生物堿類藥物的分析

1、第八章 生物堿類藥物的分析,第一節(jié) 概述,一、生物堿（Alkaloids） 生物堿是生物體內(nèi)含氮有機(jī)化合物的總稱,典型藥物的結(jié)構(gòu),二、生物堿類藥物的通性,1. 堿性 季銨堿脂肪胺、脂環(huán)胺芳胺、N芳雜環(huán)酰胺 小檗堿麻黃堿、阿托品罌粟堿咖啡因 嗎啡具酸堿兩性,2. 溶解性 游離生物堿不溶或難溶于水，能溶或易溶于有機(jī)溶劑，在稀酸中成鹽而溶解 生物堿鹽類易溶于水，不溶于有機(jī)溶劑,3. 旋光性 一般多為左旋體有效,第二節(jié) 鑒別試驗(yàn),一、特征鑒別反應(yīng) （一）雙縮脲反應(yīng) 側(cè)鏈具有氨基醇結(jié)構(gòu),二）Vitali反應(yīng) 托烷生物堿,三）綠奎寧反應(yīng) 硫酸奎寧、硫酸奎尼丁,四）Marquis反應(yīng) 嗎啡生物堿,五）Fro

2、hde反應(yīng) 嗎啡生物堿,六） 官能團(tuán)反應(yīng) 吲哚生物堿,1. 利血平 + 新制香草醛玫瑰紅色,2,七）紫脲酸胺反應(yīng) 黃嘌啉類生物堿,八）還原反應(yīng) 嗎啡與磷酸可待因的區(qū)分反應(yīng),二、一般鑒別反應(yīng),一）熔點(diǎn)測定法 （二）沉淀反應(yīng),常用的生物堿沉淀試劑為： 1. 重金屬鹽類，如K2HgI4、KBiI4、I2KI、二氯化汞等； 2. 大分子酸類，如磷鉬酸、硅鎢酸等,三）顯色反應(yīng) 常用的顯色試劑：濃硫酸、濃硝酸、鉬硫酸、釩硫酸、硒硫酸、甲醛硫酸等,四）UV （五）IR,六）色譜法 1. HPLC 2. TLC,硅膠為吸附劑：游離生物堿能順利遷移，生物堿鹽類吸附太牢，造成嚴(yán)重拖尾。 解決方法： （1）在展開劑

3、中加少量的堿性試劑，如氨、二乙胺、有機(jī)脂烴胺類； （2）硅膠板用堿處理,第三節(jié) 特殊雜質(zhì)檢查,特殊雜質(zhì)檢查主要根據(jù)藥物與雜質(zhì)的理化性質(zhì)差異來進(jìn)行,利用藥物和雜質(zhì)在顏色、溶解行為、旋光性質(zhì)、對光吸收選擇性等物理性質(zhì)上的差異，檢查雜質(zhì)是否符合限量規(guī)定,一、物理法,利用藥物與雜質(zhì)在揮發(fā)性、臭味等方面的差異進(jìn)行檢查,一）臭味及揮發(fā)性的差異,ChP（2000） 麻醉乙醚中異臭的檢查 取本品 10ml，置瓷蒸發(fā)皿中，使自然揮發(fā)，揮散完畢后，不得有異臭,二） 顏色的差異,ChP（2000） 鹽酸阿撲嗎啡 檢查 分解產(chǎn)物 取本品 0.10g，加無水氧化物的乙醚 5ml，振搖后，乙醚液只許顯極淡的紅色,三）溶解

4、行為的差異,利用藥物與雜質(zhì)在溶解性方面的差異進(jìn)行檢查。如葡萄糖中糊精的檢查,四）旋光性質(zhì)的差異,ChP（2000） 硫酸阿托品 檢查 莨菪堿 取本品，按干燥品計(jì)算，加水制成每 1ml 中含 50mg 的溶液，依法測定（附錄 E），旋光度不得過 0.40,五）對光吸收性質(zhì)的差異分光光度法,利用藥物與雜質(zhì)在紫外吸收光譜方面的差異進(jìn)行檢查,1. 紫外分光光度法,例1. 中國藥典（2000年版）規(guī)定腎上腺素中檢查腎上腺素酮的方法為：取本品，加鹽酸溶液（92000）制成每1ml中含2.0mg的溶液，于310nm波長處測定，吸收度不得超過0.05，已知腎上腺素酮在310nm波長處的為453，腎上腺素在該波

