（推薦精選）結(jié)核分枝桿菌的核酸檢測

1、結(jié)核分枝桿菌核酸及血清學(xué)檢測,1,結(jié)核分枝桿菌核酸檢測是檢測結(jié)核分枝桿菌特異的核酸序列； 陽性結(jié)果提示該檢測結(jié)核分枝桿菌核酸的存在，在排除核酸污染的情況下，可確定該檢測標(biāo)本中存在結(jié)核分枝桿菌。 結(jié)核分枝桿菌核酸檢測較常采用的目的片段有16SrRNA、IS6110、MBP64、rpoB、hsp65等,2,結(jié)核分枝桿菌核酸檢測,增加分子生物學(xué)陽性可以作為確診標(biāo)準(zhǔn)，及強(qiáng)調(diào)病原學(xué)檢查的重要性。 3.4.2 分子生物學(xué)檢查 結(jié)核分枝桿菌核酸檢測陽性。 4 診斷原則 肺結(jié)核的診斷是以病原學(xué)（包括細(xì)菌學(xué)、分子生物學(xué)）檢查為主，結(jié)合流行病史、臨床表現(xiàn)、胸部影像、相關(guān)的輔助檢查及鑒別診斷等，進(jìn)行綜合分析做出診斷

2、。以病原學(xué)、病理學(xué)結(jié)果作為確診依據(jù)。 5.3 確診病例 結(jié)核分枝桿菌核酸檢測陽性，及胸部影像學(xué)檢查支持即可確診,3,常用技術(shù),傳統(tǒng)實時熒光定量PCR檢測 半巢式全自動實時熒光定量PCR檢測 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測 實時熒光核酸恒溫擴(kuò)增檢測 交叉引物恒溫擴(kuò)增檢測 基因探針檢測,4,5,結(jié)核菌需要先培養(yǎng)出來（2-6周） 再加入不同濃度抗菌藥物的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)4-8周報告藥敏結(jié)果,6,2014年WHO關(guān)于結(jié)核診斷的標(biāo)準(zhǔn),肺結(jié)核 所有患者，包括兒童，當(dāng)疑似肺結(jié)核并可咳痰時，應(yīng)送2份痰做涂片鏡檢 或 1份痰做Xpert MTB/RIF檢測 對于涂陰疑似肺結(jié)核患者，應(yīng)當(dāng)使用Xpert MTB/RIF 或培養(yǎng)

3、 進(jìn)行診斷 耐藥結(jié)核 當(dāng)患者具有耐藥結(jié)核的風(fēng)險，或者合并HIV感染，或者病情嚴(yán)重時，應(yīng)使用Xpert MTB/RIF做初始診斷； 肺外結(jié)核 所有患者，包括兒童，懷疑有肺外結(jié)核時，應(yīng)當(dāng)采集相應(yīng)的樣本進(jìn)行微生物學(xué)和組織學(xué)檢查；優(yōu)先推薦使用Xpert MTB/RIF 做初始診斷,7,GeneXpert,Xpert MTB/RIF 一種半巢式實時熒光PCR體外診斷技術(shù)，可以檢測結(jié)核分枝桿菌以及利福平耐藥性； 針對rpoB基因81bp利福平耐藥核心區(qū)間（RRDR）設(shè)計引物、探針。5個探針結(jié)合到野生型，而不是突變體目標(biāo)。每個探針用不同的熒光染料標(biāo)記，允許同時檢測,8,9,INH單耐藥的患者通常不會考慮立即

4、改變治療方案，與此相反，對RIF單耐藥的患者，無論INH是否耐藥，都會采取與耐多藥患者相同的治療方案1。 約90%利福平耐藥的結(jié)核患者同時異煙肼耐藥，也就是耐多藥結(jié)核患者2。 Sven O. Friedrich et al,. Suitability of Xpert MTB/RIF and Genotype MTBDRplus for Patient Selection for a Tuberculosis Clinical Trial. Journal of Clinical Microbiology. 2011 (49):2827-2831. Xichao Ou et al. A fea

