第八章食品中致病菌和病毒

1、第八章 食品中致病菌和病毒,8.1 腸桿菌科,腸桿菌科是存在于人和動物腸道或自然界中的一群生物學(xué)性狀很相似的革蘭氏陰性短小桿菌。無芽孢，多數(shù)有周身鞭毛，能運(yùn)動。 在普通培養(yǎng)基上能生長。 培養(yǎng)溫度為35C。 需氧或兼性厭氧。 能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，氧化酶試驗(yàn)陰性，觸酶試驗(yàn)陽性,8.1.1大腸桿菌,大腸桿菌E. coli是腸道正常菌群。一般情況下，多不致病，是人和動物腸道中的常居菌。 在一定條件下，可引起腸道道外感染。 致病性大腸桿菌：腸產(chǎn)毒性大腸桿菌（Enterotoxigenic E. coli); 腸致病性大腸桿菌（Enteropathogenic E. coli); 腸侵襲性大腸桿菌（E

2、nteroinvasive E. coli); 腸出血性大腸桿菌（Enterohemorrhagic E. coli)。 引起腹瀉、出血性腸炎,腸產(chǎn)毒性大腸桿菌（Enterotoxigenic E. coli，ETEC) 引起嬰幼兒和旅游者腹瀉，出現(xiàn)輕度水瀉，也可呈嚴(yán)重霍亂樣癥狀。腹瀉常為自限性，一般23d即愈。 鑒定ETEC主要測定大腸桿菌腸毒素，血清型有一定的參考意義,腸致病性大腸桿菌（Enteropathogenic E. coli，EPEC)是嬰兒腹瀉的主要病原菌，具有高度傳染性，嚴(yán)重者可致死，成人少見。EPEC產(chǎn)生VT毒素。 VT毒素具有神經(jīng)毒素、細(xì)胞毒素和腸毒素性。 鑒定EPEC根

3、據(jù)臨床表現(xiàn)和血清型,腸致病性大腸桿菌,腸侵襲性大腸桿菌（Enteroinvasive E. coli，EIEC) EIEC的多數(shù)菌株無動力，生化反應(yīng)和抗原結(jié)構(gòu)均類似痢疾桿菌。 EIEC可引起豚鼠角結(jié)合膜炎，臨床上可借此協(xié)助鑒定EIEC,腸出血性大腸桿菌（Enterohemorrhagic E. coli，EHEC)可引起散發(fā)性或爆發(fā)性出血性結(jié)腸炎。主要菌型是O157：H7，還可有O26、O111、O103、O145等。 1996年O157：H7在日本引起萬人的食物中毒，此外，美國、加拿大、瑞典、澳大利亞、英國等國家和地區(qū)相繼報(bào)道了EHEC O157：H7的散發(fā)性感染和爆發(fā)流行。 我國于1999

4、年在蘇、皖、魯、豫發(fā)生爆發(fā)流行,腸出血性大腸桿菌,腸出血性大腸桿菌O157: H7的檢驗(yàn)方法： 1、培養(yǎng)基制備 改良EC新生霉素增菌肉湯 （mEC）： EC肉湯滅菌后添加20mg/mL過濾除菌的新生霉素，使終濃度為20g/mL。 改良山梨醇麥康凱瓊脂（TC-SMAC）：山梨醇麥康凱瓊脂加入過濾除菌的1%亞碲酸鉀溶液，使終濃度2.5mg/L，頭孢克污，使終濃度為0.05mg/L。 MUG-LST肉湯：LST肉湯中添加4-甲基傘形酮-D-葡萄糖醛酸苷（MUG），使終濃度為0.1g/L。 2、增菌培養(yǎng) 稱取25克樣品放入225mL mEC中，均質(zhì)。于411培養(yǎng)18-24小時(shí),3、分離 將mEC肉湯培

5、養(yǎng)物10倍遞增稀釋。從10-4，10-5，10-6稀釋度，各取0.1mL涂布于TC-SMAC平板。于361培養(yǎng)1824小時(shí)。 可疑 EHEC O157:H7菌落扁平，透明或半透明，邊緣光滑，呈淡褐色中心，直徑約2mm。 4、鑒定 挑取TC-SMAC上的可疑菌落，接種MUG-LST，于361培養(yǎng)1824小時(shí)，出現(xiàn)產(chǎn)氣，且無熒光者，分離到普通營養(yǎng)瓊脂。 對純菌落用EHEC O157:H7標(biāo)準(zhǔn)血清或膠乳凝集試劑作凝集試驗(yàn)，必要時(shí)進(jìn)行生化試驗(yàn)。 在檢測過程中，也可以在選擇性增菌后，取出5mL增菌液，經(jīng)100水浴15分鐘滅活后，供自動酶聯(lián)熒光免疫測試（VIDAS），迅速獲得初步結(jié)果，陽性反應(yīng)者需作進(jìn)一步