5、長處無吸收。請計(jì)算腎上腺素酮的限量應(yīng)為（D） A. 0.1 B. 0.5 C. 0.04 D. 0.06% E. 0.0002,2. IR,用于藥物中無效或低效晶型的檢查。利用藥物與雜質(zhì)有特征峰差異進(jìn)行檢查。如甲苯咪唑中A晶型的檢查、無味氯霉素混懸劑中A晶型的檢查,X射線粉末衍射法,3. 原子吸收分光光度法,主要用于金屬元素的檢查，具有靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)。如肝素鈉中鉀鹽的檢查,六）吸附或分配性質(zhì)的差異色譜法,1. TLC,1）雜質(zhì)對照品法,2）高低濃度對比法,3）參比雜質(zhì)對照品法 選用可能存在的某種物質(zhì)作為雜質(zhì)對照品,4）選用質(zhì)量符合規(guī)定的與供試品相同的藥物作為雜質(zhì)對照品,2紙色譜,用于

6、極性較大藥物中雜質(zhì)的檢查或放射性藥物注射液（或溶液）中放射化學(xué)雜質(zhì)的檢查。如地高辛中洋地黃毒苷的檢查,缺點(diǎn)：展開時間長，斑點(diǎn)擴(kuò)散，不能用強(qiáng)酸等腐蝕性顯色劑,3HPLC,1）內(nèi)標(biāo)法加校正因子測定供試品中某個雜質(zhì)的含量,準(zhǔn)確測定雜質(zhì)含量,方法,內(nèi)標(biāo)物+雜質(zhì)對照品對照溶液，進(jìn)樣，測定，計(jì)算校正因子,供試品+內(nèi)標(biāo)供試品溶液，進(jìn)樣，測定雜質(zhì)和內(nèi)標(biāo)峰面積或峰高，計(jì)算雜質(zhì)含量,2）外標(biāo)法測定供試品中某個雜質(zhì)的含量,供試品供試品溶液,雜質(zhì)對照品對照品溶液 進(jìn)樣，測定，計(jì)算雜質(zhì)的含量,缺點(diǎn)：不易準(zhǔn)確控制進(jìn)樣量，宜用定量環(huán)進(jìn)樣,3）加校正因子的主成分自身對照法,方法,待測成分對照品+雜質(zhì)對照品溶液，進(jìn)樣，記錄色譜

7、圖，計(jì)算雜質(zhì)的校正因子,分別進(jìn)樣，供試品溶液的記錄時間除另有規(guī)定外，應(yīng)為主成分保留時間的若干倍，測量供試品溶液色譜圖上各雜質(zhì)的峰面積，分別乘以相應(yīng)的校正因子后與對照溶液主成分的峰面積比較，依法計(jì)算各雜質(zhì)含量,4）不加校正因子的主成分自身對照法,無雜質(zhì)對照品，且雜質(zhì)峰面積與主成分峰面積相差懸殊時應(yīng)用,方法,分別進(jìn)樣，測定供試品溶液中各雜質(zhì)峰面積及其總和，與對照溶液主成分峰面積比較，控制供試品中雜質(zhì)的量,缺點(diǎn)：檢測波長處，各雜質(zhì)和藥物的吸收強(qiáng)度可能有差異，準(zhǔn)確度差,優(yōu)點(diǎn)：不需雜質(zhì)對照品，可同時控制各個雜質(zhì)及其總量限度,5）面積歸一化法,取一定量供試品溶液進(jìn)樣，測定各雜質(zhì)及藥物的峰面積，計(jì)算各雜質(zhì)峰

