層析法理論P(yáng)PT課件

1、1,層 析 法（Chromatography,2,層析法,基本原理 層析法的分類(lèi) 幾種常用的層析方法： 吸附層析、分配層析、離子交換層析、凝膠層析、親和層析,3,基 本 概 念,層析法(色譜法、色層分析法、層離法）: 通過(guò)在固定相和流動(dòng)相之間的物理和物理化學(xué)分配而將混合物中的兩種或多種化合物相互分離的方法之總稱,葉綠素,葉綠素,葉黃素，,葉黃素,茨維特色譜圖 （1906,4,基本原理,利用混合物中各組分的理化性質(zhì)（如溶解度、吸附能力、電荷、分子量、分子極性、親和力等）各不相同，使各組分在支持物上移動(dòng)速度不同而集中分布在不同的區(qū)域，借此將各組分分離,5,基本原理,所有的層析系統(tǒng)都由兩個(gè)相組成：一

2、是固定相，它或者是固體物質(zhì)或者是固定于固體物質(zhì)上的成分；另一是流動(dòng)相，即可以流動(dòng)的物質(zhì)，如水和各種溶劑,6,層析的基本過(guò)程,組分A 組分B,流動(dòng)相,固定相,吸附 溶解 結(jié)合等,解除上 述作用,反復(fù)進(jìn)行,移動(dòng)速度不同,7,層析法的分類(lèi),按兩相所處的狀態(tài)分類(lèi),液固 層析法,液液 層析法,液體,氣固 層析法,氣液 層析法,氣體,流 動(dòng) 相,固體,液體,固定相,8,層析法的分類(lèi),按層析原理分類(lèi),各組份在流動(dòng)相和固定相中的分配系數(shù)不同,分配層析法,固定相是固體吸附劑，組份在吸附劑表面吸附，對(duì)各組分吸附能力不同,吸附層析法,分離原理,名稱,9,固定相是多孔凝膠，各組份的分子大小不同，因而在凝膠上受阻滯的程

3、度不同,凝膠層析法,固定相是離子交換劑，各組份與離子交換劑形成的鹽鍵數(shù)目不同,離子交換層析法,分離原理,名稱,續(xù)上表,10,固定相只能與一種待分離組份專(zhuān)一結(jié)合，以此和無(wú)親和力的其它組份分離,親和層析法,分離原理,名稱,續(xù)上表,11,層析法的分類(lèi),按操作形式不同分類(lèi),用濾紙作液體的載體，點(diǎn)樣后用流動(dòng)相展開(kāi)，使各組份分離,紙層析法,固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿著一個(gè)方向前移而達(dá)分離,柱層析法,操作形式,名稱,將適當(dāng)?shù)母叻肿佑袡C(jī)吸附劑制成薄膜，以類(lèi)似紙層析方法進(jìn)行物質(zhì)的分離,薄膜層析法,12,幾種常用的層析方法,吸附層析 分配層析 離子交換層析 凝膠層析 親和層析,13,一、吸附層析（Absorptio

4、n chromatography,吸附層析是利用吸附劑表面對(duì)不同物質(zhì)吸附性能的差異進(jìn)行分離的一種方法，常用于分離易溶于有機(jī)溶劑而難溶于水的混合物。 比較常用的是吸附劑氧化鋁和硅膠。 吸附是可逆的，吸附層析就是吸附與解吸附的矛盾統(tǒng)一過(guò)程,14,吸附劑和洗脫劑的選擇,最大表面積和足夠的吸附能力 對(duì)欲分離的物質(zhì)有不同的吸附能力 與溶劑和樣品不會(huì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng) 顆粒均勻，不會(huì)碎裂,溶劑、洗脫劑：極性大的物質(zhì)用極性大的洗脫劑,15,吸附柱層析 (Absorption column chromatography,吸附柱層析是利用玻璃柱盛吸附劑。樣品溶液加入層析柱，溶質(zhì)即被吸附劑（固定相）吸附。待樣品液全部流

5、入柱內(nèi)的吸附劑后，再加入適當(dāng)?shù)南疵撘海鲃?dòng)相），使被吸附的溶質(zhì)逐步解吸下來(lái)，隨著洗脫液向下流動(dòng)而移動(dòng)，最后被分離,16,柱色譜法 (Column Chromatograph,機(jī)理: 吸附層析 吸附劑: Al2O3, SiO2(硅膠), 聚酰胺等 吸附劑和洗脫劑的選擇: 物質(zhì)極性 吸附活性 洗脫劑極性 強(qiáng) 小 強(qiáng) 弱 大 弱,裝柱,加入樣品,層析后,常用洗脫劑極性次序: 石油醚環(huán)己烷CCl4甲苯CH2Cl2CHCl3乙醚醋酸乙酯正丙醇乙醇甲醇水,17,柱層析示意圖,實(shí)驗(yàn)：胡蘿卜的柱層析分離法,18,薄層吸附層析（Thin layer absorption chromatography,薄層吸附層