6、證實(shí),EHEC O157:H7檢驗(yàn)程序圖解 檢樣25g mEC225mL 酶聯(lián)熒光免疫測試VIDAS快速篩選 411，18-24h 10-4，10-5，10-6稀釋度涂布TC-SMAC 361，18-24h 挑取5-10個(gè)可疑菌落接種MUG-LST 361，18-24h MUG陰性培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種普通營養(yǎng)瓊脂 生化反應(yīng)鑒定 血清凝集鑒定或膠乳凝集試驗(yàn),生化試驗(yàn)：將斜面培養(yǎng)物移種到下列培養(yǎng)基中進(jìn)行生化試驗(yàn)。 1 色氨酸肉湯：在361培養(yǎng)242h后,加Kovacs氏試劑0.20.3mL,上層出現(xiàn)紅色為靛基質(zhì)陽性反應(yīng)。 2 MR-VP培養(yǎng)基：在361培養(yǎng)482h。以無菌操作移取培養(yǎng)物1 mL至13mm10

7、0mm試管中,加5-萘酚乙醇溶液0.6mL,40氫氧化鉀溶液0.2mL和少許肌酸結(jié)晶,振搖試管后靜置2h,如出現(xiàn)伊紅色,為VP試驗(yàn)陽性。將MR-VP培養(yǎng)物的剩余部分再培養(yǎng)48h滴加5 滴甲基紅溶液。如培養(yǎng)物變紅色,為甲基紅試驗(yàn)陽性,若變黃色則為陰性反應(yīng)。 3 Koser氏枸椽酸鹽肉湯：于361培養(yǎng)96h記錄有無生長。 4 LST肉湯：于361培養(yǎng)482h,觀察試管中是否產(chǎn)氣。 5 革蘭氏染色：取18h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物作革蘭氏染色。大腸桿菌為革蘭氏陰性,靛基質(zhì)（Indole）試驗(yàn)： 某些細(xì)菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來。吲哚與對二甲基氨基苯醛結(jié)合，形成玫瑰吲

8、哚，為紅色化合物。 試驗(yàn)方法：將待試純培養(yǎng)物小量接種于試驗(yàn)培養(yǎng)基管，于361C培養(yǎng)24h時(shí)后，取約2ml培養(yǎng)液，加入Kovacs氏試劑23滴，輕搖試管，呈紅色為陽性，或先加少量乙醚或二甲苯，搖動試管以提取和濃縮靛基質(zhì)，待其浮于培養(yǎng)液表面后，再沿試管壁徐緩加入Kovacs氏試劑數(shù)滴，在接觸面呈紅色，即為陽性,甲基紅（Methyl Red）試驗(yàn) 腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基PH值下降至pH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。 V-P試驗(yàn) 某些細(xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄

9、糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強(qiáng)堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物， 稱VP（+）反應(yīng)。 大腸桿菌：MR + /VP,枸椽酸鹽試驗(yàn)： 某些細(xì)菌能利用枸椽酸鹽作為碳源，及磷酸銨作為氮源，將枸椽酸鹽分解為二氧化碳，培養(yǎng)基反應(yīng)后成堿性，由于指示劑的作用，培養(yǎng)基變?yōu)樘m色,用上述方法在樣品中分離獲得的純菌落，經(jīng)抗E.coli O157:H7標(biāo)準(zhǔn)血清或EHEC O157:H7膠乳凝集測試為陽性者，報(bào)告檢出腸出血性大腸桿菌O157:H7。 如需要進(jìn)一步檢測Vero毒素基因的存在，可通過接種Vero細(xì)胞或Hela細(xì)胞，觀察細(xì)胞病變進(jìn)行判定，或可使用基因

