人類白細(xì)胞抗原,血小板抗原檢測技術(shù).ppt

1、人類白細(xì)胞抗原檢測技術(shù)，血小板抗原檢測技術(shù),輸血科 朱伯平,人類白細(xì)胞抗原,HLA(human leukocyte antigen） ，(人類白細(xì)胞抗原)系統(tǒng)是目前所知人體最復(fù)雜的多態(tài)系統(tǒng)。自1958年發(fā)現(xiàn)(Jean Dausset)第一個(gè)HLA抗原，到20世紀(jì)70年代，HLA便成為免疫、遺傳學(xué)、免疫生物學(xué)和生物化學(xué)等學(xué)科的一個(gè)重要新興研究領(lǐng)域,HLA功能,生物學(xué)功能：器官和骨髓移植前供、受者組織相容性配型 其他方面：親子鑒定以及人類遺傳學(xué)方面,首個(gè)艾滋病治愈病例出現(xiàn) 移植骨髓后獲抗體,2011年06月03日 ,對于醫(yī)生胡特而言，病人蒂莫西雷布朗就像漆黑抗艾研究道路上的一道亮光。這名被冠以“柏

2、林病人”的特殊病患同時(shí)兼有白血病和艾滋病。在醫(yī)學(xué)界看來，布朗已經(jīng)是即將踏入墳?zāi)沟娜?，然而在接受骨髓移植后，布朗竟然奇跡般得以重生。這一事件震驚了整個(gè)醫(yī)學(xué)界，醫(yī)生們從他的身上看到了醫(yī)學(xué)界的奇跡：終結(jié)艾滋,人類白細(xì)胞抗原(HLA,HLA抗原分布相當(dāng)廣泛，見于所有的有核細(xì)胞上，但在淋巴細(xì)胞上的密度最高 血小板上的HLA抗原是血小板膜表面的固有結(jié)構(gòu)成分，主要是HLA-I類的A、B位點(diǎn)的抗原,HLA-I類抗原是引起血小板同種免疫和血小板輸注無效的主要抗原，約占80,HLA抗原檢測技術(shù),人類白細(xì)胞抗原檢測技術(shù)已廣泛應(yīng)用于器官移植前的組織配型 檢測方法：血清學(xué)方法、細(xì)胞學(xué)方法和基因分型方法 與臨床輸血的關(guān)系

3、HLA抗原可引起免疫應(yīng)答HLA抗體發(fā)熱性非溶血性輸血反應(yīng)和血小板輸注無效,HLA血清學(xué)方法,血清學(xué)方法：是用一系列已知的抗HLA抗原的標(biāo)準(zhǔn)血清來檢測未知淋巴細(xì)胞表面的HLA抗原型別,微量淋巴毒實(shí)驗(yàn) 原理：淋巴細(xì)胞膜表面具有HLA抗原，而分型血清中含有抗特定HLA抗原的細(xì)胞毒抗體，該抗體與淋巴細(xì)胞膜上的相應(yīng)的HLA抗原結(jié)合后在補(bǔ)體的參與下?lián)p傷細(xì)胞膜，經(jīng)染料染色后，通過觀察細(xì)胞是否被染色來判斷待測細(xì)胞是否損傷或死亡，進(jìn)而判斷抗原、抗體反應(yīng)的強(qiáng)度,微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)記分,抗血清的來源和標(biāo)準(zhǔn),通過妊娠、輸血和同種器官移植等免疫作用產(chǎn)生HLA同種抗體 使用純化的HLA抗原免疫動(dòng)物，可產(chǎn)生HLA異種抗體

4、使用雜交瘤技術(shù)，可獲得單克隆抗體 少數(shù)存在的天然抗體,質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),1.血清特異性程度（FP3%，F(xiàn)N14%） 2.血清的強(qiáng)度，采用強(qiáng)度指數(shù)SI表示，SI70,HLA細(xì)胞學(xué)方法,純合細(xì)胞分型方法 預(yù)致敏淋巴細(xì)胞試驗(yàn) 混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng),純合細(xì)胞分型方法,該方法的原理為帶有A/A純合抗原的細(xì)胞（HTC）作為刺激細(xì)胞，帶有未知抗原X/X的檢測細(xì)胞作為應(yīng)答細(xì)胞，在兩種細(xì)胞組成的單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)（MLC）中，如果發(fā)生刺激反應(yīng)，表明受檢細(xì)胞能夠識別A抗原當(dāng)成外來抗原，所以受檢細(xì)胞不具有A抗原，反之受檢細(xì)胞可能是A抗原的 雜合子或純合子,預(yù)致敏淋巴細(xì)胞試驗(yàn),在應(yīng)答細(xì)胞A與刺激細(xì)胞B的初次混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)

