天然藥物4分離純化法

1、天然藥物化學,二）分離純化法 分離：是將混合物按極性大小、酸堿性程度或其它性質(zhì)而分成若干部位或含有相同結(jié)構(gòu)類型的若干類成分的操作，通過幾次分離操作可以得到較純的化合物。 精制：是分離單一化合物的最后一部操作，就是把留存在單一化合物中的少量雜質(zhì)分離的過程,二）分離純化法,1、系統(tǒng)溶劑分離法 一般是將上述總提取物，選用三、四種不同極性的溶劑，由低極性到高極性分步進行提取分離,水浸膏或乙醇浸膏常常為膠狀物，難以均勻分散在低極性溶劑中，故不能提取完全，可拌入適量惰性填充劑，如硅藻土或纖維粉等，然后低溫或自然干燥，粉碎后，再以選用溶劑依次提取（如用索氏提取器依次提或上硅膠柱依次洗脫），使總提取物中各組成

2、成分，依其在不同極性溶劑中溶解度的差異而得到分離,二）、分離純化法,1、系統(tǒng)溶劑分離法,例如：某藥材的70% 乙醇的提取物浸膏 拌硅燥土后的干粉裝于濾紙桶中 石油醚提取 或 乙醚提取 （氯仿提取 或）乙酸乙酯提取 正丁醇提取 甲醇或乙醇提取 水煮提,二）、分離純化法,2、兩相溶劑萃取法,1）簡單萃取法,是利用混合物中各成分在兩種互不相溶的溶劑中分配系數(shù)的不同而達到分離的方法。 萃取時如果各成分在兩相溶劑中分配系數(shù)相差越大，則分離效率越高。 K=(k1-k2) K=C1/C2 萃取中一定要注意防止乳化產(chǎn)生,二）、分離純化法,2）連續(xù)萃取法,是一種連續(xù)的兩相溶劑萃取法,二）、分離純化法,2）連續(xù)萃

3、取法,二）、分離純化法,3）逆流分配法,逆流分配法又稱逆流分溶法、逆流分布法或反流分布法。逆流分配法與兩相溶劑逆流萃取法原理一致，但加樣量一定，并不斷在一定容量的兩相溶劑中，經(jīng)多次移位萃取分配而達到混合物的分離,二）、分離純化法,3）逆流分配法,二）、分離純化法,4）液滴逆流分配法(DCCC,液滴逆流分配法又稱液滴逆流層析法,對溶劑系統(tǒng)的選擇基本同逆流分配法，但要求能在短時間內(nèi)分離成兩相，并可生成有效的液滴。由于移動相形成液滴，在細的分配萃取管中與固定相有效地接觸、摩擦不斷形成新的表面，促進溶質(zhì)在兩相溶劑中的分配，故其分離效果往往比逆流分配法好。且不會產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，用氮氣壓驅(qū)動移動相，被分離物

4、質(zhì)不會因遇大氣中氧氣而氧化,二）、分離純化法,4）液滴逆流分配法,N2氣驅(qū)動,二）、分離純化法,沉淀法是向提取液中加入某些試劑，使欲分離的成分沉淀或使雜質(zhì)沉淀的方法,3、沉淀法,二）、分離純化法,3、沉淀法,1）鉛鹽沉淀法： 鉛鹽沉淀法為分離某些中草藥成分的經(jīng)典方法之一。 中性醋酸鉛和堿式醋酸鉛為沉淀試劑。 由于中性醋酸鉛及堿式醋酸鉛在水及醇溶液中，能與多種中草藥成分生成難溶的鉛鹽或絡鹽沉淀，故可利用這種性質(zhì)使有效成分與雜質(zhì)分離,中性醋酸鉛Pb(Ac)2可沉淀的成分 a. 含羧基-COOH的酸性成分：如有機酸、蛋白質(zhì)、氨基酸、酸性多糖、酸性樹脂、酸性皂苷等。 b.具有鄰二酚羥基的酚酸性成分，如

