血流感染標(biāo)本和呼吸道標(biāo)本操作規(guī)范及臨床意義

1、血流感染標(biāo)本和呼吸道標(biāo)本操作規(guī)范及臨床意義,標(biāo)本類型,血培養(yǎng) 呼吸道標(biāo)本 (痰標(biāo)本、咽部標(biāo)本） 尿培養(yǎng) 腦脊液培養(yǎng) 生殖道標(biāo)本培養(yǎng) 抽吸物和組織標(biāo)本的培養(yǎng)（需氧、厭氧培養(yǎng)） 傷口拭子 糞便培養(yǎng),血培養(yǎng)Blood Culture,血培養(yǎng)是進行血流感染診斷的最佳手段,血培養(yǎng)概念,采集患者的血液或無菌體液標(biāo)本,送至微生物實驗室培養(yǎng)檢測. 檢測原本無菌的血液及體液中是否有細菌存在. 如有細菌,則極有可能為致病的細菌. 進一步進行鑒定/藥敏試驗,完整的血培養(yǎng)過程,醫(yī)師開出醫(yī)囑 護理人員收集送檢樣本 實驗室檢測、分離并鑒定導(dǎo)致血流感染的微生物 三級報告：為臨床醫(yī)生提供抗菌藥物敏感性試驗結(jié)果,目前血培養(yǎng)的問

2、題,采血時機不合適 采血套數(shù)不夠 采血量不足 只做需氧培養(yǎng)，不同時做厭氧培養(yǎng) 采血前或采血時正在使用抗生素治療,血流感染與血培養(yǎng) 的規(guī)范實踐,關(guān)于血培養(yǎng)指征,只有在發(fā)熱時，才需要進行血培養(yǎng)。,想采就采,血培養(yǎng)的指征,當(dāng)懷疑血流感染或膿毒癥時，應(yīng)常規(guī)行血培養(yǎng)。 懷疑患者有血流感染的癥狀有： 不明原因的發(fā)燒(38)或體溫過低(36) 白細胞增多（ 10,000/ul），粒細胞減少（ 1,000/ul） 休克，寒顫，僵直 嚴(yán)重的局部感染(腦膜炎，心內(nèi)膜炎，肺炎，腎盂腎炎，腹部術(shù)后感染，) 心率異常加快 低血壓或高血壓 呼吸頻率加快,關(guān)于采血時機,何時采血進行血培養(yǎng)，無特殊時間要求。,關(guān)于采血套數(shù)及部

3、位,為減輕患者痛苦，只從一個穿刺部位采一份血液標(biāo)本即可。,血培養(yǎng)采血時機,細菌濃度,體溫,0,30,60,時間 (分鐘,基本概念,成人“一套” 血培養(yǎng)應(yīng)該包括需氧瓶和厭氧瓶各一個，也叫“一份” 注意：一次穿刺采血，算“一套”，采集第二套應(yīng)從另一個穿刺點獲得。 兒童一般只做需氧培養(yǎng)，但仍需從多個部位采集多次。特殊患者才考慮厭氧培養(yǎng),采血套數(shù),Weinstein et al. Detection of Bloodstream Infections in Adults: How Many BloodCultures Are Needed J Clin Microbiol. 2007; 45:3546

4、-3548,表皮葡萄球菌的臨床意義,污染菌,致病菌,采集1套無法判斷是病原菌還是污染菌,23套血培養(yǎng)，有助于污染的判斷,關(guān)于血培養(yǎng)套數(shù)與采血部位,每位患者每次采血最少2套，3套更好 初發(fā)患者，絕不能只采1套標(biāo)本 多個穿刺部位采血。因多部位同時發(fā)生污染的幾率較小，便于對結(jié)果進判斷,關(guān)于采血間隔,兩套血培養(yǎng)采集間隔無特殊要求。,關(guān)于標(biāo)本采集間隔時間,對于非持續(xù)性菌血癥，同時或短時間內(nèi)采集2-3套血培養(yǎng)，因為體內(nèi)巨噬細胞吞噬系統(tǒng)會在1530min內(nèi)清除掉進入人體內(nèi)的細菌。 可疑急性心內(nèi)膜炎患者要立即取血作血培養(yǎng)，30分鐘內(nèi)完成3套血培養(yǎng)的采集，采集后立即進行抗菌藥的經(jīng)驗治療。如果24小時內(nèi)報告陰性，