5、sibility study of Xpert MTB/RIF test at the peripheral level laboratory in China. International Journal of Infectious Diseases. 2015 (31):41-46,MTB/RIF檢測對MDR-TB的防控,結(jié)核+利福平耐藥”對多耐結(jié)核控制產(chǎn)生的效果最為顯著。即便補充異煙肼耐藥，能提升的效果有限,10,環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增儀（TB-LAMP） 體外定性檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群； 在恒溫條件下進(jìn)行基因擴(kuò)增反應(yīng)； 4種引物識別6個區(qū)域，特異性高； 擴(kuò)增反應(yīng)效率高，67，40min。 主要

6、優(yōu)點在于對實驗室儀器的依賴程度較小，而且試劑成本較低,11,傳統(tǒng)實時熒光定量PCR檢測,目的：定量檢測人標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌核酸 原理：PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累計實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的辦法,12,13,樣本類型（一,抗酸桿菌涂片鏡檢： 痰液、支氣管灌洗液、支氣管抽吸物、肺穿刺物、肺活檢標(biāo)本、胃灌洗液、體液、組織、膿腫物、吸出的膿液、創(chuàng)傷標(biāo)本、大便標(biāo)本 分枝桿菌分離培養(yǎng)： 痰液、支氣管灌洗液、支氣管抽吸物、肺穿刺物、肺活檢標(biāo)本、胃灌洗液、體液、組織、膿腫物、吸出的膿液、創(chuàng)傷標(biāo)本、大便標(biāo)本、血液 結(jié)核分枝桿菌的核酸檢測： 痰液、支氣管灌

7、洗液、支氣管抽吸物、肺穿刺物、肺活檢標(biāo)本、胃灌洗液、體液、組織、膿腫物、吸出的膿液、創(chuàng)傷標(biāo)本、大便標(biāo)本、血液（GeneXpert除外）、病理切片,14,樣本類型（二,分枝桿菌菌種鑒定 臨床分枝桿菌分離培養(yǎng)物 結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗： 臨床分離結(jié)核桿菌純培養(yǎng)物 結(jié)核抗體的檢測： 血清 IFN-釋放試驗（T-SPOT.TB）： 肝素鋰或肝素鈉抗凝血,15,標(biāo)本留取標(biāo)準(zhǔn),1.痰標(biāo)本： （1）可疑肺結(jié)核患者：初診病人應(yīng)收集3份標(biāo)本（當(dāng)日即時、夜間和次日晨痰），治療中或隨訪病人應(yīng)按期留取2份痰標(biāo)本（晨痰、夜間痰），體積35ml，盛于廣口和具有螺旋蓋子的痰瓶中。 （2）即時痰采集后立即送檢，夜間痰和晨

8、痰采集后常溫保存不應(yīng)超過12小時，對當(dāng)日不能進(jìn)行涂片檢查的標(biāo)本，須置于4冰箱保存，注意防止痰液干涸或污染。 （3）對無法咳痰的患者：可使用高滲鹽水（3% NaCl）誘導(dǎo)痰或收集清晨胃液標(biāo)本，或使用支氣管鏡采集支氣管灌洗液標(biāo)本,16,2支氣管抽吸物、支氣管肺泡灌洗標(biāo)本、肺穿刺物、肺活檢標(biāo)本 （1）對于不能留取痰標(biāo)本的患者：推薦使用侵入性采集技術(shù)獲取標(biāo)本，比如纖維支氣管鏡檢查、細(xì)針肺穿刺、肺活組織檢查。 （2）嚴(yán)格器械清潔和消毒，避免引起交叉污染和感染。 （3）支氣管鏡不能接觸自來水，通免污染環(huán)境分枝桿菌。 （4）對難以診斷的病例推薦使用其他侵入性技術(shù)采集標(biāo)本，比如細(xì)針穿刺、開放肺活組織檢查，無菌

9、條件下采集的經(jīng)支氣管活檢和其他活檢標(biāo)本，運輸過程中，應(yīng)加入0.51ml無菌的生理鹽水。 （5）支氣管分泌物至少25ml；支氣管肺泡灌洗液至少20-50ml,17,3. 胃灌洗液 （1）嬰幼兒、兒童和遲鈍者診斷肺結(jié)核時，鑒于無法采集標(biāo)本或支氣管灌洗液，推薦采集胃液標(biāo)本，通過胃灌洗咽下去的痰液。 （2）標(biāo)本應(yīng)在采集4小時內(nèi)送到實驗室，否則應(yīng)置于一次性內(nèi)含100ml碳酸鈉酸他的無菌容器中。 （3)胃灌洗液需連續(xù)采集3天，體積510ml，調(diào)節(jié)pH至中性。 4.尿液 （1）采集標(biāo)本前，應(yīng)清洗外生殖器，推薦連續(xù)采集3天清晨中段尿于無菌容器中，用于培養(yǎng)的尿液標(biāo)本至少需要40ml （2）只有在不能獲得中段尿時

