人肺上皮細(xì)胞蛋白酶激活論文

1、人肺上皮細(xì)胞蛋白酶激活論文【摘要目的摘要:蛋白酶激活受體（proteaseactivatedreceptors,PARs）廣泛分布在多種組織細(xì)胞上，但4種PARs在肺上皮細(xì)胞的表達(dá)情況尚不清楚.我們用A549細(xì)胞探究PARs在肺上皮細(xì)胞的表達(dá).方法摘要:采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）、流式細(xì)胞儀和免疫熒光細(xì)胞染色分析技術(shù)分析肺上皮細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞PARs的表達(dá)情況.結(jié)果摘要:4種PARs在肺上皮細(xì)胞上均有不同程度的表達(dá).結(jié)論摘要:肺上皮細(xì)胞同時(shí)表達(dá)PAR144種受體，這為進(jìn)一步探究PARs在肺上皮細(xì)胞的功能奠定了基礎(chǔ). 【蛋白酶激活受體；肺上皮細(xì)胞；RTPCR；流式細(xì)胞術(shù)；免疫熒光細(xì)胞

2、染色 0引言 蛋白酶激活受體（proteaseactivatedreceptors,PARs）屬G蛋白耦聯(lián)受體家族，目前共發(fā)現(xiàn)4個(gè)成員摘要：PAR1，PAR2，PAR3，PAR4.蛋白酶可以酶切PAR的N末端，暴露含有系鎖配體的新的N末端，可自我激活PAR功能1.探究顯示，PARs分布在多種組織細(xì)胞上，包括血小板、白細(xì)胞、肥大細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、消化道上皮細(xì)胞等.PAR被激活后，可介導(dǎo)跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)從而參和凝血、炎癥、變態(tài)反應(yīng)等生理和病理過(guò)程的發(fā)生2.許多組織上皮表達(dá)的PARs可能在不同的病理過(guò)程中起功能，雖然一些組織的PARs的分布已有探究，但4種PARs在肺上皮的表達(dá)

3、情況和功能還不是十分清楚.因此，我們利用培養(yǎng)的人肺癌上皮細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞探索四種PARs在肺上皮細(xì)胞上的表達(dá)特征. 1材料和方法 1.1材料 人肺癌上皮細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞探究所,青、鏈霉素、非酶性細(xì)胞分離液購(gòu)于Sigma公司，DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）購(gòu)自Gibco公司，TRIZOLReagent購(gòu)自Invitrogen公司,TAKARALARTPCRkit,購(gòu)自TAKARA公司，SYBRGreenI核酸凝膠染料購(gòu)自BMA公司,PCRMarkers購(gòu)自Biolabs公司.PE標(biāo)記的小鼠抗人PAR1和PAR2mAb,兔抗人PAR3和兔抗人PAR4多克隆抗體及相應(yīng)的

4、同型對(duì)照均購(gòu)自SantaCruz公司.FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗購(gòu)自BDPharmingen公司.PCR儀PTC200購(gòu)自MJResearch公司，激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)購(gòu)自日本Nikon公司，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自BectonDickinson公司. 1.2方法 1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)人肺癌上皮細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞接種于50mL培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，用DMEM完全培養(yǎng)液（含100g/LFBS，1105u/L青霉素和100mg/L鏈霉素），于37,50mL/LCO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng). 1.2.2RTPCR收集培養(yǎng)的A549細(xì)胞，用TRIZOLReagent提取細(xì)胞總RNA，具體操作步驟按試劑說(shuō)明

5、進(jìn)行.RNA經(jīng)10g/L瓊脂糖電泳后，按TAKARARTPCRkit說(shuō)明進(jìn)行cDNA合成.逆轉(zhuǎn)錄的條件為摘要：oligod(T),4230min，995min,55min.PAR1，PAR2，PAR3，PAR4和actin的特異性引物均由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成.actin（F）5AGGGGCCGGACTCGTCATACT3,（R）5GGCGGCAACACCATGTACCCT3，PAR1（F）5CAGCTCCTGGCTGACACTCTTTGTC3，（R）5CGAGCAGGGTTTCATTGAGCACAT3,PAR2（F）5GCAGCCTCTCTCTCCTGCAGTGG3，（R）5CTGAG