10、探針檢測和聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測法,大腸桿菌的檢測,1）常規(guī)檢測方法 國家標(biāo)準(zhǔn)：國家標(biāo)準(zhǔn)采用三步法，即：乳糖發(fā)酵試驗(yàn)、分離培養(yǎng)和證實(shí)試驗(yàn)。 乳糖發(fā)酵試驗(yàn)：樣品稀釋后，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種三管乳糖膽鹽發(fā)酵管。361培養(yǎng)482h，觀察是否產(chǎn)氣。 分離培養(yǎng)：將產(chǎn)氣發(fā)酵管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，361培養(yǎng)18-24h，觀察菌落形態(tài)。 證實(shí)試驗(yàn)：挑取平板上的可疑菌落，進(jìn)行革蘭氏染色觀察。同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管361培養(yǎng)242h，觀察產(chǎn)氣情況。 報(bào)告：根據(jù)證實(shí)為大腸桿菌陽性的管數(shù)，查MPN表，報(bào)告每100ml（g）大腸菌群的MPN值,原國家商檢局制訂的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，等效采用美國FDA的標(biāo)準(zhǔn)方

11、法，用于對出口食品中的大腸桿菌進(jìn)行檢測。本方法采用兩步法： 推測試驗(yàn)：樣品稀釋后，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種三管LST肉湯。361培養(yǎng)482h，觀察是否產(chǎn)氣。 證實(shí)試驗(yàn)：將產(chǎn)氣管培養(yǎng)物接種煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯管中，361培養(yǎng)482h，觀察是否產(chǎn)氣。以BGLB產(chǎn)氣為陽性。查MPN表，報(bào)告每ml(g)樣品中大腸菌群的MPN值,2) PCR方法,大腸桿菌是食品和水源污染糞便的指示菌。 Gene-TARK研制出用浸染棒檢測大腸桿菌中16SrRNA的探針，樣品需前增菌處理，以異硫氰熒光素（FITC）標(biāo)記探針，再用辣根過氧化物酶標(biāo)記抗FITC抗體檢測雜交復(fù)合物。 Hsu等報(bào)導(dǎo)此方法特異性（除相

12、近的志賀氏菌外）達(dá)100，假陽性率達(dá)1.2,8.1.2 沙門氏菌屬（Salmonella,沙門氏菌是引起食物中毒的重要病原菌。在世界各國各類細(xì)菌性的食物中毒中，沙門氏菌常居前列。因此，沙門氏菌的檢測是各國檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)對多種進(jìn)出口食品的必檢項(xiàng)目之一。 沙門氏菌屬是腸桿菌科中最復(fù)雜的菌屬。它屬于革蘭氏陰性桿菌?？筛鶕?jù)沙門氏菌的菌體抗原（O抗原）分群（A, B, C等），再根據(jù)其鞭毛抗原（H抗原）分血清型（1、2等,沙門氏菌不產(chǎn)生外毒素，但能產(chǎn)生毒力較強(qiáng)的內(nèi)毒素。 沙門氏菌主要通過食物、飲水經(jīng)口感染?？纱嬖诙喾N食物中，包括生肉、禽、蛋、奶制品、蝦、魚和田雞腿等。 沙門氏菌主要通過食物、飲水經(jīng)口感染。根據(jù)

13、侵入機(jī)體沙門氏菌菌種的不同，在臨床上引起四種不同的疾病,1）傷寒、副傷寒 由沙門氏屬中的傷寒桿菌和甲、乙、丙型副傷寒桿菌引起。 （2）食物中毒 沙門氏菌屬引起的食物中毒，主要以腸炎桿菌、鼠傷寒桿菌、豬霍亂桿菌、丙型副傷寒桿菌和湯普遜桿菌等最為多見。臨床癥狀主要是胃腸炎。病程較短，一般24d, 可完全恢復(fù)。 （3）敗血癥 多為豬霍亂桿菌引起，甲、乙、丙型副傷寒桿菌和腸炎桿菌亦可引起敗血癥。 （4）慢性腸炎 沙門氏桿菌可引起慢性、持久性腸炎,從食品中分離沙門氏菌樣品制備,由于食品種類繁多，且每類中包括許多品種。因其加工方式不同，導(dǎo)致性狀各異。故在進(jìn)行微生物學(xué)檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)按不同的形狀、加工方式及檢驗(yàn)?zāi)?/p>

14、的合理進(jìn)行檢樣處理。 檢樣處理 冷凍的檢樣 在檢樣前最好不要解凍，將沙門氏菌的損傷降低到最低限度。 粉狀樣品 應(yīng)將225ml增菌液分?jǐn)?shù)次加入，并用滅菌玻棒攪拌成均勻懸液。 帶殼蛋類 在流水下用刷子刷洗蛋類，并瀝干。將蛋類在含0.1十二烷基磺酸鈉的200mg/kg Cl-溶液中浸泡30min后方可破殼取蛋,檢測方法,從食品中分離和鑒定沙門氏菌，當(dāng)前通常采用的方法共分5個(gè)步驟： 前增菌：食品樣品在含有營養(yǎng)的非選擇性培養(yǎng)基中增菌，使受損傷的沙門氏菌細(xì)胞恢復(fù)到穩(wěn)定的生理狀態(tài)。 選擇性增菌：此培養(yǎng)基允許沙門氏菌持續(xù)增菌，同時(shí)阻止大多數(shù)其他細(xì)菌的增殖。 選擇性平板分離：采用固體選擇培養(yǎng)基，抑制非沙門氏菌的