5、反應(yīng)(MLC)中，經(jīng)過9-12天培養(yǎng)，應(yīng)答細(xì)胞A增生為淋巴細(xì)胞后變成小淋巴細(xì)胞，即為預(yù)致敏淋巴細(xì)胞（PL,混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng),兩個(gè)無關(guān)個(gè)體的淋巴細(xì)胞，在體外適當(dāng)?shù)?環(huán)境下混合培養(yǎng)后可以互相激發(fā)，使細(xì)胞活化并向母細(xì)胞轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生分裂增生現(xiàn)象，即為混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)方法（MLC）。 現(xiàn)MLC主要用于實(shí)體器官移植前的快速相容性檢測。分雙向MLC和單向MLC,HLA基因分型方法,PCR限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP） 序列特異性引物PCR（PCR-SSP） PCR序列特異性寡核苷酸探針分型技術(shù)（PCR-SSO） PCR單核苷酸序列分析（PCR-SBT） 基因芯片 流式細(xì)胞術(shù),粒細(xì)胞抗原、抗體檢測,血

6、清學(xué)方法 粒細(xì)胞凝集試驗(yàn)（GAT） 粒細(xì)胞免疫瑩光試驗(yàn)（GIFT） 單克隆抗體特異性粒細(xì)胞抗原捕獲試驗(yàn)（MAIGA） ELISA方法 流式細(xì)胞術(shù),基因分型技術(shù),主要方法為PCR-RFLPPCR-SSP PCR-SSO等 1、PCR序列特異性引物 2、PCR限制性片段長度多態(tài)性,血小板血型抗原,血小板血型抗原主要有兩大類： 血小板相關(guān)抗原 血小板特異性抗原,血小板相關(guān)抗原：血小板表面存在的與其他細(xì)胞或組織共有的抗原 血小板特異性抗原（HPA）：通常將血小板表面由血小板特有的抗原決定簇組成，表現(xiàn)出血小板特有的遺傳多態(tài)性，并且不存在于其他細(xì)胞和組織上的抗原,血小板相關(guān)抗原,1、紅細(xì)胞血型抗原：血小板

7、上的ABH抗原物質(zhì)，包括機(jī)體所產(chǎn)生的以及由血漿中黏附在血小板表面的兩類抗原構(gòu)成。 2、HLA系統(tǒng)血型抗原：血小板表面主要存在HLA-類抗原，如HLA-A、HLA-B、HLA-C位點(diǎn)等,血小板特異性抗原,血小板特異性抗原(HPA)是由血小板特有的抗原決定簇組成，表現(xiàn)出血小板獨(dú)特的遺傳多態(tài)性，不存在于其它細(xì)胞和組織中 ，目前已發(fā)現(xiàn)的血小板特異性抗原已有8個(gè)系統(tǒng)16個(gè)抗原 國際命名原則是： 在系統(tǒng)前冠以HPA，即人類血小板抗原的英文縮寫。各抗原系統(tǒng)以公布日期的順序編號。對偶抗原按人群中頻率由高至 低用字母命名 (例如HPA-1a,HPA-2b,血小板特異性抗原,在白種人中HPA-1b表現(xiàn)頻率是26.

8、5%，是引起白種人血小板輸注無效發(fā)生的主要血小板特異抗原 在亞洲人中 HPA2b抗原頻率約為 26，是引起亞洲人血小板輸注無效發(fā)生的主要血小板特異抗原,血小板血型的臨床應(yīng)用,一、血小板輸注無效 定義：血小板輸注無效-指患者輸注一定量的血小板后其增加值明顯低于預(yù)期值,血小板輸注無效是由于患者反復(fù)輸注血小板而產(chǎn)生了血小板同種抗體，導(dǎo)致再次輸入血小板時(shí)，發(fā)生免疫反應(yīng)。 主要是由血小板HLA抗原（HLA-A，-B，-C）以及少數(shù)HPA抗原引起的,HLA抗體在所有病人中達(dá)到50%-90%，同時(shí)，也有17%-25%的HPA抗體出現(xiàn)，縮短輸注血小板的壽命。 在黃種人中，HPA-2b是引起血小板輸注無效的主要

