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1、人肺上皮細(xì)胞蛋白酶激活論文【摘要目的摘要:蛋白酶激活受體(proteaseactivatedreceptors,PARs)廣泛分布在多種組織細(xì)胞上,但4種PARs在肺上皮細(xì)胞的表達(dá)情況尚不清楚.我們用A549細(xì)胞探究PARs在肺上皮細(xì)胞的表達(dá).方法摘要:采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)、流式細(xì)胞儀和免疫熒光細(xì)胞染色分析技術(shù)分析肺上皮細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞PARs的表達(dá)情況.結(jié)果摘要:4種PARs在肺上皮細(xì)胞上均有不同程度的表達(dá).結(jié)論摘要:肺上皮細(xì)胞同時(shí)表達(dá)PAR144種受體,這為進(jìn)一步探究PARs在肺上皮細(xì)胞的功能奠定了基礎(chǔ). 【蛋白酶激活受體;肺上皮細(xì)胞;RTPCR;流式細(xì)胞術(shù);免疫熒光細(xì)胞

2、染色 0引言 蛋白酶激活受體(proteaseactivatedreceptors,PARs)屬G蛋白耦聯(lián)受體家族,目前共發(fā)現(xiàn)4個(gè)成員摘要:PAR1,PAR2,PAR3,PAR4.蛋白酶可以酶切PAR的N末端,暴露含有系鎖配體的新的N末端,可自我激活PAR功能1.探究顯示,PARs分布在多種組織細(xì)胞上,包括血小板、白細(xì)胞、肥大細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、消化道上皮細(xì)胞等.PAR被激活后,可介導(dǎo)跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)從而參和凝血、炎癥、變態(tài)反應(yīng)等生理和病理過(guò)程的發(fā)生2.許多組織上皮表達(dá)的PARs可能在不同的病理過(guò)程中起功能,雖然一些組織的PARs的分布已有探究,但4種PARs在肺上皮的表達(dá)

3、情況和功能還不是十分清楚.因此,我們利用培養(yǎng)的人肺癌上皮細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞探索四種PARs在肺上皮細(xì)胞上的表達(dá)特征. 1材料和方法 1.1材料 人肺癌上皮細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞探究所,青、鏈霉素、非酶性細(xì)胞分離液購(gòu)于Sigma公司,DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco公司,TRIZOLReagent購(gòu)自Invitrogen公司,TAKARALARTPCRkit,購(gòu)自TAKARA公司,SYBRGreenI核酸凝膠染料購(gòu)自BMA公司,PCRMarkers購(gòu)自Biolabs公司.PE標(biāo)記的小鼠抗人PAR1和PAR2mAb,兔抗人PAR3和兔抗人PAR4多克隆抗體及相應(yīng)的

4、同型對(duì)照均購(gòu)自SantaCruz公司.FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗購(gòu)自BDPharmingen公司.PCR儀PTC200購(gòu)自MJResearch公司,激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)購(gòu)自日本Nikon公司,F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自BectonDickinson公司. 1.2方法 1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)人肺癌上皮細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞接種于50mL培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),用DMEM完全培養(yǎng)液(含100g/LFBS,1105u/L青霉素和100mg/L鏈霉素),于37,50mL/LCO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng). 1.2.2RTPCR收集培養(yǎng)的A549細(xì)胞,用TRIZOLReagent提取細(xì)胞總RNA,具體操作步驟按試劑說(shuō)明

5、進(jìn)行.RNA經(jīng)10g/L瓊脂糖電泳后,按TAKARARTPCRkit說(shuō)明進(jìn)行cDNA合成.逆轉(zhuǎn)錄的條件為摘要:oligod(T),4230min,995min,55min.PAR1,PAR2,PAR3,PAR4和actin的特異性引物均由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成.actin(F)5AGGGGCCGGACTCGTCATACT3,(R)5GGCGGCAACACCATGTACCCT3,PAR1(F)5CAGCTCCTGGCTGACACTCTTTGTC3,(R)5CGAGCAGGGTTTCATTGAGCACAT3,PAR2(F)5GCAGCCTCTCTCTCCTGCAGTGG3,(R)5CTGAG

6、GCAGGTCATGAAGAGAATGG3,PAR3(F)5GGCTGGACAGGAGCCACGAT3,(R)5AGCGGTTGATGCTGATGCAGG3,PAR4(F)5GGATCGCCTACCACCTGCGTG3,(R)5CCCGTAGCACAGCAGCATGG3.actin的PCR擴(kuò)增條件為摘要:942min,9430s,5530s,7230s,35個(gè)循環(huán),7210min.PAR1,PAR2,PAR3和PAR4的PCR擴(kuò)增條件為摘要:942min,9430s,6730s,721min,35個(gè)循環(huán),7210min.PAR1,PAR2,PAR3和PAR4擴(kuò)增的目的片段分別為500,461,