15、生長，提供肉眼可見的疑似沙門氏菌純菌落的識別。 生物化學(xué)篩選：排除大多數(shù)非沙門氏菌，也提供了沙門氏菌培養(yǎng)物菌屬的初步鑒定。 血清學(xué)技術(shù)鑒定培養(yǎng)物菌種,1）沙門氏菌的增菌和分離 預(yù)增菌 將制備好的預(yù)增菌試液于35培養(yǎng)24h后，輕輕振搖培養(yǎng)液。 選擇性增菌 選擇性平板分離 混勻培養(yǎng)物，用直徑3mm的接種環(huán)，1滿環(huán)（10ul）分別劃線接種于亞硫酸鉍（BS）瓊脂、木糖賴氨酸去氧膽酸鹽（XLD）瓊脂和HEKTONE氏腸道菌（HE）瓊脂平板上，于35培養(yǎng)24h后，根據(jù)沙門氏菌在不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征挑取典型或可疑菌落,2）沙門氏菌的篩選和生化、血清學(xué)鑒定 篩選 用滅菌接種針挑取每個(gè)典型或可疑菌落的

16、中心部位，分別接種三糖鐵（TSI）、賴氨酸鐵瓊脂斜面，于35培養(yǎng)24h。 在TSI瓊脂中，典型的沙門氏菌培養(yǎng)物可使斜面呈堿色（紅色），底層呈酸色（黃色），產(chǎn)生H2S（瓊脂變?yōu)楹谏┗虿划a(chǎn)生H2S。 生化學(xué)、血清學(xué)鑒定 混雜培養(yǎng)物 對呈混雜的TSI瓊脂培養(yǎng)物，皆應(yīng)劃線于MC、HE或XLD瓊脂上，于35培養(yǎng)24h后，進(jìn)行重新分離并至少挑取2個(gè)可疑菌落接種到斜面上進(jìn)行鑒定,純培養(yǎng)物 將每個(gè)可疑陽性的TSI瓊脂斜面培養(yǎng)物，分別接種于尿素肉湯中，35培養(yǎng)24h，獲取多量的瓊脂斜面培養(yǎng)物接種于快速尿素肉湯中，于37水浴培養(yǎng)2h。棄去所有呈陽性結(jié)果的培養(yǎng)物，保留所有呈陰性反應(yīng)的培養(yǎng)物作進(jìn)一步鑒定。 血清學(xué)多

17、價(jià)鞭毛（H）試驗(yàn) 血清學(xué)多價(jià)菌體（O）試驗(yàn) 菌體（O）群試驗(yàn) 鞭毛（H）試驗(yàn)陰性培養(yǎng)物的誘導(dǎo) （3）結(jié)果判定,8.3 彎曲菌,彎曲菌是一組人畜共患的病原微生物，能引起人的腹瀉和食物中毒，在國外已被廣泛的重視，同時(shí)也被公認(rèn)為新發(fā)現(xiàn)的病原菌之一。 彎曲菌是革蘭氏陰性菌，呈弧形和S型。 彎曲菌以病原菌和共生菌廣泛存在于動物中，家禽家畜是主要的貯存宿主和傳染源，在傳染或帶菌動物的腸道和生殖道內(nèi)容物中含有大量的彎曲菌。食用被污染的食物、水，尤其是雞、鴨、蛋，未消毒或消毒不完全的牛奶，均可致病,檢驗(yàn)方法,1）常規(guī)方法,2）現(xiàn)代檢驗(yàn)技術(shù) 基因探針法 核酸雜交試驗(yàn)是以互補(bǔ)核酸鏈能夠特異性結(jié)合并形成穩(wěn)定的雙鏈復(fù)