5、部分黃酮、蒽醌及鞣質(zhì)等。 堿式醋酸鉛Pb(OH)Ac可沉淀的成分 a.上述成分 b.一元酚類、中性多糖、某些中性皂苷、某些異黃酮及其苷、某些生物堿、某些低聚糖和單糖等,1）鉛鹽沉淀法,通常將中草藥的水或醇提取液先加入中性醋酸鉛濃溶液，靜置后濾出沉淀，并將沉淀洗液并入濾液，于濾液中加堿式醋酸鉛飽和溶液至不發(fā)生沉淀為止，這樣就可得到中性醋酸鉛沉淀物、堿式醋酸鉛沉淀物及母液三部分,1）鉛鹽沉淀法,注意：對鉛鹽沉淀物要進行脫鉛處理。 （2）酸堿沉淀法(堿溶酸沉淀法或酸溶堿沉淀法） 利用酸性成分及內(nèi)酯成分能溶于堿水，加酸沉淀析出；或利用堿性成分能溶于酸水，加堿沉淀析出的方法。 如生物堿加堿游離溶于有機溶

6、劑，在水中則沉淀；加酸成鹽溶于水,3） 乙醇沉淀法 在濃縮的水提液中，加乙醇使醇含量達80% 以上，則難溶于高濃度醇的成分沉淀（如淀粉、菊糖等多糖和蛋白質(zhì)） 。 （4）專一試劑沉淀法 利用某類成分能和特定試劑產(chǎn)生沉淀而和其他成分分離的方法。 如：生物堿 H+ 生物堿鹽 生物堿沉淀試劑 沉淀 恢復生物堿原型,二）、分離純化法,鹽析法是在中草藥的水提液中加入無機鹽（常用NaCl、Na2SO4等）達到一定濃度或達到飽和狀態(tài)，使水溶性較小的成分沉淀析出，而與水溶性較大的成分相分離的方法,4、鹽析法,二）、分離純化法,5、結(jié)晶（重結(jié)晶、分步結(jié)晶,利用固體混合物對某種溶劑的溶解度差別，而使單一成分以結(jié)晶狀

7、態(tài)析出的方法,二）、分離純化法,6、透析法,透析法是利用小分子及小離子物質(zhì)在溶液中可以通過半透膜，而大分子及大離子不能通過半透膜的性質(zhì)，從而達到相互分離的方法。 例如分離純化皂苷、蛋白質(zhì)、多肽、多糖等大分子成分時，可用透析法除去小分子如無機鹽、單糖、雙糖等雜質(zhì),二）、分離純化法,7、分餾法,對于完全能夠互溶的液體混合物的分離可采用分餾法。 分餾法是利用液體混合物中，各單一成分的沸點（bp.）的不同而達到分離目的的方法,二）、分離純化法,8、超速離心法,是利用各化合物分子大小的不同在超速離心條件下有不同的沉降速度得以分離的方法,二）、分離純化法,9、超濾法,膜分離技術按被分離物質(zhì)相對分子量的大小

8、分為微濾(0.1)、超濾(10100)、納濾(110)和反滲透(1)。 中藥領域主要應用微濾和超濾兩種方法,二）、分離純化法,微濾處理中藥水溶液，可除去大量亞微粒、微粒及絮狀沉淀，為超濾提供可靠的預處理。 超濾可除去藥液中的淀粉、樹膠、果膠、粘液質(zhì)、蛋白質(zhì)等可溶性大分子雜質(zhì)和微生物及部分熱原,9、超濾法,二）、分離純化法,超濾法原理近似機械篩，當溶液體系經(jīng)由水泵進入超濾器時，在濾器內(nèi)的超濾膜表面發(fā)生分離，溶劑(水)和其它小分子量溶質(zhì)透過具有不對稱微孔結(jié)構(gòu)的濾膜，大分子溶質(zhì)和微粒(如蛋白質(zhì)、病毒、細菌、膠體等)被濾膜阻留，從而達到分離、提純和濃縮產(chǎn)品的目的,9、超濾法,超濾與普通過濾的區(qū)別,二)