8、面積及其總和占總峰面積的百分率，不能超過限量。注意溶劑峰不應(yīng)計(jì)算在總峰面積內(nèi),優(yōu)點(diǎn)：不需雜質(zhì)對照品，簡便易行,缺點(diǎn)：檢測波長處，各雜質(zhì)和藥物的吸收強(qiáng)度可能有差異，控制雜質(zhì)峰面積百分率不一定就是雜質(zhì)限量，準(zhǔn)確度差,4GC 用于藥物中揮發(fā)性雜質(zhì)的檢查。如藥物中有機(jī)溶劑殘留量測定。檢查方法同HPLC,二、化學(xué)法,利用藥物與雜質(zhì)在化學(xué)性質(zhì)上的差異進(jìn)行檢查。如阿司匹林中水楊酸的檢查,98：77乙醇中檢查雜醇油是利用（C） A. 顏色的差異 B. 旋光的差異 C. 臭味及揮發(fā)性的差異 D. 對光選擇吸收的差異 E. 溶解行為的差異,例. 藥物中特殊雜質(zhì)的檢查方 法有（ABCDE） A沉淀法與顏色法 B滴定

9、法 C旋光法 D分光光度法 E色譜法,例. HPLC檢查藥物中雜質(zhì)的具體方法有（ABCDE） A峰面積歸一化法 B主成分自身對照法 C內(nèi)標(biāo)法 D外標(biāo)法 E內(nèi)標(biāo)法加校正因,例. 最常用于藥物中特殊雜質(zhì)檢查的方法是(A) A. TLC B. IR C. UV D. MS E. NMR,例. 紅外分光光度法在雜質(zhì)檢查中主要用于（A） A. 藥物中無效或低效晶型的檢查 B. 雜質(zhì)特征峰的確定 C. 雜質(zhì)相關(guān)峰的確定 D. 雜質(zhì)官能團(tuán)的確定 E. 藥物和雜質(zhì)的鑒別,一、非水溶液滴定法（非水堿量法） 原料藥 （一）原理 水溶液中滴定突躍不明顯，在非水介質(zhì)中，堿性增強(qiáng)，使滴定順利進(jìn)行,第四節(jié) 含量測定,1.

10、 溶劑 酸性溶劑：冰醋酸、冰醋酸+醋酐、醋酐 惰性溶劑：苯、氯仿、四氯化碳 能影響溶質(zhì)的解離情況和能影響酸堿強(qiáng)度很大的溶劑：硝基甲烷、丙酮、二氧六環(huán),2. 滴定劑：高氯酸的冰醋酸溶液 或高氯酸的二氧六環(huán)溶液,3. 指示終點(diǎn)的方法 電位法：玻璃甘汞電極系統(tǒng) 指示劑法：結(jié)晶紫、喹哪啶紅等,有機(jī)堿及其鹽類及有機(jī)酸堿金屬鹽類,8pKb10 冰醋酸作溶劑 10pKb12 冰醋酸+醋酐 pKb12 醋酐,二）適用范圍,一般采用半微量法。中國藥典（2000年版）的測定方法為：取經(jīng)適當(dāng)方法干燥的供試品適量約消耗高氯酸滴定液（0.1 mol/L）8 ml，加冰醋酸1030 ml使溶解。若供試品為氫鹵酸鹽，應(yīng)再加

11、5醋酸汞的冰醋酸溶液35 m1，加各藥品項(xiàng)下規(guī)定的指示液12滴，用高氯酸滴定液（0.1mol/L）滴定，并將滴定結(jié)果用空白試驗(yàn)校正,三）一般測定方法,取本品約 0.15g，精密稱定，加醋酐冰醋酸（51）的混合液 25ml，微熱使溶解，放冷，加結(jié)晶紫指示液 1滴，用高氯酸滴定液（0.1mo1/L）滴定，至溶液顯黃色，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每 1ml 高氯酸滴定液（0.1mol/L）相當(dāng)于 19.42mg 的C8H10N4O2,咖啡因 ChP(2000,四）生物堿鹽類的滴定,置換滴定,無機(jī)酸在冰醋酸中的酸性次序?yàn)?高氯酸氫溴酸鹽酸硫酸 硝酸其它弱酸 （磷酸、有機(jī)酸,由于有機(jī)酸系弱酸，被高氯