18、合物為基礎(chǔ)?；蛱结樝到y(tǒng)采用的是發(fā)光劑標(biāo)記的單鏈DNA探針，該探針與核糖體RNA結(jié)合形成穩(wěn)定的DNA:RNA雜交體。選擇試劑將未雜交和雜交探針分開。標(biāo)記的DNA:RNA雜交作用GEN-PROBE發(fā)光儀檢測。發(fā)光儀讀數(shù)大于或等于CUT-OFF值的為陽性，低于CUT-OFF值的為陰性,PCR法 根據(jù)彎曲菌屬16sRNA高保守序列設(shè)計(jì)一對引物；在合適的反應(yīng)條件和反應(yīng)體系下進(jìn)行反應(yīng)；最后利用電泳觀察結(jié)果。 熒光酶標(biāo)試劑盒 檢測彎曲桿菌的探針是用非放射性物質(zhì)標(biāo)記的。標(biāo)記物為發(fā)光素。靶順序?yàn)閞RNA。近年來用堿性磷酸酶人工合成的寡核苷酸檢測人工污染的糞便樣品，檢測量為一百萬個(gè)菌落形成單位（CFU)，敏感性

19、和特異性達(dá)100。 此方法只在臨床檢測中應(yīng)用，尚未用于食品檢測,8.4 金黃色葡萄球菌,葡萄球菌是一類革蘭氏陽性菌。它的致病力的強(qiáng)弱與其產(chǎn)生的毒素及酶類有關(guān)。人一旦感染該菌，當(dāng)機(jī)體抵抗力減弱或皮膚受損時(shí)，易被感染，引起傷口化膿、中耳炎、毛囊炎等。產(chǎn)生葡萄球菌腸毒素的還可引起食物中毒。 對人有致病性的葡萄球菌多產(chǎn)生-溶血素；對動物有致病性的葡萄球菌多產(chǎn)生-溶血毒素,金黃色葡萄球菌某些菌株能產(chǎn)生一種能引起急性腸胃炎的腸毒素，當(dāng)這些菌株污染了食物，在溫度條件適宜時(shí)，即可產(chǎn)生相當(dāng)數(shù)量的腸毒素，根據(jù)腸毒素的血清型別不同，分為A、B、C、D、E五型。其中以A型引起的食物中毒最多，B和C型次之。腸毒素是一種

20、可溶性蛋白質(zhì)純化的腸毒素，能耐高溫,血漿凝固酶是鑒別葡萄球菌有無致病性的重要指標(biāo)。血漿凝固酶具有抗原性，可分為8型。大多數(shù)致病性葡萄球菌能產(chǎn)生此酶，而非致病菌不產(chǎn)生?？蓱?yīng)用8個(gè)型的凝固酶抗血清進(jìn)行分型試驗(yàn)，用來研究葡萄球菌的流行病學(xué)情況,檢驗(yàn)方法,1）常規(guī)檢驗(yàn)方法,2）現(xiàn)代檢驗(yàn)技術(shù) 利用miniVidas全自動免疫分析儀，它是應(yīng)用酶聯(lián)免疫技術(shù)，用熒光分析技術(shù)通過固相吸附器，用已知抗體來捕捉目標(biāo)生物體，然后以帶熒光的酶聯(lián)抗體再次結(jié)合，經(jīng)充分沖洗，通過激發(fā)光源檢測，即能自動讀出發(fā)光的陽性標(biāo)本，其優(yōu)點(diǎn)是檢測靈敏度高、速度快，可在48h的時(shí)間內(nèi)快速篩選鑒定出金黃色葡萄球菌及金黃色葡萄球菌腸毒素,美國3

21、M公司，利用耐熱核酸酶特性，設(shè)計(jì)出紙片法，能在24h快速檢測出金黃色葡萄球菌。 大多數(shù)檢測葡萄球菌的探針是針對腸毒素的。它們能同編碼腸毒素有關(guān)的基因序列雜交，這類探針能檢測腸毒素A、B、C和E。 PCR法：設(shè)計(jì)特異性引物根據(jù)產(chǎn)生腸毒素A-E基因（entA, entB, entC, entD和entE),檢測葡萄球菌exfoliative基因，檢測中毒休克毒素基因(tst,8.5 肉毒梭菌,肉毒梭菌是嚴(yán)重食物中毒的病原菌之一，在厭氧的環(huán)境下能產(chǎn)生強(qiáng)烈的外毒素。這種毒素毒性強(qiáng)烈，是一種獨(dú)特的神經(jīng)麻痹毒素，即肉毒毒素。該毒素性質(zhì)穩(wěn)定，是目前已知化學(xué)毒物和生物毒素中毒性最強(qiáng)烈者，對人的致死劑量為0.