6、GCAGGTCATGAAGAGAATGG3，PAR3（F）5GGCTGGACAGGAGCCACGAT3，（R）5AGCGGTTGATGCTGATGCAGG3,PAR4（F）5GGATCGCCTACCACCTGCGTG3，（R）5CCCGTAGCACAGCAGCATGG3.actin的PCR擴(kuò)增條件為摘要：942min,9430s,5530s,7230s,35個(gè)循環(huán),7210min.PAR1,PAR2,PAR3和PAR4的PCR擴(kuò)增條件為摘要：942min,9430s,6730s,721min,35個(gè)循環(huán),7210min.PAR1,PAR2,PAR3和PAR4擴(kuò)增的目的片段分別為500,461,

7、403和401bp；actin的擴(kuò)增片段為202bp.PCR擴(kuò)增片段經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證. 1.2.3流式細(xì)胞術(shù)分析待培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%80%時(shí)，用非酶性細(xì)胞分離液懸浮細(xì)胞，10g/LBSA/PBS洗2次，調(diào)整細(xì)胞密度為510911010/mL，40g/L多聚甲醛室溫固定10min,按說(shuō)明書(shū)分別加入120PE標(biāo)記的抗PAR1、抗PAR2小鼠抗人mAb、120抗PAR3、抗PAR4兔多克隆抗體及相應(yīng)的同型對(duì)照抗體，4避光孵育30min,10g/LBSA/PBS洗2次;PAR3,PAR4管再加入FITC標(biāo)記的羊抗兔Ig二抗，4避光孵育30min,10g/LBSA/PBS洗2次,最后各管均加入500L1PB

8、S懸浮細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀CELLQUEST軟件檢測(cè)和分析上皮細(xì)胞PAR的表達(dá)情況. 1.2.4免疫熒光細(xì)胞染色將A549細(xì)胞接種于8孔顯微鏡玻片培養(yǎng)過(guò)夜，用10g/LBSA/PBS漂洗后加入甲醇固定20min,然后用10g/LBSA/PBS孵育5min，加入120的PE標(biāo)記的抗PAR1、抗PAR2小鼠抗人mAb、抗PAR3、抗PAR4兔多克隆抗體及相應(yīng)的同型對(duì)照抗體，室溫避光孵育1h,10g/LBSA/PBS洗3次,PAR3，PAR4管再加入FITC標(biāo)記的羊抗兔Ig二抗，室溫避光孵育1h,10g/LBSA/PBS洗3次,最后用甘油封片，共聚焦顯微鏡下觀察. 2結(jié)果 2.1肺上皮細(xì)胞PARsm

9、RNA的表達(dá)肺上皮細(xì)胞表達(dá)PAR1，PAR2，PAR3和PAR4的mRNA，擴(kuò)增PAR1，PAR2，PAR3和PAR4mRNA的長(zhǎng)度分別為500,461,403和401bp（Fig1）. 2.2肺上皮細(xì)胞PARs蛋白質(zhì)的表達(dá)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)肺上皮細(xì)胞表達(dá)PAR1，PAR2，PAR3和PAR4，其中PAR4的表達(dá)為最強(qiáng)，PAR1和PAR3的表達(dá)水平較相似，PAR2的表達(dá)水平最弱.免疫熒光細(xì)胞染色分析進(jìn)一步證實(shí)上述PARs在肺上皮細(xì)胞上的表達(dá)（Fig2）. Fig2ImmunofluorescencestainingofPARsonlungepithelialcells 圖2免疫熒光細(xì)胞染色分析

10、檢測(cè)肺上皮細(xì)胞PAR的表達(dá) 3討論 PARs家族共有PAR1，PAR2，PAR3和PAR44個(gè)成員，凝血酶可激活PAR1、PAR3和PAR4，而PAR2可被胰蛋白酶、肥大細(xì)胞類胰蛋白酶和活化的凝血因子所激活3-5.另外，這些受體還可被相應(yīng)的PARs激動(dòng)肽所激活.其中PAR1是凝血酶的高親和力受體，而PAR4只能被高濃度凝血酶激活.探究顯示，凝血酶通過(guò)PAR1和PAR4途徑協(xié)同互補(bǔ)介導(dǎo)血小板的活化，而PAR3作為PAR4的輔助因子，在血小板活化中也起著一定功能6，除參和凝血外，多種細(xì)胞類型PARs的廣泛激活還可參和血管損傷反應(yīng)7,8.PAR2的激活可參和細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)的釋放,增加微血管的滲出