6、析是將吸附劑均勻地在玻璃板上鋪成薄層，再把樣品點(diǎn)在薄層板上，點(diǎn)樣的位置靠近板的一端。然后將板的這端浸入適當(dāng)?shù)娜軇鲃?dòng)相）中，使溶劑在薄層板上擴(kuò)散，并在此過(guò)程中通過(guò)吸附解吸再吸附再解吸的反復(fù)進(jìn)行，而將樣品各個(gè)組分分離出來(lái),19,薄層色譜法點(diǎn)樣及展開(kāi)過(guò)程,實(shí)驗(yàn)：氨基酸薄層層析,20,實(shí)驗(yàn)、氨基酸薄層層析,21,二、分配層析（Partition chromatography,分配層析法是根據(jù)物質(zhì)在兩種不相混溶（或部分混溶）的溶劑間溶解度不同，從而有不同的分配來(lái)實(shí)現(xiàn)分離的方法。屬于液液層析,分配系數(shù)（K,22,分配層析,分配層析技術(shù)大多數(shù)是以一種多孔物質(zhì)作為載體，吸著一種極性溶劑，此極性溶劑在層析過(guò)

7、程中始終固定在此載體上而被稱為固定相；另一種與固定相互不相溶的非極性溶劑流過(guò)固定相，稱為流動(dòng)相。分配層析主要用于分離在水和有機(jī)溶劑中都可溶的、極性大的親水性物質(zhì),固定相濾紙上的吸附水 流動(dòng)相溶劑（乙醇、丙醇、丙酮及與水不相溶 的溶劑,23,分離示意圖,Rf 0.02，A、B可分離,與標(biāo)樣比較可定性鑒定,24,如果兩種氨基酸的遷移速率相近，或者氨基酸的Rf值相同，如何來(lái)分離,25,氨基酸的Rf值,展開(kāi)劑 正丁醇+吡啶+水 0.20 0.29 0.60 0.20 0.33 0.24 1 : 1 : 1 正丁醇+醋酸+水 0.23 0.23 0.70 0.28 0.22 0.11 12 : 3 :

8、5,26,例：氨基酸混合液點(diǎn)在1515cm濾紙邊2cm處，風(fēng)干，展開(kāi)劑用CH3OH-H2O-吡啶（20:5:1），當(dāng)溶劑移動(dòng)至14cm處，取出風(fēng)干。（第一次展開(kāi),將濾紙折成筒狀，使斑點(diǎn)處于下方，再用叔丁醇-甲基乙基酮-H2O-二乙胺(10:10:5:1) 展開(kāi)至14cm，取出風(fēng)干。(第二次展開(kāi)) 顯色：茚三酮-4-乙-2-甲氮苯-冰HAc,第二次展開(kāi),實(shí)驗(yàn)：氨基酸雙向紙色譜法,第一次展開(kāi),27,氨基酸雙向紙層析色譜,PC檢測(cè)方法； 顏色, 顯色(反應(yīng)顯色, I2蒸氣, 紫外燈照) 剪下斑點(diǎn)，用適當(dāng)?shù)娜軇┫疵摵鬁y(cè)定(比色,熒光,28,溶液中的離子與離子交換樹(shù)脂發(fā)生離子交換而分離,三、離子交換層析

9、（Ion-exchange chromatography,29,柱層析,離子交換層析法 將交換上去的離子， 用適當(dāng)?shù)南疵搫┮来蜗疵摱蛛x,30,離子交換層析用于分離氨基酸、核苷、核苷酸等小分子物質(zhì)比較理想. 去離子水的制備？ 水的凈化:陽(yáng)離子柱陰離子柱混合柱,離子交換分離法的應(yīng)用,31,離子交換分離操作技術(shù),樹(shù)脂的選擇和處理 裝柱 交換 洗脫 樹(shù)脂再生,32,離子交換層析,離子交換劑的優(yōu)點(diǎn)： （1）不溶性的高分子聚合物，具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有較好的化學(xué)穩(wěn)定性。 （2）交換劑本身吸附能力弱，引入的可以發(fā)生電離的活性基團(tuán)。 （3）多孔性，表面積大，交換容量大，回收率高，可用于分離和制備,33,陽(yáng)離子

10、交換分離（0.1molL-1 HCl為淋洗液,親和力大的先被交換上去, 后被洗脫下來(lái),34,樹(shù)脂類(lèi)型,陽(yáng)離子交換樹(shù)脂: 含酸性活性基團(tuán)的樹(shù)脂。 強(qiáng)酸型：RSO3H pH 0-14 不受酸度限制,弱酸型：RCOOH pH4 ROH pH9.5 選擇性好, 可分離各種有機(jī)堿及氨基酸,35,強(qiáng)堿型：R N(CH3)3Cl pH 0-14 弱堿型：R NH2 ， RNHCH3 pH 0-7 RN(CH3)2 pH 9.5,螯合樹(shù)脂：含有特殊的螯合活性基團(tuán),陰離子交換樹(shù)脂: 含堿性活性基團(tuán)的樹(shù)脂,36,樹(shù)脂對(duì)離子的親和力順序,強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂 對(duì)一價(jià)陽(yáng)離子 Li+ H+ Na+ NH4+ K+ Rb

