《染色體顯微操作》PPT課件

1、第六章 染色體顯微操作,染色體微分析技術(shù)包括：染色體顯微切割、分離；PCR體外擴增；微克隆技術(shù)，染色體或特異區(qū)擴增產(chǎn)物間的Southern雜交及特異DNA片段的FISH定位。該項技術(shù)是近十多年來隨分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展而誕生的一項生物高新技術(shù)，它既有細(xì)胞生物學(xué)的可視性，又有分子生物學(xué)的先進性，在染色體結(jié)構(gòu)、基因組和比較基因組學(xué)、基因克隆、物理圖譜構(gòu)建等方面具有廣泛的應(yīng)用前景,顯微切割技術(shù)是在顯微狀態(tài)或顯微鏡直視下通過顯微操作系統(tǒng)對欲選取的材料（組織,細(xì)胞群，細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)組分或染色體區(qū)帶等）進行切割分離并收集用于后續(xù)研究的技術(shù)。 顯微切割技術(shù)實際上屬于在微觀領(lǐng)域?qū)ρ芯坎牧系姆蛛x收集技術(shù)，因此應(yīng)用此技

2、術(shù)往往是許多要深入的研究工作中起始的重要一步,顯微切割的特點 一是“細(xì)微”，顯微切割的對象可以達(dá)到微米級，顯微切割的精度可以達(dá)到毫微米級，因此利用顯微切割技術(shù)可以分離收集到象核仁和染色體特異區(qū)帶這樣細(xì)微的對象； 二是“原位”，利用顯微切割技術(shù)是在組織細(xì)胞或染色體的原位取材，因此所取材料的定位清楚，所研究對象的歷史背景明確。 三是“同質(zhì)”，顯微切割技術(shù)可以保證所取材料一定層次上的同質(zhì)性。 四是“結(jié)合”，顯微切割技術(shù)可以與多種分子生物學(xué)、免疫學(xué)及病理學(xué)技術(shù)結(jié)合使用,顯微切割的結(jié)合技術(shù) 能與多種分子生物學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)及病理學(xué)技術(shù)結(jié)合應(yīng)用，使顯微切割技術(shù)顯示出蓬勃的生命力。 根據(jù)研究的需要可在顯微

3、切割前應(yīng)用組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)、原位雜交、原位末端標(biāo)記、原位PCR、FISH、組織特染等方法對需要切割的組織內(nèi)成分進行標(biāo)記。 顯微切割后獲得的材料可以用于提取蛋白質(zhì)、DNA和RNA等用于Western Blot、Southern Blot、Northern Blot、PCR等蛋白質(zhì)和核酸的相關(guān)分析,顯微切割的影響因素 最終結(jié)果的因素多種多樣。 在實驗過程中把握一個原則,即一切與顯微切割結(jié)合的技術(shù)中影響因素應(yīng)同時列為顯微切割實驗最終結(jié)果的影響因素，在實驗的過程中予以考慮。 與不同的方法結(jié)合決定了需要對顯微切割的材料進行不同的處理,染色體顯微切割技術(shù)出現(xiàn)于20世紀(jì)80年代。Scalenghe等（

4、1981）首次報道了應(yīng)用特殊玻璃針對果蠅唾液腺染色體進行切割、分離和顯微克隆。因為當(dāng)時尚沒有發(fā)明PCR技術(shù)，需分離數(shù)百條染色體才可獲得足夠數(shù)量的DNA。 PCR技術(shù)發(fā)明之后，Ldecke等（1989）將PCR技術(shù)應(yīng)用到染色體顯微切割和克隆中，僅用少量切割片段就獲得了足夠數(shù)量的DNA。 自1989年以來，染色體的顯微切割技術(shù)的研究成果主要是人類染色體區(qū)帶特異探針池的構(gòu)建，采用玻璃針法已相繼構(gòu)建了一系列人類染色體區(qū)帶探針池,時至今日，植物染色體分離技術(shù)也已經(jīng)發(fā)展成熟，并成為構(gòu)建染色體特異區(qū)段DNA探針池最為有效和直接的技術(shù)手段，例如，應(yīng)用顯微切割技術(shù)可以獲得長度為13Mb的DNA片段，相當(dāng)于水稻基