7、403和401bp;actin的擴(kuò)增片段為202bp.PCR擴(kuò)增片段經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證. 1.2.3流式細(xì)胞術(shù)分析待培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%80%時(shí),用非酶性細(xì)胞分離液懸浮細(xì)胞,10g/LBSA/PBS洗2次,調(diào)整細(xì)胞密度為510911010/mL,40g/L多聚甲醛室溫固定10min,按說(shuō)明書(shū)分別加入120PE標(biāo)記的抗PAR1、抗PAR2小鼠抗人mAb、120抗PAR3、抗PAR4兔多克隆抗體及相應(yīng)的同型對(duì)照抗體,4避光孵育30min,10g/LBSA/PBS洗2次;PAR3,PAR4管再加入FITC標(biāo)記的羊抗兔Ig二抗,4避光孵育30min,10g/LBSA/PBS洗2次,最后各管均加入500L1PB

8、S懸浮細(xì)胞,使用流式細(xì)胞儀CELLQUEST軟件檢測(cè)和分析上皮細(xì)胞PAR的表達(dá)情況. 1.2.4免疫熒光細(xì)胞染色將A549細(xì)胞接種于8孔顯微鏡玻片培養(yǎng)過(guò)夜,用10g/LBSA/PBS漂洗后加入甲醇固定20min,然后用10g/LBSA/PBS孵育5min,加入120的PE標(biāo)記的抗PAR1、抗PAR2小鼠抗人mAb、抗PAR3、抗PAR4兔多克隆抗體及相應(yīng)的同型對(duì)照抗體,室溫避光孵育1h,10g/LBSA/PBS洗3次,PAR3,PAR4管再加入FITC標(biāo)記的羊抗兔Ig二抗,室溫避光孵育1h,10g/LBSA/PBS洗3次,最后用甘油封片,共聚焦顯微鏡下觀察. 2結(jié)果 2.1肺上皮細(xì)胞PARsm

9、RNA的表達(dá)肺上皮細(xì)胞表達(dá)PAR1,PAR2,PAR3和PAR4的mRNA,擴(kuò)增PAR1,PAR2,PAR3和PAR4mRNA的長(zhǎng)度分別為500,461,403和401bp(Fig1). 2.2肺上皮細(xì)胞PARs蛋白質(zhì)的表達(dá)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)肺上皮細(xì)胞表達(dá)PAR1,PAR2,PAR3和PAR4,其中PAR4的表達(dá)為最強(qiáng),PAR1和PAR3的表達(dá)水平較相似,PAR2的表達(dá)水平最弱.免疫熒光細(xì)胞染色分析進(jìn)一步證實(shí)上述PARs在肺上皮細(xì)胞上的表達(dá)(Fig2). Fig2ImmunofluorescencestainingofPARsonlungepithelialcells 圖2免疫熒光細(xì)胞染色分析

10、檢測(cè)肺上皮細(xì)胞PAR的表達(dá) 3討論 PARs家族共有PAR1,PAR2,PAR3和PAR44個(gè)成員,凝血酶可激活PAR1、PAR3和PAR4,而PAR2可被胰蛋白酶、肥大細(xì)胞類胰蛋白酶和活化的凝血因子所激活3-5.另外,這些受體還可被相應(yīng)的PARs激動(dòng)肽所激活.其中PAR1是凝血酶的高親和力受體,而PAR4只能被高濃度凝血酶激活.探究顯示,凝血酶通過(guò)PAR1和PAR4途徑協(xié)同互補(bǔ)介導(dǎo)血小板的活化,而PAR3作為PAR4的輔助因子,在血小板活化中也起著一定功能6,除參和凝血外,多種細(xì)胞類型PARs的廣泛激活還可參和血管損傷反應(yīng)7,8.PAR2的激活可參和細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)的釋放,增加微血管的滲出

11、以及中性粒細(xì)胞的趨化,血管擴(kuò)張,血管收縮,細(xì)胞增殖等炎癥的病理過(guò)程.此外,在不同的生理和病理?xiàng)l件下,體內(nèi)不同的內(nèi)源性蛋白酶的存在,可能會(huì)激活同一細(xì)胞上的PAR2. 我們利用RTPCR、流式細(xì)胞儀和免疫熒光細(xì)胞染色分析技術(shù)檢測(cè)到了4種PARs在肺上皮細(xì)胞上的表達(dá).肺上皮細(xì)胞作為首先接觸吸入性抗原的組織細(xì)胞之一,在變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)病機(jī)制中起重要功能,它能夠合成和釋放許多前炎癥細(xì)胞因子和趨化性細(xì)胞因子,包括IL1,IL6,IL8,GMCSF,MIP,RANTES和eotaxin等3,9,還可以合成抗炎因子如PGE2和NO10.通過(guò)這些因子的功能來(lái)募集、激活炎癥性細(xì)胞從而調(diào)節(jié)機(jī)體的炎癥過(guò)程,尤其是P

12、AR2的激活可多方面參和肺部炎癥的發(fā)生和發(fā)展.我們也曾經(jīng)用胰蛋白酶和PAR2激動(dòng)肽激活肺上皮細(xì)胞,誘導(dǎo)其產(chǎn)生了趨化性細(xì)胞因子MCP111,但其釋放的機(jī)制及肺上皮細(xì)胞表達(dá)PARs的生理和病理生理意義還有待進(jìn)一步的探索. 【參考文獻(xiàn) 1DeryO,CorveraCU,SteinhoffM,etal.Proteinaseactivatedreceptors摘要:NovelmechanismsofsignalingbyserineproteasesJ.AmJPhysiol,1998;274(6Pt1)摘要:C1429-C1452. 2OssovskayaVS,BunnettNW.Proteaseact

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