22、1ug,肉毒梭菌在自然界的分布具有某種區(qū)域性差異，顯示出生態(tài)上的差異傾向。根據(jù)抗原特異性，可分為A、B、C、D、E、F、G七個(gè)型別。 肉毒梭菌一年四季均可發(fā)生，發(fā)病主要與飲食習(xí)慣有密切的關(guān)系。 歐美國家：肉類食品、罐頭食品； 日本等沿海國家：進(jìn)食水產(chǎn)品； 我國內(nèi)地：進(jìn)食發(fā)酵食品（如臭豆腐、豆瓣醬、豆豉等,檢驗(yàn)方法,1）常規(guī)肉毒梭菌的檢出 GB/T 4789.12-2003 2）PCR法,報(bào)告（一）：檢樣含某型肉毒毒素 報(bào)告（二）：檢樣含某型肉毒梭菌 報(bào)告（三）：由樣品分離的菌株為某型肉毒梭菌,8.6 致病性弧菌,弧菌屬共有37個(gè)種（變種），其中已明確又12個(gè)種對人類有致病作用。在這12種致病菌

23、種，最重要的，也是問題最多的是O1型霍亂弧菌、非O1型霍亂弧菌、副溶血性弧菌和創(chuàng)傷弧菌。 霍亂弧菌(Vibrionaceae cholerae) 霍亂弧菌是由O1血清群和O139血清群引起的烈性消化道傳染病。該病傳播快, 波及面廣，是屬于國際檢疫的傳染病。 水是傳播霍亂的主要媒介。 與霍亂有關(guān)的食品主要是海產(chǎn)品、有殼的水生動物和甲殼動物，主要有魚、蝦、貝類、甲魚、牛蛙、蟹等,霍亂弧菌引起的疾病叫霍亂。 由霍亂弧菌E1 Tor生物型引起的癥狀較輕，病程也短。 霍亂弧菌腸毒素會引起機(jī)體嚴(yán)重的嘔吐、腹瀉等臨床癥狀。 霍亂弧菌的檢測方法 生物學(xué)檢測方法，作霍亂弧菌O1+O139多價(jià)血清凝集試驗(yàn)（水、食

24、品）。 PCR（對毒力基因ctxAB、tcpA進(jìn)行擴(kuò)增,致病性弧菌的檢測方法 1、具有代表性檢驗(yàn)方法簡介 （1） FDA的細(xì)菌學(xué)分析手冊 霍亂、付弧、創(chuàng)傷弧菌和其他弧菌（1995 1998修訂）分別著重介紹了霍亂弧菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌的方法。 用PCR方法檢測產(chǎn)腸毒素的霍亂弧菌敘述了霍亂腸毒素cholera Toxin (T)基因 （2） AOAC官方分析方法 牡蠣中的霍亂弧菌：升溫富集法（1995.a） 創(chuàng)傷弧菌的脂肪酸氣相色譜鑒定法AOAC.(1995.b） 美國midi公司生產(chǎn)的shelock微生物鑒定系統(tǒng),3） ISO方法 副溶血弧菌的檢測方法（ISO8914：1990E） （4）

25、 NMKL 食品中致病性弧菌的檢測和計(jì)數(shù)（NMKL N0156）介紹了霍亂弧菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌的檢測程序。 （5） 不同國家的方法 日本、瑞士等國均有相應(yīng)檢驗(yàn)方法。 2、致病性弧菌的檢測方法 以上介紹的方法均是以單一或少數(shù)目標(biāo)菌（NMKL為四種）為目的的設(shè)計(jì)的程序。鑒于國外對出口食品中多種致病性弧菌的要求和重視，有必要探討“同一程序同時(shí)檢測多種弧菌”方法,檢驗(yàn)程序 25g樣品+225mL APW(1% NaCl pH9.0) 增菌 378-16h 取10mL加入雙倍APW 376-8h 選擇 選擇培養(yǎng)基 TCBS（霍利斯用非選擇性的羊血球瓊脂） 3724h 定弧菌 取黃色或綠色

26、菌落做G染色、氧化酶、動力 O/129(150ug)、D-甘露糖 分組 初步鑒定：0% NaCl , 1% NaCl、硝酸鹽還原、精氨酸雙水解酶、賴氨酸脫羧、鳥氨酸脫羧、(氧化酶) 分成5組 確證 最后鑒定,8.7 病毒,8.7.1 諾瓦科病毒（Norwalk virus） 1972年首次發(fā)現(xiàn)。 諾瓦科病毒是直徑27nm的圓形結(jié)構(gòu)的病毒，無包膜，尚不能在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。 Norwalk病毒是最重要的引起腹瀉的腸道病毒。食品（包括水）被諾瓦科病毒感染后，出現(xiàn)以急性腸胃炎為主的臨床癥狀。目前，這類病毒尚無特效治療藥物,20世紀(jì)70年代在澳大利亞爆發(fā)了有2000多人感染諾瓦科病毒。另一起病例原因是運(yùn)垃圾