12、酸置換出的HA，對滴定無干擾，能準(zhǔn)確滴定,1. 有機(jī)酸鹽的測定,取本品約 60mg，精密稱定，加冰醋酸 20ml 溶解后，加結(jié)晶紫指示液 1滴，用高氯酸滴定液（0.05mo1/L）滴定，至溶液顯藍(lán)綠色，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每 1ml 高氯酸滴定液（0.05mol/L）相當(dāng)于 22.07mg 的C19H23N3O2 C4H4O4,馬來酸麥角新堿 ChP(2000,若被置換出的有機(jī)酸不溶于冰醋酸，應(yīng)先將樣品堿化，有機(jī)溶劑提取游離堿后，再非水堿量法測定,一般均預(yù)先在溶液中加入Hg(Ac)2 的冰醋酸溶液，以消除氫鹵酸對滴定的干擾,理論量13倍,2. 氫鹵酸鹽的測定,取本品約 0.15g，精

13、密稱定，加冰醋酸 10ml，加熱溶解后，加醋酸汞試液 4ml 與結(jié)晶紫指示液 1滴，用高氯酸滴定液（0.1mo1/L）滴定至溶液顯翠綠色，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每 1ml 高氯酸滴定液（0.1mol/L）相當(dāng)于 20.17mg 的C10H15NO HCl,鹽酸麻黃堿 ChP(2000,生物堿的硫酸鹽，在冰醋酸介質(zhì)中只能被滴定至生物堿的硫酸氫鹽,1）直接滴定,3. 硫酸鹽的測定,A. 硫酸阿托品 HClO4直接滴定時，反應(yīng)摩爾比為11,B. 硫酸奎寧 HClO4直接滴定時，反應(yīng)摩爾比為13,2）加入高氯酸鋇消除硫酸的干擾后滴定 硫酸奎寧 反應(yīng)摩爾比為12 硫酸阿托品 一元堿不能滴定,因H

14、NO3具有氧化性，可使指示劑變色，一般電位法指示終點(diǎn)。如硝酸士的寧、硝酸毛果蕓香堿,4. 硝酸鹽的測定,取本品約 0.3g，精密稱定，加冰醋酸 20ml，振搖使溶解，照電位滴定法（附錄 A），用高氯酸滴定液（0.1mo1/L）滴定，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每 1ml 高氯酸滴定液（0.1mol/L）相當(dāng)于39.74mg的C21H22N2O2 HNO3,硝酸士的寧 ChP(2000,按常法測定，如磷酸氯喹、磷酸可待因,5. 磷酸鹽的測定,簡便、快速、準(zhǔn)確、精密、取樣量小，測定的是生理活性部分。 如有酸性或堿性成分存在時會影響，選擇性差，不能直接用于制劑分析，只能用于原料藥測定,五）特點(diǎn),1

15、）一般是取一定量樣品在水浴上蒸干，在一定溫度下干燥后按原料藥物項(xiàng)下的方法進(jìn)行。主藥對熱穩(wěn)定,六）制劑分析,1. 注射劑,精密量取本品 10ml，置水浴上蒸干，在 105 干燥 1h，放冷，加冰醋酸 10ml，與醋酸汞試液 6ml 使溶解，加結(jié)晶紫指示液 1滴，用高氯酸滴定液（0.1mo1/L）滴定，至溶液顯綠色，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每 1ml 高氯酸滴定液（0.1mol/L）相當(dāng)于37.58mg 的C20H21NO4 HCl,鹽酸罌粟堿注射液 ChP（2000,2）堿化，經(jīng)有機(jī)溶劑反復(fù)提取完全，蒸去溶劑后，再按原料藥方法進(jìn)行。主藥對熱不穩(wěn)定,二鹽酸奎寧注射液 ChP（2000） 精密