11、以及中性粒細(xì)胞的趨化,血管擴(kuò)張,血管收縮,細(xì)胞增殖等炎癥的病理過(guò)程.此外，在不同的生理和病理?xiàng)l件下，體內(nèi)不同的內(nèi)源性蛋白酶的存在，可能會(huì)激活同一細(xì)胞上的PAR2. 我們利用RTPCR、流式細(xì)胞儀和免疫熒光細(xì)胞染色分析技術(shù)檢測(cè)到了4種PARs在肺上皮細(xì)胞上的表達(dá).肺上皮細(xì)胞作為首先接觸吸入性抗原的組織細(xì)胞之一，在變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)病機(jī)制中起重要功能，它能夠合成和釋放許多前炎癥細(xì)胞因子和趨化性細(xì)胞因子，包括IL1，IL6，IL8，GMCSF，MIP，RANTES和eotaxin等3,9，還可以合成抗炎因子如PGE2和NO10.通過(guò)這些因子的功能來(lái)募集、激活炎癥性細(xì)胞從而調(diào)節(jié)機(jī)體的炎癥過(guò)程，尤其是P

12、AR2的激活可多方面參和肺部炎癥的發(fā)生和發(fā)展.我們也曾經(jīng)用胰蛋白酶和PAR2激動(dòng)肽激活肺上皮細(xì)胞，誘導(dǎo)其產(chǎn)生了趨化性細(xì)胞因子MCP111，但其釋放的機(jī)制及肺上皮細(xì)胞表達(dá)PARs的生理和病理生理意義還有待進(jìn)一步的探索. 【參考文獻(xiàn) 1DeryO,CorveraCU,SteinhoffM,etal.Proteinaseactivatedreceptors摘要:NovelmechanismsofsignalingbyserineproteasesJ.AmJPhysiol,1998；274（6Pt1）摘要:C1429-C1452. 2OssovskayaVS,BunnettNW.Proteaseact

13、ivatedreceptors摘要:ContributiontophysiologyanddiseaseJ.PhysiolRev,2004；84(2)摘要:579-621. 3AsokananthanN,GrahamPT,FinkJ,etal.Activationofproteaseactivatedreceptor(PAR)1,PAR2,andPAR4stimulatesIL6,IL8,andprostaglandinE2releasefromhumanrespiratoryepithelialcellsJ.JImmunol,2002；168（7）摘要:3577-3585. 4HeS,Asl

14、amA,GacaMD,etal.Inhibitorsoftryptaseasmastcellstabilizingagentsinthehumanairways摘要:Effectsoftryptaseandotheragonistsofproteinaseactivatedreceptor2onhistaminereleaseJ.JPharmacolExpTher,2004；309(1)摘要:119-126. 5OBrienPJ,MolinoM,KahnM,etal.Proteaseactivatedreceptors摘要:ThemeandvariationsJ.Oncogene,2001;2

15、0（13）摘要:1570-1581. 6MacfarlaneSR,SeatterMJ,KANKET,etal.ProteinaseActivatedReceptorsJ.PharmacolRev,2001；53(2)摘要:245-282. 7CoughlinSR.ProteaseactivatedreceptorsinvascularbiologyJ.ThrombHaemost,2001；86(1)摘要:298-307. 8GriffinCT,SrinivasanY,ZhengYW,etal.AroleforthrombinreceptorsignalinginendothelialcellsduringembryonicdevelopmentJ.Science,2001；293(5535)摘要:1666-1670. 9StellatoC,BeckLA,GorgoneGA,etal.ExpressionofthechemokineRANTESbyahumanbronchialepithelialcellline摘要:ModulationbycytokinesandglucocorticoidsJ.JImm