9、、分離純化法,名稱 孔徑 孔結(jié)構(gòu) 分離對象 反復使用 普通過濾 微米級 直孔 固-液 不能 超濾 20-500A 不對稱孔 液-液 能,二)、分離純化法,超濾技術的主要特點是: 結(jié)構(gòu)緊湊； 操作方便； 能耗低； 有效膜面積大； 分離效率高； 可在常溫下進行操作； 對分離熱敏性、保味性的藥物更為適用,超濾法較傳統(tǒng)方法的優(yōu)勢,二)、分離純化法,超濾法的其它優(yōu)勢,1)減少工序，縮短生產(chǎn)周期，不耗用有機溶媒，有利于工廠的安全生產(chǎn)，并減少環(huán)境污染。 (2)較醇沉法能更有效地保持原配方的成分，且提高了有效成分的含量。 (3)去雜質(zhì)效果好，明顯提高了注射液和口服液的澄明度及儲存穩(wěn)定性。 (4)除熱原效果好，

10、可達到藥典要求。 (5)除菌效果好，避免了有些藥液因加熱滅菌而產(chǎn)生絮狀沉淀,二)、分離純化法,10、色譜分離法（層析法,色譜法是利用不同的物質(zhì)在固定相和流動相中不同的平衡分配系數(shù)來進行分離的一種方法,二)、分離純化法,色譜法按兩相的狀態(tài)分為： 液相色譜（流動相為液體）和 氣相色譜（流動相為氣體）。 液相色譜又分為 液-固色譜和 液-液色譜； 氣相色譜又分為 氣-固色譜和 氣-液色譜,色譜法的分類,二)、分離純化法,色譜法按機理分類（色譜的主要分類方法,色譜柱名稱 層析的原理 吸附色譜 物理吸附 （范德華力作用） 分配色譜 分配原理（分配系數(shù)） 離子交換色譜 離子交換 凝膠色譜 分子篩作用 聚酰

11、胺色譜 半化學吸附（氫鍵作用） 大孔吸附樹脂 物理吸附、氫鍵吸附和分子篩作用 氣相色譜 吸附和分配原理 高效液相色譜 吸附和分配原理,液相色譜發(fā)展史,1906 - Mikhail Semenovich Tswett (1872-1919,碳酸鈣吸附劑,石油醚洗脫劑,1940s - 分配色譜和紙色譜,1950s - 氣相、 薄層、凝膠過濾色譜,梯度洗脫色譜,1960s - 商業(yè)高效液相色譜,二)、分離純化法,1） 吸附層析法,吸附層析法的原理：利用混合物中各組分對固體吸附劑（固定相）吸附能力的不同而達到分離的層析方法。 吸附劑：常用的吸附劑有硅膠、氧化鋁、活性炭、硅酸鎂、氧化鎂等。 物理吸附：無

12、選擇性，吸附與解吸可逆,吸附層析是由： 吸附劑、 洗脫劑、 被分離的樣品三部分構(gòu)成的,二)、分離純化法,吸附劑 極性吸附劑（ 如硅膠、氧化鋁) 極性強，吸附力大(洗脫時洗脫力隨洗脫劑的極性增強而增大)。 非極性吸附劑 (如活性炭-對非極性化合物的吸附力強(洗脫時洗脫力隨洗脫劑的極性降低而增大,1） 吸附層析法,二)、分離純化法,1） 吸附層析法,氧化鋁（Al2O3 ）適合分離脂溶性成分（如：生物堿 、甾體和揮發(fā)油 ）。 硅膠(SiO2 XH2O)適合分離水溶性和脂溶性成分。 活性炭適合水溶性成分的分離，如氨基酸、糖和苷的分離,硅膠和氧化鋁的吸附能力與含水量有關。一般用前要活化。 含水量低、活性