16、量取本品適量（約相當(dāng)于二鹽酸奎寧 0.15g），置分液漏斗中，加水使成20ml，加氨試液使成堿性，用氯仿分次振搖提取，第一次 25ml，以后每次各 10ml,至奎寧提盡為止，每次得到的氯仿液均用同一份水洗滌 2 次，每次 5 ml，洗液用氯仿 10ml 振搖提取，合并氯仿液，置水浴上蒸去氯仿，加無水乙醇 2ml再蒸干，在 105 干燥 1h，放冷，加醋酐 5ml 與冰醋酸 10ml，溶解后，加結(jié)晶紫指示液 1滴，用高氯酸滴定液（0.1mo1/L）滴定，至溶液顯藍(lán)色，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每 1ml 高氯酸滴定液（0.1mol/L）相當(dāng)于19.87mg 的C20H24N2O2 2HCl,

17、片劑中許多賦形劑如硬脂酸鹽、苯甲酸鹽、羧甲基纖維素鈉等都消耗高氯酸，因此片劑的測定一般需提取分離并經(jīng)干燥后才可進(jìn)行,2. 片劑,如硫酸奎寧片、硫酸奎尼丁片 堿化、有機(jī)溶劑提取后，HClO4滴定時，反應(yīng)摩爾比為14,硫酸奎寧片 ChP（2000） 取本品 10 片，除去糖衣后，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量（約相當(dāng)于硫酸奎寧 0.3g），置分液漏斗中，加氯化鈉0.5g 與 0.1mol/L 氫氧化鈉溶液 10ml，混勻，精密加氯仿50ml，振搖10min，靜置，分取氯仿液，用干燥濾紙濾過,精密量取續(xù)濾液25ml，加醋酐5ml 與二甲基黃指示液2滴，用高氯酸滴定液（0.1mo1/L）滴定，至溶液顯玫

18、瑰紅色，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每1ml 高氯酸滴定液（0.1 mol/L）相當(dāng)于19.57mg的（C20H24N2O2）2 H2SO42H2O,二、提取中和法（提取酸堿滴定法、提取容量法,一）原理與方法,1. 堿化,2. 有機(jī)溶劑提取,3. 中和法測定,1）直接滴定法 用于堿性較強(qiáng)的生物堿,2）剩余滴定法 用于堿性較弱的生物堿,3）酸滴定液返提后剩余滴定法 用于對熱不穩(wěn)定的生物堿,1. 堿化試劑 最常用氨水 2. 提取溶劑 （1）提取溶劑選擇的原則 （2）常用的提取溶劑 最常用氯仿,二）測定條件的選擇,3）提取溶劑的用量及提取次數(shù) 通常應(yīng)提取4次，第一次用量至少應(yīng)為水液體積的一半，以后

19、幾次應(yīng)各為第一次的一半,3. 提取終點(diǎn)的確定 用合適的沉淀反應(yīng)確定,4. 指示劑的選擇,5. 乳化的預(yù)防和消除,儀器簡單、試劑常用，但操作繁瑣、費(fèi)時、精密度差、準(zhǔn)確度差，主要用于制劑分析,三）特點(diǎn),阿片粉中嗎啡的含量測定石灰法 ChP（1995,固相萃取離子對-反相高效液相色譜法 ChP（2000,四）應(yīng)用,五）提取重量法,一）基本原理 在適當(dāng)?shù)膒H介質(zhì)中,三、酸性染料比色法 制劑,1. 水相中反應(yīng),離子對BH+In-被有機(jī)溶劑提取，使有機(jī)相呈色。剩余的酸性染料留于水相,3. 比色法測定,2. 有機(jī)溶劑提取,1）定量分離出有機(jī)提取液，脫水后，測定A，求出有機(jī)堿含量,2）定量分離出有機(jī)提取液，脫

20、水后，堿化，則水相呈色，測定水相中In-的吸收度，間接求出有機(jī)堿的含量 BH+In- + OH- B + H2O + In,3）定量分離出有機(jī)提取液，脫水后，酸化，則水相呈色，測定水相中HIn的吸收度，間接求出有機(jī)堿的含量,BH+In- + H+ BH+ HIn,1. 水相的最適pH值 如果水相pH值過小，酸性染料幾乎仍以分子狀態(tài)存在；如果水相pH值過大，則生物堿幾乎全部以游離堿的形式存在,2. 有機(jī)溶劑的選擇 CHCl3、CH2Cl2,二）影響定量分析的因素,3. 酸性染料的選擇 常用溴甲酚綠、溴麝香草酚藍(lán)（BTB）等,5. 有色雜質(zhì)的排除,4. 水分的影響 嚴(yán)防水分的混入 有機(jī)層可加入無水