11、+ Cs+ Ag+ Tl+ 對(duì)二價(jià)陽(yáng)離子 Mg2+ Ca2+ Sr2+ Ba2+ Fe2+ Co2+ Ni2 +Cu2+ Zn2+ 水合離子半徑越小親和力越大,強(qiáng)堿型陰離子交換樹(shù)脂 F- OH- Ac- HCOO- H2PO4- Cl- NO3- HSO4- CrO42- SO42,對(duì)不同價(jià)態(tài)離子 Na+ Ca2+ Fe3+ Th4+ 電荷數(shù)越高親和力越大,37,四、凝膠層析（Gel chromatography,凝膠層析是指混合物隨流動(dòng)相流經(jīng)裝有凝膠作為固定相的層析柱時(shí)，混合物中各物質(zhì)因分子大小不同而被分離的技術(shù)。 主要用于大分子物質(zhì)的分離,38,凝膠的種類(lèi)和性質(zhì),交聯(lián)葡聚糖凝膠 (Seph

12、adex) 瓊脂糖凝膠 (Sepharose) 聚丙烯酰胺凝膠 (Bio-Gel P,39,分子篩效應(yīng),凝膠層析示意圖,40,凝膠層析,分子篩效應(yīng) 全排阻：分子直徑比凝膠最大孔隙直徑大，全部被排阻在凝膠顆粒之外 另外，直徑比凝膠最小孔隙直徑小的分子能進(jìn)入凝膠的全部孔隙,41,凝膠層析的應(yīng)用,1、分離提純蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子(脫鹽) 2、酶、蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、激素、生物堿等物質(zhì)的分離精制 3、測(cè)定高分子物質(zhì)的分子量 4、高分子溶液的濃縮,42,層析柱的重要參數(shù),柱體積Vt：凝膠裝柱后，從柱的底板到凝膠沉積表面的體積。 Vt = 1/4 d2h 外水體積V0：層析柱內(nèi)凝膠顆粒間隙的總?cè)莘e,

13、43,層析柱的重要參數(shù),內(nèi)水體積Vi：凝膠顆粒內(nèi)部微孔的總?cè)莘e。 Vi = W（凝膠干重）Wr（吸水值） 凝膠顆?；|(zhì)所占的容積Vr 峰洗脫體積Ve：被分離物質(zhì)通過(guò)凝膠柱所需洗脫液的體積,44,層析柱的重要參數(shù),分配系數(shù)Kd,45,凝膠層析的實(shí)驗(yàn)技術(shù),層析柱 (r、h） 凝膠的選擇 凝膠的準(zhǔn)備 樣品溶液的處理 防止微生物污染,46,五、親和層析（Affinity chromatography,親和層析是利用待分離物質(zhì)和它的特異性配體間具有特異的親和力，從而達(dá)到分離目的的一類(lèi)特殊層析技術(shù),47,48,親和層析,具有專(zhuān)一親和力的生物分子對(duì)主要有：抗原與抗體、DNA與互補(bǔ)DNA或RNA、酶與它的底物

14、或競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑、激素（或藥物）與它們的受體、維生素和它的特異結(jié)合蛋白、糖蛋白與它相應(yīng)的植物凝集素等,49,舉例：mRNA的分離,原理： 以總RNA為起始材料，利用核酸的堿基配對(duì)原理，通過(guò)寡聚（dT）纖維素或者寡聚（U）瓊脂糖親合層析從大量的RNA中分離mRNA,方法： （1）oligo(dT)-纖維素層 析柱法 （2） oligo(dT)-纖維素液 相結(jié)合離心法 （3）磁珠分離法,50,oligo(dT)-纖維素層析柱法,51,磁珠分離法,52,配體與載體結(jié)合 （固相化,裝柱 （親和層析柱,親和吸附,生物高分子與配體專(zhuān)一結(jié)合,解吸附,洗柱,親和層析 的基本過(guò)程,53,配體與載體的聯(lián)接方法,吸附法：配體吸附于固相載體或離子交換劑上 共價(jià)偶聯(lián)法：配體通過(guò)化學(xué)共價(jià)鍵聯(lián)結(jié)于固相載體 交聯(lián)法：依靠雙功能試劑造成分子之間交聯(lián)，聚集成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 包埋法：配體被包裹于凝膠格子或聚合物的半透膜微膠囊中,54,親和層析的應(yīng)用,親和層析純化過(guò)程簡(jiǎn)單、迅速，且分離效率高。對(duì)分離含量極少又不穩(wěn)定的活性