5、則繼續(xù)采集2套血培養(yǎng)。 可疑的亞急性心內(nèi)膜炎患者每間隔30分鐘至1h采集1套，連續(xù)采集3套標(biāo)本。如果24小時內(nèi)報告陰性，則繼續(xù)采集2套血培養(yǎng),關(guān)于采血量,每瓶采集多少血液無特殊要求。,采血量(ml)與檢出率的關(guān)系,血培養(yǎng)物每增加一毫升，真性菌血癥 成年人微生物的檢出率增加3,但并非越多越好，超過一定數(shù)量的采血量會稀釋培養(yǎng)瓶內(nèi)的肉湯，使肉湯無法有效中和血中的抑制物質(zhì)（補體、抗體、抗生素）。所以血液與肉湯的最佳比例為1：41：10,關(guān)于采集血液量,采血量是影響靈敏度最關(guān)鍵因素 成人一份標(biāo)本2個培養(yǎng)瓶（需氧厭氧），每瓶810ml，共20ml；要求至少采兩份標(biāo)本，即40ml。 兒童一般只需采集需氧瓶，

6、在保證采集血量1總血量下，一般為1-3ml 采血量不足時應(yīng)優(yōu)先保證需氧瓶，因臨床90以上的感染為需氧菌或兼性需氧菌感染,關(guān)于各種血液標(biāo)本的采集順序,先采生化、凝血標(biāo)本，再采血培養(yǎng)標(biāo)本。,采各種血液標(biāo)本的先后順序,血培養(yǎng)對無菌操作的要求比注射、采集生化、凝血等其它標(biāo)本要高。 所以要最先采集血培養(yǎng)標(biāo)本。 污染率的指標(biāo)是 3%（100份標(biāo)本里只能有不到3個標(biāo)本出現(xiàn)污染,關(guān)于皮膚及培養(yǎng)瓶消毒,消毒的重點是足夠量的消毒劑。,皮膚消毒程序,推薦使用碘町、洗必泰或碘伏作為皮膚消毒劑。 碘町作用1min 碘伏作用1.5-2min 洗必泰作用時間與碘町一樣（但不能用于少于2個月嬰兒皮膚消毒,培養(yǎng)瓶的消毒程序,去

7、掉培養(yǎng)瓶口的塑料瓶蓋。 75%酒精消毒血培養(yǎng)瓶橡皮塞子60秒。 自然待干。 將標(biāo)本注入培養(yǎng)瓶內(nèi)。 5.顛倒混勻標(biāo)本與肉湯，以避免血液凝集,關(guān)于培養(yǎng)瓶的儲存溫度,培養(yǎng)瓶未使用時，需要冷藏或冷凍。,關(guān)于未用培養(yǎng)瓶的儲存溫度,不需冷藏，更不能冷凍。保存在1525的室溫即可，溫度過低會導(dǎo)致對溫度敏感的耐瑟氏菌等死亡,關(guān)于夜班血培養(yǎng)的送檢,加入標(biāo)本后的培養(yǎng)瓶夜班未能及時送到檢驗科，可以冷藏或放入35的溫箱。,關(guān)于夜班血培養(yǎng)的送檢,培養(yǎng)瓶夜班未能及時送到檢驗科，存在室溫即可，不能冷藏也不能放入35 的溫箱 。過夜不會對檢測造成影響，但仍需盡快送檢。冷藏可能導(dǎo)致對溫度敏感的耐瑟氏菌等死亡。溫箱會導(dǎo)致細菌進入