5、因組遺傳圖譜上13cM。 在理論上，遺傳標(biāo)記之間1cM的距離已連鎖非常緊密。因此，應(yīng)用染色體顯微切割和分離技術(shù)建立特定染色體區(qū)段的DNA文庫，已成為篩選與基因緊密連鎖的分子標(biāo)記和基因克隆的有效方法之一。 染色體顯微切割的方法主要有5種：流式細(xì)胞分類器法、微細(xì)玻璃針法（手工操作法）、激光切割法、玻璃針-激光法和激光捕獲微分離法。此外，目前開始嘗試使用微操作機器人系統(tǒng),1、激光切割法 此法與手工操作法的主要差別在于：用激光束代替玻璃針，將染色體標(biāo)本上不需要的片段剔除，然后將剩余染色體片段消化、擴增。Fukui等利用此法成功地切割了植物染色體片段，但是該方法對設(shè)備要求較高，激光切割區(qū)域?qū)NA分子也

6、有損傷,2、流式細(xì)胞分類器法： 流式細(xì)胞分類技術(shù)分析和分選染色體是分子生物學(xué)和遺傳學(xué)研究的一個非常有效的方法。 1983年至1986年，美國的兩個實驗室用流式細(xì)胞分類器和分子生物學(xué)技術(shù)建立了人類24種染色體特異性的基因文庫。也有學(xué)者利用此項技術(shù)分離了番茄第二號染色體,優(yōu)缺點 使實驗過程機械化，可用于處理大批染色體。 但結(jié)構(gòu)相似的染色體難以分開，使有些文庫中其它染色體污染率高達(dá)10-50%，不能構(gòu)建染色體區(qū)帶特異性文庫,3、玻璃針-激光法 由于激光顯微切割法需要價格昂貴的特殊培養(yǎng)皿，操作也較復(fù)雜。且氬離子激光熱效應(yīng)大，容易對切口附近的染色體DNA造成較大損傷。 玻璃針法較為成功，但難以對染色體進

7、行精確的定位切割。王槐等研究了一種由激光微束與玻璃針結(jié)合使用來切割分離植物染色體片段的方法,優(yōu)缺點 蓋玻片的存在減少了切割過程中外源DNA分子的污染，且為油鏡下更準(zhǔn)確地識別目的染色體和定位切割靶點創(chuàng)造條件，切割準(zhǔn)確； 因為用玻璃針分離切割后的染色體，所以用普通載玻片即可進行染色體制備，費用較低； 但仍需借助玻璃針的操作，易污染,4、激光捕獲微分離法 它是一種將紫外激光束切割與激光壓力彈射相結(jié)合的新方法，激光聚焦點直徑小于1um，是目前最為先進的技術(shù)，它使染色體顯微切割操作步驟大大簡化,將超薄膜用膠帶封固在干凈的載片上，紫外消毒，染色體制片。 用激光脈沖將靠近目標(biāo)染色體的不需要的遺傳材料選擇去除

8、。 圍繞目標(biāo)染色體，用激光脈沖切割薄膜，通過激光壓力彈射操作儀將切下的薄膜上的目標(biāo)染色體彈射到距載玻片小于1mm的收集裝置上，如果所需目標(biāo)染色體數(shù)目多且相同，則可收集到同一個收集裝置上,優(yōu)缺點 除具有激光微切割的優(yōu)點之外，還在一種環(huán)境中操作，避免了污染； 激光波長為337nm，遠(yuǎn)離DNA最大吸收波長260nm，無熱效應(yīng)產(chǎn)生，不會損壞材料；樣品可長時間保存。 但儀器及薄膜價格極為昂貴,PALM激光顯微切割系統(tǒng) 由德國PALM公司研發(fā)的一套高級精確的實驗室設(shè)備。利用337納米的紫外激光對顯微鏡下的生物樣本（組織，細(xì)胞簇，單細(xì)胞，染色體，染色體片斷等）進行切割和分離。在病理學(xué)，遺傳學(xué)，腫瘤學(xué)、植物學(xué)

9、等多個科研領(lǐng)域得到非常廣泛的應(yīng)用,PALM激光顯微切割系統(tǒng),PALM激光顯微切割系統(tǒng)操作界面,5、手工切割法：此法主要步驟包括： a、染色體制備，常規(guī)制備的中期染色體即可； b、染色體顯微切割，在倒置顯微鏡下配置顯微切割器 ，并將制備的硅化玻璃針安裝在切割器上，把染色體標(biāo)本置于載物臺上，在顯微鏡下找到待切割染色體標(biāo)本，操作玻璃針進行切割； c、切取染色體片段進行原位裂解和體外擴增,染色體微分析技術(shù)就是在對染色體顯微切割和分離的基礎(chǔ)上建立起來的。因此它的前提是必須對染色體能夠準(zhǔn)確地識別和精確切割與分離。國內(nèi)改進了當(dāng)前普遍應(yīng)用的倒置顯微鏡切割的方法，采用了普通透射光學(xué)顯微鏡，用100倍油浸物鏡在1