21、硫酸鈉等脫水劑或經(jīng)干燥濾紙濾過,6. 共存物的影響,3. 準(zhǔn)確度差，不能用于原料藥的測定，只能用于制劑分析,三）特點(diǎn),1. 選擇性高（選用適當(dāng)pH緩沖液可消除干擾,2. 靈敏度高、供試品用量少,硫酸阿托品注射液 ChP（2000,注射液 對照法,四）應(yīng)用,片劑 對照法,五、色譜法,一）高效液相色譜法,1反相 HPLC 分析生物堿類和有機(jī)含氮藥物的特點(diǎn) 色譜峰拖尾，保留時間過長，甚至長期地保留在色譜柱上,四、紫外可見分光光度法,1）加掃尾劑法 分離依據(jù)物質(zhì)的極性及溶解性。在流動相中加入掃尾劑，最常用的掃尾劑是三乙胺,2）用硅膠作固定相法 離子交換機(jī)理：根據(jù)pKa大小進(jìn)行分離,2解決方法,流動相要

22、選擇適宜的 pH 值、競爭離子的種類和濃度，同時要加入有機(jī)改性劑 適合于藥物與體內(nèi)代謝物的分析,3）用金剛烷基硅烷化硅膠作固定相法 分離依據(jù)物質(zhì)溶解性,不論是游離堿還是其鹽類，均是以游離堿出峰,二）氣相色譜法,97：83咖啡因和茶堿的特征鑒別反應(yīng)是 A. 雙縮脲反應(yīng) B. Vitali反應(yīng) C. Marquis反應(yīng) D. 紫脲酸銨反應(yīng) E. 綠奎寧反應(yīng),98：139鹽酸嗎啡中應(yīng)檢查的特殊雜質(zhì)為 A. 嗎啡 B. 阿樸嗎啡 C. 罌粟堿 D. 莨菪堿 E. 其它生物堿,96：136用非水溶液滴定法測定鹽酸嗎啡含量時，應(yīng)使用的試劑是 A. 5醋酸汞冰醋酸液 B. 鹽酸 C. 冰醋酸 D. 二甲基甲

23、酰胺 E. 高氯酸,97：130非水溶液滴定法測定硫酸奎寧含量的反應(yīng)條件為 A冰醋酸一醋酐為溶劑 B. 高氯酸滴定液（0.1mol/L）滴定 C1mol的高氯酸與mol的硫酸奎寧反應(yīng) D. 僅用電位法指示終點(diǎn) E溴酚藍(lán)為指示劑,99：78. 非水溶液滴定法測定硫酸奎寧原料的含量時，可以用高氯酸直接滴定冰醋酸介質(zhì)中的供試品，1摩爾硫酸奎寧需要消耗高氯酸的摩爾數(shù)為 A. 1 B. 2 C. 3 D. 4 E. 5,99x：116120滴定反應(yīng)中 A. 被測物與HClO4的摩爾比為11 B. 被測物與HClO4的摩爾比為13 C. 兩者均是 D. 兩者均不是 99x：116硫酸奎寧片經(jīng)氯仿提取后用HClO4滴定,D,99x：117硫酸阿托品在冰醋酸中用HClO4滴定 99x：118. 硫酸奎寧原料藥用HClO4滴定 99x：119. 磷酸可待因用HClO4滴定 99x：120. 硝酸士的寧用HClO4滴定,A,B,A,A,96：129. 生物堿類藥物制劑的測定方法 A. 直接用有機(jī)溶劑提取后，用H2SO4標(biāo)準(zhǔn)液滴定 B. 堿化后用有機(jī)溶劑提取，再用NaOH水溶