8、生長對數(shù)期，從而錯過檢測的最佳時期,關(guān)于采血部位,患者靜脈中插有導(dǎo)管，可直接從導(dǎo)管采血。,關(guān)于從靜脈留置裝置直接采血,不可以，常規(guī)血培養(yǎng)不宜從靜脈導(dǎo)管或靜脈留置裝置中采集，檢出污染或定植菌的可能性較大。除非懷疑導(dǎo)管相關(guān)性血流感染，請參照導(dǎo)管相關(guān)性血流感染的采血方法,血培養(yǎng)標(biāo)本的拒收,瓶子上帖的標(biāo)簽錯誤或未帖標(biāo)簽。 血培養(yǎng)瓶打破的、損壞的或滲漏。 血液凝固,培養(yǎng)基的選擇,推薦使用商品化的培養(yǎng)基 使用添加抗菌藥物吸附劑的血培養(yǎng)瓶有助于提高已接受抗菌藥物治療患者血培養(yǎng)的檢出率，增加細菌的分離率和分離速度，但同時也會增加污染菌的檢出率,血培養(yǎng)報陽時間,當(dāng)前推薦的連續(xù)血培養(yǎng)檢測系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)時間為5天

9、大部分臨床意義的致病菌都在培養(yǎng)的前3天檢出 在培養(yǎng)的前2天,檢出率為94,Bourbeau PP., Foltzer M. Routine incubation of BacT/ALERT FA and FN blood culture bottles for more than 3 days may not be necessary. J Clin Microbiol. 2005;43:2506-2509,血培養(yǎng)的危急報告制度,1.初步報告 血培養(yǎng)陽性報警后，應(yīng)立即抽取培養(yǎng)液進行涂片、革蘭染色、顯微鏡鏡檢，初步藥敏試驗，并將結(jié)果向臨床主管醫(yī)生進行緊急報告。 2.二級報告 陽性報警的血培養(yǎng)轉(zhuǎn)種

10、培養(yǎng)基培養(yǎng)1618小時后，觀察培養(yǎng)基上菌落形態(tài)、革蘭染色后菌體形態(tài)以及初步藥敏結(jié)果，盡可能通知臨床初步鑒定結(jié)果和某些耐藥特征。 3. 最終（書面）報告 報告最終菌種鑒定及藥敏試驗結(jié)果,菌種鑒定對判斷血培養(yǎng)污染的價值,當(dāng)分離出的微生物為金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌以及其他腸桿菌科細菌、銅綠假單胞菌、白色假絲酵母菌時，90%以上是血流感染病原菌。 分離出化膿性鏈球菌、無乳鏈球菌、產(chǎn)單核李斯特菌、腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、其它假絲酵母菌和新型隱球菌時污染的可能性更低。 棒狀桿菌、微球菌、氣球菌、芽胞桿菌、丙酸桿菌、草綠色鏈球菌和凝固酶陰性葡萄球菌等很少是菌血癥的病原菌，如重復(fù)檢出才考慮為

11、病原菌,臺大醫(yī)院BACTEC 9240 18臺,les)/episode 2-3 sets (4-6 bottles)/episode 9,000-10,000 bottles/month 100,000 bottles/year,臺灣長庚醫(yī)院BACTEC 9240 23臺,呼吸道標(biāo)本Respiratory Cultures,上呼吸道標(biāo)本 Upper Respiratory Tract Specimens,上呼吸道感染,絕大部分呼吸道感染局限于口咽、鼻咽和鼻腔部位； 導(dǎo)致 咽痛、鼻涕、常常會發(fā)熱。感染喉部、中耳、鼻竇炎、結(jié)膜炎或角膜炎。 可能與嚴(yán)重疾病百日咳、流行性感冒、麻疹和傳染性單核細胞增

12、多癥并存,下呼吸道標(biāo)本 Lower Respiratory Tract Specimens,下呼吸道感染,急性支氣管炎 社區(qū)獲得性肺炎 院內(nèi)獲得性肺炎 免疫妥協(xié)患者肺炎,下呼吸道標(biāo)本,自然咳痰,誘導(dǎo)痰,氣管內(nèi)吸取物,支氣管肺泡灌洗液,保護性毛刷,支氣管灌洗液,肺部組織,病原體種類繁多而復(fù)雜,使下呼吸道感染病原診斷成為難題,細菌（包括放線菌與奴卡菌，厭氧菌與分枝桿菌） 真菌（包括肺孢子菌） 病毒 支原體、衣原體與立克次體 原蟲 寄生蟲,咳痰途經(jīng)口咽部,不可避免地受到污染,唾液中口咽部定植菌的濃度可達108-109/ml。 研究顯示，國內(nèi)常規(guī)痰標(biāo)本中約半數(shù)存在唾液嚴(yán)重污染現(xiàn)象,我國痰細菌培養(yǎng)現(xiàn)狀,