27、船將垃圾倒在正在捕撈貝類的區(qū)域。 2006年11月，美國一艘名為“海洋自由”號的豪華郵輪，遭到了諾瓦克病毒的襲擊，在為期一周的航行中，300多名乘客和船員感染了諾瓦克病毒，受感染的人數(shù)是這艘船搭載的總?cè)藬?shù)的7%。 諾瓦科病毒的毒力較強(qiáng)，發(fā)病有明顯的季節(jié)性（秋冬季），一般不造成爆發(fā)流行,在2006年底的一周內(nèi)，日本各地小兒科醫(yī)療機(jī)構(gòu)上報(bào)的諾瓦克病毒腹瀉人數(shù)，達(dá)到了6萬多人，發(fā)病率超過了有相關(guān) 統(tǒng)計(jì)25年來的歷年最高紀(jì)錄。根據(jù)推算，日本境內(nèi)已經(jīng)有超過300萬人感染諾瓦克病毒。 自2002年以來，日本每年冬季都會爆發(fā)諾瓦克病毒，其中一些和牡蠣(生蠔)和生海鮮有關(guān)。2006年，日本媒體關(guān)注諾瓦克病毒和

28、感染者在療養(yǎng)院死亡的情況。2006年到2007年，諾瓦克感染例子幾乎是之前的3倍,檢測方法,1）免疫電鏡法（IEM） NV被發(fā)現(xiàn)后很長一段時(shí)間內(nèi)，電鏡一直是檢測的主要手段，具有直接、可靠的優(yōu)點(diǎn)。電鏡觀察需要的樣品量為106107個(gè)病毒顆粒/mL排泄物。這個(gè)技術(shù)僅在發(fā)病早期適用。 免疫電鏡能使電鏡的靈敏度提高10-100倍。在顯微鏡下包被康復(fù)病人的血清。血清抗體玉同源病毒相結(jié)合，因此提高了診斷效率。但I(xiàn)EM不適合大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查,2）放射免疫和生物素親和素法（RIA法） 檢測抗原與IEM法相比在靈敏度上沒有明顯差異，但用RIA法能檢測出急性期和恢復(fù)期之間抗體升高 4倍以上，對流行病學(xué)調(diào)查更有意

29、義。實(shí)驗(yàn)需6d，同時(shí)還需要放射性同位素標(biāo)記。 （3）酶鏈免疫法（ELISA) 此法特異性強(qiáng)，靈敏度高，診斷迅速，且較經(jīng)濟(jì)，是目前可廣泛應(yīng)用的檢測方法。這種技術(shù)的檢測樣品量要求104106病毒顆粒/mL排泄物,4）雜交技術(shù)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR） RT-PCR方法是檢測病人排泄物和環(huán)境中樣品的諾瓦科病毒基因的特異手段。這個(gè)方法的靈敏度為102104病毒顆粒/mL排泄物。高敏感的RT-PCR方法依賴于PCR引物的設(shè)計(jì)。依賴RNA的RNA聚合酶區(qū)域被認(rèn)為是諾瓦科病毒基因組的最保守的區(qū)域。盡管用于擴(kuò)增的RdRp區(qū)域基因的引物能擴(kuò)增大多數(shù)的諾瓦科病毒，但由于諾瓦科病毒遺傳多樣性使這些引物很難

30、擴(kuò)增所有的諾瓦科病毒,8.7.2 甲肝病毒（HAV,病毒性肝炎是當(dāng)前危害人類健康的疾病之一。 目前認(rèn)為病毒性肝炎病原體至少有五種，包括甲型肝炎病毒（HAV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、丁型肝炎病毒（HDV）、戌型肝炎病毒（HEV），它們的特性、傳播途徑、臨床經(jīng)過均不完全相同，但它們均能引起肝炎病變,1973年Feinslone 首先用免疫電鏡技術(shù)在急性期患者的糞便中發(fā)現(xiàn)甲型肝炎病毒 (Hepatitis A virus,HAV ) 。屬微小RNA病毒科，新型腸道病毒72型。人類感染HAV后，大多表現(xiàn)為亞臨床或隱性感染，僅少數(shù)人表現(xiàn)為急性甲型肝炎。一般可完全恢復(fù)，不轉(zhuǎn)為慢性

