腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)Tumour Invasion Assay

1、腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)（Tumour Invasion Assay） 腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)（Tumour InvasionAssay）可以： （1）研究各種細(xì)胞因子對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響； （2）一些抑制血管生成的新藥研究； （3）研究腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)方法 Matrigel 基質(zhì)膜模型 ?Matrigel 是從小鼠EHS肉瘤中提取的基質(zhì)成分，含有LN、IV型膠原、接觸蛋白和肝素硫酸多糖，鋪在無(wú)聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯濾膜上，能在DMEM培養(yǎng)基中重建形成膜結(jié)構(gòu)，這種膜結(jié)構(gòu)與天然基質(zhì)膜結(jié)構(gòu)極為相似。 濾膜孔徑一般為8um，而且膜孔都被Matrigel覆蓋，細(xì)胞不能自由穿過(guò)，必須分泌水解

2、酶，并通過(guò)變形運(yùn)動(dòng)才能穿過(guò)這種鋪有Martrigel 的濾膜，這與體內(nèi)情況較為相似。 鋪有Martrigel的濾膜放在以Blind Well腔或MICS腔上下室之間，鋪有Martrigel面朝向上室，在下室中加有趨化劑，如一定濃度的LN、FN或小鼠3T3條件培養(yǎng)液或人睪丸上皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液，上室加入重懸的瘤細(xì)胞，具有侵襲能力的細(xì)胞在趨化劑誘導(dǎo)下開(kāi)始穿膜運(yùn)動(dòng)。細(xì)胞穿膜所用的實(shí)驗(yàn)時(shí)間與Martrigel的用量有關(guān)，選擇 25ugMartrigell鋪膜，16小時(shí)后觀察方法結(jié)果較為合適。穿過(guò)濾膜的細(xì)胞多數(shù)粘附在濾膜下表面，可用棉簽將上表原理 面的細(xì)胞拭去，然后用乙醇固定濾膜，PE染色，在光鏡下觀察

3、統(tǒng)計(jì)穿過(guò)Martrigel的細(xì)胞數(shù)。另外用Transwell小室也可進(jìn)行重建基質(zhì)膜侵襲分析，這一方法是在 Transwell小室吊籃式上腔的濾膜上鋪上30ugMartrigel，加入細(xì)胞72h后觀察結(jié)果。值得注意的是，細(xì)胞在TransWll腔中培養(yǎng) 72小時(shí)后，有相當(dāng)數(shù)量穿過(guò)濾膜的細(xì)胞不再粘附在濾膜下表面，而是脫落進(jìn)人下腔溶液中因此統(tǒng)計(jì)穿過(guò)基質(zhì)膜的細(xì)胞數(shù)目時(shí)應(yīng)把這部分細(xì)胞考慮在內(nèi)。腫瘤細(xì)胞穿過(guò)重建基質(zhì)膜的能力與它的體內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移能力表現(xiàn)出較好的相關(guān)性，可以用重建基質(zhì)膜模型初篩抗侵襲藥物。 在上述分析中，如果不在膜上鋪Martrigel而直接將8um孔徑濾膜安放在侵襲腔室上下腔室之間，細(xì)胞通過(guò)變形

4、運(yùn)動(dòng)穿過(guò)濾膜，用這種模型對(duì)分析細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力和藥物對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響。另外，在下室中加有LN或FN或在濾膜下表面鋪上LN或FN，可分析藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的趨化性或趨固性的影響。 實(shí)驗(yàn)Matrigel 基質(zhì)膠 材料試劑、DMEM結(jié)晶紫染料溶液醋酸低血清DMEM培養(yǎng)基FBS-DMEM培養(yǎng)基試劑IFN- 盒 儀器、24-transwell (Coster)離心管冰箱離心機(jī)移液槍槍頭槍頭盒 耗材 一、溶液配制 1. DMEM （1）NE-A液（1 g/l，1 mg/ml） （2）母液0.1 ml（5 mg）+ ddHO up to 5 ml ；過(guò)濾消毒，-20保存。 22. NE-DMEM（-6 M） N

5、E-A液（1 g/l，1 mg/ml） 20.5 l DMEM UP TO 100 ml 過(guò)濾消毒，4保存 3. NE+CGRP-DMEM（-6 M，100 ng） （1）NE-A液（1 g/l，1 mg/ml） 20.5 l （2）CGRP-儲(chǔ)存液 50 l （3）DMEM UP TO 100 ml （4）過(guò)濾消毒，4保存 4. NE+IFN-DMEM（-6 M，50 ng） （1）NE-A液（1 g/l，1 mg/ml） 20.5 l （2）IFN-（25ng/l） 25 l （3）DMEM UP TO 100 ml （4）過(guò)濾消毒，4保存。 5. 低血清DMEM培養(yǎng)基（上室） 實(shí)驗(yàn)6.

6、20?S-DMEM培養(yǎng)基（下室） 步驟 7. Matrigel 基質(zhì)膠 （1）10 mg/ml，5 ml，分裝成0.5 ml/只10個(gè)EP管中。 （2）用時(shí)加入0.5 ml的DMEM。 （3）Matrivgel在冰上維持液態(tài)，室溫時(shí)可迅速凝結(jié)成膠。 二 、 準(zhǔn)備 1. 溶膠，4過(guò)夜。 2. 室溫下基質(zhì)膠易成凝膠，所以，步驟2和3種使用試管和槍頭要在試驗(yàn)前-20C預(yù)冷。 三、 包被基底膜（冰上操作） 1. 用無(wú)血清的冷細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM稀釋Matrigel膠。 2. 取100 ul稀釋膠加到24-well transwell上室中。 3. 37孵育transwell至少4-5 h 。 四、 水化

7、基底膜 1. 用無(wú)血清培養(yǎng)基輕洗凝膠 。 準(zhǔn)備細(xì)胞懸液和小室 、 五1. 消化法從細(xì)胞培養(yǎng)瓶中獲取細(xì)胞。 2. 用培養(yǎng)基洗3遍。 5 cells/ml，1% FBS 510。 3. 重懸細(xì)胞，4. 上室加200 ul細(xì)胞懸液。 5. 下室中加入600 ul細(xì)胞培養(yǎng)基，含有5 ug/ml fibronectin作為黏連亞族。 六 、 孵育 37，20 to 24 h 。 七 、 染色和計(jì)數(shù) 1. 棉簽擦去上室上面的非侵襲細(xì)胞。 2. 移去transwells，倒置，風(fēng)干。 3. 24孔板中加入500 l含0.1%結(jié)晶紫，將小室置于其中，使膜浸沒(méi)在培養(yǎng)基中，37 30min后取出，PBS清洗。 4. 直徑上取4個(gè)視野，照相，計(jì)數(shù)。 5. 24孔板中加入500 l 33%醋酸，將小室置于其中，浸膜，振蕩10 min，充分溶解。取出小室，24孔板于酶標(biāo)儀上570nm測(cè)OD值，間接反應(yīng)細(xì)胞數(shù)。 展開(kāi) 1. 照相前一定要晾干，照相時(shí)將小室正置于載玻片上，在倒置顯微鏡下觀察