13、標(biāo)本送檢率低 苛養(yǎng)菌檢出率極低 結(jié)果重復(fù)性差 報告速度慢 感染菌與污染菌不易區(qū)分 藥敏結(jié)果與治療反應(yīng)存在差距,咳痰標(biāo)本的采集,標(biāo)本采集方法 醫(yī)師或護士直視下采集標(biāo)本 病人先漱口，去除表面的菌群 教育病人深咳，收集從下呼吸道咳出的痰液 臨床上約半數(shù)咳痰標(biāo)本不合格,痰標(biāo)本的正確采集,人工氣道：氣管內(nèi)吸引，可避免口腔正常菌群的污染。敏感性（38%-100%）特異性（14%-100%）。 PSB(聚苯乙烯-丁二烯共聚物):保護性毛刷采樣獲取下呼吸道分泌物進行培養(yǎng)。敏感性（33%-100%）特異性（50%-100%）。 BALF(支氣管肺泡灌洗液 ):支氣管肺泡灌洗液獲取下呼吸道分泌物進行培養(yǎng)敏感性（4

14、2%-93%）特異性（45%-100%）,標(biāo)本質(zhì)控,判斷是否合格標(biāo)本：白細胞：鱗狀上皮細胞2.5：1 痰涂片：平時處理痰標(biāo)本就必須涂片，這是基本工作之一，不會因為院感和臨床醫(yī)生的要求而增加，也不會因為他們不要求，或者人手不足就不做。就如同建房子之前要挖地基一樣，不會因為客戶不要求就省掉這個步驟 痰培養(yǎng)：取膿性痰、粘液膿性痰,標(biāo)本質(zhì)量,帶血痰,唾液or誘導(dǎo)痰 (,膿痰,粘液樣痰,細胞學(xué)篩選標(biāo)本,合格標(biāo)本 下呼吸道咳出的痰，含鱗狀上皮細胞少，白細胞較多。白細胞：鱗狀上皮細胞2.5：1,不合格標(biāo)本 指唾液或唾液嚴(yán)重污染的痰標(biāo)本，含鱗狀上皮細胞多，而白細胞少。白細胞：鱗狀上皮細胞2.5:1,細胞內(nèi)細菌

15、,胞內(nèi)細菌 提示感染,柱狀纖毛上皮細胞,肺泡巨噬細胞,滑石顆粒,淀粉樣小體,見于遷延長時間的呼吸道疾病,彈性纖維,庫什曼螺旋體,呈鏈排列的革蘭陽性球菌和革蘭陰性球桿菌。缺乏鱗狀上皮細胞提示混合厭氧菌感染,你看見多少種形態(tài),幾種細菌的混合形態(tài)，缺乏鱗狀上皮細胞=混合厭氧菌感染。如果是呼吸道標(biāo)本可能是吸入性肺炎。報告臨床醫(yī)生“提示吸入性肺炎,呼吸道標(biāo)本中未被染色的，有折射的桿菌=抗酸桿菌,呈鏈排列的革蘭陽性球菌？或革蘭陽性分枝桿菌,肺中的結(jié)節(jié)吸出物，不規(guī)則“球菌”，分叉，無短鏈，鏈的末端的呈尖狀，都證明是分枝狀的革蘭陽性桿菌，可能是放線菌或諾卡菌（通常來自腦或肺組織的標(biāo)本,呼吸道標(biāo)本的涂片評估模式

16、,痰標(biāo)本的培養(yǎng),前處理：用無菌鹽水將痰洗滌3次，除去痰液表面的常居菌，加入等量的1%胰酶溶液（PH7.6），3530min，使痰液均值化后備用。 分離培養(yǎng)：處理后的痰液分區(qū)劃線接種于血瓊脂平板、嗜血巧克力平板和麥康凱（或EMB、中國藍）瓊脂平板，置5%-10%CO2環(huán)境中，35培養(yǎng)18-24h，根據(jù)菌落及形態(tài)（革蘭染色）特點，作出初步判斷,常用培養(yǎng)基作用及成分,血平板：判讀細菌在體內(nèi)的基本生長情況，分離培養(yǎng)苛氧和非苛氧菌。 基礎(chǔ)成分：特殊蛋白胨、淀粉、氯化鈉、瓊脂粉、蒸餾水。 特殊成分：脫纖維綿羊血，鑒別溶血反應(yīng)和提供X因子（血紅素）。 嗜血巧克力平板：分離培養(yǎng)苛氧菌，尤其適用與嗜血桿菌。 基

