驗 失 敗 的 主 要 原 因 是 核 糖 核 酸 酶 （ RNA 酶 ） 的 污 染 。 RNA 酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。研究人員造成的污染RNA 酶最主要的潛在污染源是研究人員的手。因此進(jìn)行RNA實驗時應(yīng)勤換手套。

5、但 DEPC能與胺和巰基反應(yīng),因而 含 Tris 和 DTT 的試劑不能用DEPC32020 年 4 月 19 日文檔僅供參考處理（一）動植物總RNA提取-Trizol法Trizol 法適用于人類、動物、植物、微生物的組織或培養(yǎng)細(xì)菌，樣品量從幾十毫克至幾克。用Trizol法提取的總RNA絕無蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑點分析，斑點雜交，Poly(A)分離，體外翻譯，RNase封阻分析和分子克隆。1、將組織在液N 中磨成粉末后，再以50-100mg組織加入1ml Trizol 液研磨，注意樣品總體積不能超過所用Trizol體積的10%。2、研磨液室溫放置5 分鐘，然后以每

6、1mlTrizol 液加入 0.2ml的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15 秒。3、取上層水相于一新的離心管，按每mlTrizol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10 分鐘， 1 g離心10 分鐘。4、棄去上清液，按每ml Trizol 液加入至少1ml的比例加入75%乙 醇 ， 渦 旋 混 勻 ，4 下7500g離 心5分 鐘 。5、小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥5-10分鐘，注意不要干燥過分，否則會降低RNA的溶解度。然后將RNA溶于水中，必要時可 55-60水溶 10 分鐘。 RNA 可進(jìn)行 mRNA 分離，或貯存于 70%乙醇并保存于 -70 。 注意

7、1、整個操作要帶口罩及一次性手套，并盡可能在低溫下操作。42020 年 4 月 19日文檔僅供參考另外，提取上清這步一定要小心，靠近沉淀的部分一定要舍得不要 ， 要 不 然 會 有 蛋 白 質(zhì) 污 染 ， 影 響 比 值2、加氯仿前的勻漿液可在 -70 保存一個月以上， RNA 沉淀在 70% 乙 醇 中 可 在 4 保 存 一 周 ， -20 保 存 一 年 ?？俶RNA的提取(自己的經(jīng)驗)一、關(guān)于TrizolReagent需要的試劑1Chloroform：氯仿(分析純)2Isoproplylalcohol：異丙醇(分析純 )3 75% Ethanol（in DEPC-treated water ） :75%乙醇。要求用分析純無水乙醇并用0.01%的 DEPC 處理過的無Rnase 的水稀釋。4 RNase-free water ：無 Rnase的水。方法是：將DEPC按 0.01%（ V/V）加在 d H2O 中 500ml （50ul ），在 37 過夜，并高壓滅菌即得（1503小時）5一次性塑料手套6注意：DEPC有致癌之嫌二、關(guān)于TrizolReagent的使 用過程：1Homogenization（勻漿）a.Tissues：