13、高，吸附力強。 含水量高、活性低、吸附力弱。 氧化鋁活化要在馬弗爐中400、6小時，得級氧化鋁。 硅膠活化要在100110 、0.51小時,二)、分離純化法,吸附力大小是依據(jù)“相似者相溶” 的原理；根據(jù)化合物吸附力大小的不同達到分離（與化合物的極性相關。,被分離的樣品: 化合物的吸附力,二)、分離純化法,洗脫劑: 用單一溶劑或混合溶劑。 一般是由低極性溶劑到高極性溶劑,二)、分離純化法,吸附層析的操作,操作方式：吸附柱層析： 干法裝柱 濕法裝柱 吸附薄層層析,a.裝柱 樣品：吸附劑 Al2O3 為 1 : 20 50 （極性小的可 1 : 100）， 樣品：吸附劑 SiO2 為 1 : 30

14、100 （極性相近的可 1: 300 400） 層析柱規(guī)格 1 : 10 30（直徑 : 高度） 原則 ： 均勻、致密，無氣泡、無縫隙。 ( 1 ) 干法裝柱 ： 底部塞脫脂棉，敲擊，頓擊。與TLC吻合度較好，溶劑消耗少，需加壓洗脫。 ( 2 ) 濕法裝柱 ： 倒入溶劑后，加吸附劑； 吸附劑與溶劑 攪拌后，倒入柱中。均勻，前沿整齊,干法裝柱,濕法裝柱,柱分離,吸附柱層析 b.上樣 1) 干法 干法上樣 2) 濕法 溶劑溶解上樣（少量,二)、分離純化法,吸附柱層析,c. 洗脫 分常壓、低壓（減壓）、加壓 d.收集與檢查 收集分等份收集或按色帶收集 TLC檢查,二)、分離純化法,2）分配層析法,其

15、原理是依據(jù)液-液萃取的原理。 利用混合物中各成分在互不相溶的兩相溶劑中分配系數(shù)的不同而達到分離。其組成上比吸附層析多一個支持劑，使固定相吸著在支持劑上,分配層析是將互相飽和的一相溶液吸著于某種惰性固體粉末或濾紙上，這一相成為固定相，這種吸著了固定相的物質(zhì)稱為支持劑（或載體或擔體）。被分離的物質(zhì)置于固定相上（包括載體），以另一相即移動相洗脫或展開，樣品中的物質(zhì)就在固定相與移動相之間分配而達到分離,2）分配層析法,分配層析是由載體、固定相、移動相和被分離的物質(zhì)四部分組成的。 A. 支持劑（載體） 常見的有：硅膠（含水量達17%以上時作支持劑）、硅藻土、纖維素粉、濾紙（纖維,B. 固定相和移動相 分

16、配層析又分為： 正相分配層析（固定相的極性大于移動相的極性） 反相分配層析（固定相的極性小于移動相的極性） C. 被分離的物質(zhì) 依相似者相溶的原理達到分離,分配層析的操作分三種形式： 紙層析 分配薄層層析 分配柱層析,主要講一下紙層析（Paper Chromatography） 紙層析是以濾紙作為支持劑的一種分配層析法。 水飽和的濾紙含水量為20%35%。干燥的濾紙總是吸著其自身重量約6%7%的水分，這部分水是以氫鍵的形式與濾紙纖維素上的羥基結(jié)合，而在一般情況下較難以脫去的,紙層析的分離對象 紙層析特別適合于水溶性成分如氨基酸、糖、苷類、有機酸等的分離和鑒定,紙層析的操作： 1. 樣品液的配制 2.點樣（毛細管點樣、距底邊1.52cm作為原點或起始點，斑點直徑不超過23mm,點樣量要適量，視樣液濃度而定，不能過多或過少) 3.展開：濾紙條懸掛于密閉的缸底部盛放展開劑的層析缸內(nèi)（注意：展開后一定要標記前沿,4.斑點的定位方法 化合物本身有色，直接觀察。 化合物本身無色但有熒光，看熒光。