10、000-1500高倍數(shù)下，對染色體進行切割和分離，不但對染色體的個體能準(zhǔn)確地識別，而且可使切割的精確度達(dá)到0.3微米,改進的染色體微分析技術(shù),1.玻璃針的制備,玻璃針拉制器將玻璃管拉成合適粗細(xì)的玻璃針,利用彎針器將玻璃針彎成合適的彎度,2.染色體的微切與分離,全細(xì)胞染色體的分離 特定單條染色體的分離 染色體特定區(qū)的顯微切割,水稻基因組全細(xì)胞染色體的分離,A.分離前水稻細(xì)胞,箭頭所指為4號染色體 B.分離4號染色體后的細(xì)胞,A,特定單條染色體的顯微分離,A B 黑麥B-染色體(箭頭所指)的顯微分離 A. 分離前的核型(2n=14+2B) B. 分離出一條B-染色體后的核型,黑麥1R染色體的顯微分

11、離,染色體特定區(qū)的顯微切割,A. 顯微切割前的黑麥完整核型（箭頭所示為B染色體） B. 顯微切割后的核型（箭頭所示為切除端粒片段的位置,A,B,黑麥B染色體端粒區(qū)的顯微切割,黑麥B染色體著絲粒區(qū)域微切過程,微切前,微切后,微操作機器人系統(tǒng) 微操作系統(tǒng)作為MEMS（微機械電氣系統(tǒng)(Micro-Electro-Mechanical Systems）研究領(lǐng)域的一個重要分支受到各發(fā)達(dá)國家的高度重視，紛紛投入大量資金進行微操作機器人系統(tǒng)的研究，現(xiàn)已研制出多種各具特色的微操作機器人實驗樣機系統(tǒng),生物工程作為微操作機器人系統(tǒng)的主要應(yīng)用領(lǐng)域。把生物工程作為微操作機器人的應(yīng)用領(lǐng)域，目的可以解釋為2點：從應(yīng)用層面

12、說，目標(biāo)相當(dāng)明確地界定在“面向生物工程”上，如細(xì)胞操作、基因轉(zhuǎn)移、染色體切割等，希望給下一世紀(jì)中國的“綠色革命”帶來推動作用。從技術(shù)層面說，定位在基于顯微視覺全局閉環(huán)的計算機伺服自動協(xié)調(diào)作業(yè)上。長遠(yuǎn)觀之，其相關(guān)技術(shù)與微加工、微電子、顯微醫(yī)學(xué)等可觸類旁通,系統(tǒng)的具體運作方式： 活體細(xì)胞或染色體懸浮在培養(yǎng)液內(nèi)，左右微操作機器人對稱地安裝在顯微鏡機架上，毛細(xì)玻璃管與毛細(xì)玻璃針等操作工具作為機器人的末端執(zhí)行器(毛細(xì)玻璃管用于捕捉與固定細(xì)胞，毛細(xì)玻璃針用于細(xì)胞的切割、注射等,哈工大納米級微驅(qū)動及微操作機器人平臺,納米微操作機器人在1010微米的基片上刻出的字樣,3、擴增產(chǎn)物的原位雜交分析,利用熒光原位雜

13、交技術(shù)可直接將某個區(qū)段的DNA直接定位在染色體上，進行PCR產(chǎn)物的鑒定。同時還可以將某個區(qū)段DNA定位到相關(guān)的其它植物染色體上，進行染色體“一對一”的雜交和進行單條染色體之間的比較作圖研究,黑麥A、B染色體著絲粒區(qū)DNA同源性的熒光原位雜交分析,黑麥A、B染色體端粒區(qū)同源性的 熒光原位雜交分析,玉米B染色體特異片段熒光原位雜交結(jié)果 A為中期染色體，B為間期細(xì)胞核,B480在玉米中期和間期細(xì)胞(2n=20+4B)中的 原位雜交定位,B1320在玉米中期和間期細(xì)胞(2n=20+6B)中的 原位雜交定位,4、單條染色體AFLP分子標(biāo)記圖譜分析,單條染色體AFLP分子標(biāo)記圖譜分析，可以直接獲得任意一種植物特定染色體分子標(biāo)記圖譜，利用這些相同的DNA分子標(biāo)記，在相關(guān)的物種之間進行遺傳或物理作圖，比較這些標(biāo)記在不同物種基因組中的分布特點，揭示染色體或染色體片段上基因及排列順序的相同或相似性，并由此對相關(guān)物種的基因結(jié)構(gòu)和起源進行分析，為基因的克隆、基因組的