10、，可以使用導(dǎo)尿術(shù)采集標(biāo)本。 （3）標(biāo)本運送不及時，應(yīng)冷藏保存,18,5. 無菌采集的體液（腦脊液、胸水、腹水、心包積液、關(guān)節(jié)液、骨髓） （1）臨床醫(yī)生采用抽吸技術(shù)或外科操作無菌收集體液標(biāo)本于無菌容器。 結(jié)核桿菌DNA及Xpert標(biāo)本：為防止標(biāo)本凝固，需加入EDTA抗凝處理（可注入于長紫管中顛倒混勻抗凝處理）。 IFN-釋放試驗（T-SPOT.TB）標(biāo)本：分離淋巴細(xì)胞需加入肝素抗凝，抗凝比例為100ml胸腹水加入0.8ml肝素，顛倒混勻。 （2）標(biāo)本盡可能快的運送到實驗室 （3）應(yīng)提交足夠量的樣本，腦脊液5ml，胸水和腹水510ml,19,6無菌采集的組織（淋巴結(jié)、皮膚和其他活檢標(biāo)本） （1）采

11、集標(biāo)本盡可能無菌操作，放置到無固定劑或防腐劑的無菌容器中，不能浸泡在鹽水或其他液體或用紗布包裹，重量不少于1g。應(yīng)迅速運送到實驗室，對于長時間的運輸，為防止脫水可加入無菌鹽水，保持溫度在415 （2）針對皮膚潰瘍，宜從病變組織周邊采集活檢標(biāo)本。 （3）福爾馬林溶液浸泡過的標(biāo)本不能用于培養(yǎng)檢查。 （4）極少量的活檢標(biāo)本可以浸泡在少量無菌鹽溶液中,20,7.血液 （1）如果血液標(biāo)本接種培養(yǎng)基之前需要運輸，肝素成檸檬酸鹽可以用于抗凝。EDTA抗凝和凝固的血不能做培養(yǎng)。 （2）血液和腦脊液標(biāo)本培養(yǎng)推使且MYCOFLYTIC瓶（BD）血培養(yǎng)瓶。（暫時不做） 8.大便標(biāo)本 大便標(biāo)本涂片的敏感性只有3234

12、，不能根據(jù)涂片的結(jié)果決定是否進(jìn)行培養(yǎng),21,9、病理組織切片（核酸檢測） 在一只干凈的離心管中加入6-12片5-10m厚的FFPE， 勿切白片。 病理組織切片已固定，結(jié)核分枝桿菌已無活性，無法做培養(yǎng),22,DNA擴(kuò)增技術(shù)檢測有哪些不足,相比DNA檢測技術(shù)，RNA檢測更適合判斷病原體轉(zhuǎn)錄活性，DNA檢測技術(shù)不能判斷病原體轉(zhuǎn)錄活性，不能區(qū)分潛伏感染和活動性感染（活動性感染：指示RNA轉(zhuǎn)錄活躍，潛伏感染：指示RNA不轉(zhuǎn)錄） 交叉污染問題 變溫檢測，對儀器要求高 抑制反應(yīng)（Taq酶,23,免疫斑點干擾素釋放試驗,結(jié)核菌感染的免疫應(yīng)答反應(yīng)主要是細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)； T-SPOT.TB定量檢測人外周抗凝全血中受結(jié)核桿菌特異混合多肽抗原（ESAT-6和CFP-10）刺激分泌細(xì)胞因子干擾素的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞數(shù)量。 結(jié)核特異性抗原ESAT-6和CFP-10由結(jié)核桿菌基因組RD1區(qū)相同的操縱子編碼的蛋白； 所以的卡介苗菌株均丟失該基因序列 絕大多數(shù)環(huán)境分枝桿