17、礎(chǔ)成分：特殊蛋白胨、淀粉、氯化鈉、瓊脂粉、蒸餾水。 特殊成分：血紅蛋白粉和NAD分別含X因子和V因子，嗜血桿菌生長所必須；萬古霉素，抑制陽性菌生長。 麥康凱：用于檢測大腸菌群和腸道致病菌。 基礎(chǔ)成分：蛋白胨、氯化鈉、瓊脂粉、蒸餾水。 特殊成分：乳糖和中性紅，大腸菌群為粉紅/紅色，腸道致病菌為透明；3號膽鹽和結(jié)晶紫，抑制陽性菌及真菌生長,平板的初步判讀,條件致病菌：又為機會致病菌，在某種特定的條件下致病的細菌，為人體正常菌群，但其聚集部位發(fā)生改變、機體抵抗力降低或菌群失調(diào)時可致病。痰標(biāo)本的正常菌群主要以陽性菌為主。 接板、讀板順序：血平板、嗜血巧克力平板、麥康凱平板 血平板：反映細菌在體內(nèi)的生長

18、情況，用于半定量的判斷，觀察是否存在溶血、判斷優(yōu)勢菌。 嗜血巧克力平板：抑制革蘭陽性菌，革蘭陰性菌及真菌生長良好，不能用于半定量的判斷，主要用于流感嗜血桿菌鑒定,平板的初步判讀,流感嗜血桿菌：革蘭陰性短小桿菌，氧化酶、觸酶反應(yīng)不定，嗜血巧克力平板上形成微小、無色透明似露滴狀的菌落，有特殊氣味。血平板可形成“衛(wèi)星現(xiàn)象”。 鑒別診斷：流感：V+X因子；副流感：V因子 麥康凱平板：抑制革蘭陽性菌及真菌，革蘭陰性菌生長良好，不能用于半定量的判斷，主要用于大腸菌群與腸道致病菌、非發(fā)酵菌的鑒定。 大腸菌群包括埃希菌屬和腸桿菌科，發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，菌落顏色粉紅或紅色。 腸道致病菌、非發(fā)酵菌包括沙門、志賀、假單胞

19、菌屬、不動桿菌屬等。不發(fā)酵乳糖，菌落顏色透明或半透明,細菌的初步鑒定,一、判斷溶血 溶血：不完全溶血，主要有草鏈、肺鏈（濕潤、臍窩狀、OP陽性）、糞腸、屎腸等。 溶血：完全溶血，主要有金葡、溶葡、甲型/乙型鏈球菌、銅綠、大腸、李斯特菌、芽孢桿菌（污染）等。 溶血：不溶血 二、觀察菌落形態(tài) 革蘭陰性桿菌：菌落較大、濕潤、扁平、部分有特殊氣味（大腸、銅綠）；革蘭染色陰性。 革蘭陽性球菌：菌落較小、干燥、凸起、部分有特殊氣味（葡萄球菌屬）；革蘭染色陽性,細菌的初步鑒定,三、生化鑒定 革蘭陽性菌： 觸酶陽性：葡萄球菌屬、李斯特菌屬等。 觸酶陰性：鏈球菌菌、腸球菌屬等。 凝固酶陽性：金葡、施氏葡、中間葡等 凝固酶陰性：表葡、溶葡、頭葡等，致病力弱，需連續(xù)檢出才能確定為致病菌。 革蘭陰性菌： 氧化酶陽性：假單胞菌屬、弧菌屬、氣單胞菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、奈瑟菌屬等。 氧化酶陰性：埃希菌屬、腸桿菌屬、克雷伯菌屬、沙門、志賀菌屬等。 氧化酶不定：洋蔥、流感等。 值得注意：嗜麥芽氧化酶陰性,培養(yǎng)結(jié)果的判讀,有意義,合格痰標(biāo)本培養(yǎng)優(yōu)勢菌中度以上生長(+