31、肝炎，亦無慢性攜帶者,HAV,甲型肝炎病毒主要的傳染病源是甲肝病人。可通過污染水源、食物、食具和手等方式進(jìn)行傳播，特別是經(jīng)水和食物，可引起爆發(fā)性流行。另外，通過血液也可傳播。 病人的潛伏期為一個(gè)月，在潛伏后期和急性期，患者的糞便和血液均具有傳染性,檢驗(yàn)方法,1）免疫電鏡 敏感性高，標(biāo)本中含有104106顆粒/mL可被檢出。 將標(biāo)本加入特異性抗體HAV血清，經(jīng)孵育后，HAV顆粒與抗血清發(fā)生凝集，再用超速離心加以濃縮，取其免疫復(fù)合物，用磷鎢酸鹽進(jìn)行染色，于電鏡下檢查HAV球形顆粒。 （2）固相放射免疫測定法 將放射性同位素與免疫化學(xué)相結(jié)合的體外測定超微量物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)方法，具有同位素技術(shù)的高靈敏性、準(zhǔn)

32、確性的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)又兼有抗原抗體反應(yīng)的專一性,另外，檢查方法還有補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附和免疫黏附血凝試驗(yàn)等方法。通過利用葡萄糖球菌A蛋白可吸附IgG的方法，在單份血清中可區(qū)別甲肝抗體為IgM和IgG，根據(jù)急性期病人血清抗體為IgM，而恢復(fù)期病人的血清抗體為主要是IgG，可對甲肝急性期病人進(jìn)行早期診斷,8.7.3 瘋牛病朊病毒,瘋牛病 (“mad cow” disease) 學(xué)名為“牛海綿狀腦病” (Bovine Spongiform Encephalopath - BSE) ，是一種發(fā)生在牛身上的進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變，癥狀與羊瘙癢癥類似，俗稱“瘋牛病”。病牛腦組織呈海綿狀病變，并出現(xiàn)步態(tài)不

33、穩(wěn)、平衡失調(diào)、搔癢、煩燥不安等癥狀，通常在14至90天內(nèi)死亡。由于種類的不同，瘋牛病的潛伏期長短不同，一般在2到 30年之間,20世紀(jì)80年代中期至90年代中期是瘋牛病暴發(fā)流行期，主要的發(fā)病國家如英國及其他歐洲國家有大量的?；疾〔⒈辉讱?，發(fā)生瘋牛病國家的牛肉及牛肉制品的出口受到了嚴(yán)格的限制。 盡管歐洲各國紛紛采取預(yù)防措施，但是到了1989年，瘋牛病還是攻破了英國的近鄰愛爾蘭的大門。瑞士和法國1990年也各自發(fā)現(xiàn)了第一例瘋牛病。到1997年11月，葡萄牙、丹麥、德國、荷蘭、比利時(shí)也相繼出現(xiàn)瘋牛病。1998年瘋牛病又跨出了歐洲，來到南美洲的厄瓜多爾。2000年后，西班牙、瑞典、捷克、希臘、斯洛伐克

34、、芬蘭、奧地利先后“陷落”。值得注意的是遠(yuǎn)隔千山萬水的日本，在2001年也報(bào)告了亞洲首例瘋牛病。2002年，以色列和波蘭相繼出現(xiàn)了國內(nèi)首例瘋牛病,2003年5月，加拿大發(fā)現(xiàn)一例瘋牛病，這是近10年來北美大陸發(fā)現(xiàn)的首例瘋牛病。2003年12月，美國發(fā)現(xiàn)首例瘋牛病。不到20年工夫，瘋牛病就已擴(kuò)散到了歐洲、美洲和亞洲的幾十個(gè)國家。英國是發(fā)生瘋牛病最多的國家，1999年統(tǒng)計(jì)占總發(fā)病數(shù)的99。到2000年7月，在英國有超過34000個(gè)牧場的17.6萬多頭牛感染了此病，最高發(fā)病時(shí)間是在1993年1月，每月至少有1000頭牛發(fā)病。截至到2002年，英國共屠宰病牛1100多萬頭，經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)百億英鎊 。 截至2003年12月底，中國尚未發(fā)現(xiàn)瘋牛病,受瘋牛病危害的不僅是牛，人若食用了被污染了的牛肉、牛脊髓等，也有可能染上致命的新型克雅氏癥?；颊吣X部會出現(xiàn)海綿狀空洞，先是表現(xiàn)為焦躁不安，后導(dǎo)致記憶喪失，身體功能失調(diào)，最終精神錯亂甚至死亡。新型克雅