9、原因之一。治療方法：輸注配合的濃縮血小板,觀察血小板效果的指標(biāo),校正血小板計(jì)數(shù)增加值 （Corrected Count Increment, CCI,計(jì)算公式,CCI=（輸注后血小板計(jì)數(shù)-輸注前血小板計(jì)數(shù)）體表面積/輸注血小板總數(shù)1011,診斷標(biāo)準(zhǔn),輸注血小板后1小時(shí)CCI低于10109/L或24小時(shí)CCI低于7.5109/L,引起血小板輸注無效的原因,非免疫學(xué)原因 免疫學(xué)原因,非免疫學(xué)原因,脾功能亢進(jìn) 感染 發(fā)熱 藥物作用 DIC 血小板的質(zhì)量問題,免疫學(xué)原因,人類白細(xì)胞抗原(HLA) 血小板特異性抗原(HPA) 如檢測到患者血清中含有HLA抗體或HPA抗體,即可判斷病人的無效輸注是由于同種

10、免疫引起 的 今后避免輸入相應(yīng)的抗原,其他臨床應(yīng)用,二、輸血后紫癜 多發(fā)生在女性，有輸血和妊娠史 三、新生兒同種免疫性血小板減少性紫癜 與新生兒溶血病的發(fā)病機(jī)制相似 四、特發(fā)性血小板性紫癜,血小板血型檢測技術(shù),血小板血型（包括血小板抗原及對應(yīng)抗體），在臨床醫(yī)學(xué)和輸血實(shí)踐中具有重要意義，利用可能的方法檢測血小板抗體，可以提高血小板輸注的安全性和有效性,血清學(xué)檢測,血小板免疫熒光試驗(yàn)（PIFT）：既可用于血小板抗原鑒定，又可以用于血小板抗體檢測和交叉試驗(yàn) 1、血小板抗原鑒定：待測血小板用于聚甲醛（PFA）或氯喹預(yù)處理，處理過的血小板 與已知的特異性抗血清孵育，洗滌，再與標(biāo)記了異硫氰酸熒光素的抗人球

11、蛋白孵育，再次洗滌并在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察,血小板抗體檢測和交叉試驗(yàn),利用已知抗原特異性的血小板細(xì)胞譜與待檢血清混合反應(yīng)，其余步驟與血小板抗原鑒定類似，最后根據(jù)血清血小板細(xì)胞譜的反應(yīng)情況，來鑒定血清中抗體的特異性,PIFT的優(yōu)點(diǎn),因?yàn)樵陲@微鏡下只觀察熒光標(biāo)記的血小板，所以可以避免由于細(xì)胞碎片等引起的非特異性反應(yīng)。 多特異性的抗球蛋白可以識別,流式細(xì)胞術(shù),流式細(xì)胞術(shù)(FCM)1986年,Rosenfeld等發(fā)明了此技術(shù)。該法將待測血清和熒光標(biāo)記的已知型別的血小板抗體孵育后，用流式細(xì)胞儀檢測。FCM用于免疫性血小板減少癥患者的血小板相關(guān)抗體及血小板膜糖蛋白檢測,具有靈敏、快速、簡便的特點(diǎn),是適用于

12、臨床診斷的新方法,單克隆抗體免疫固定血小板抗原方法（MAIPA）：該法先制備羊抗鼠IgG包被的多孔板，另外，將鼠抗人血小板糖蛋白單克隆抗體和帶有抗體的血小板共同孵育，再將孵育后的復(fù)合物加入多孔板，孵育，洗滌，最后加入酶聯(lián)羊抗人抗體和酶反應(yīng)底物后顯色，定量測定血小板抗體,特點(diǎn),此方法敏感度高、特異性強(qiáng)，即使是血小板上抗原數(shù)量很少的HPA-5抗原，也能檢測出。MAIPA方法可靈敏地檢測血小板特異性抗體,簡易致敏紅細(xì)胞血小板血清學(xué)試驗(yàn)（SEPSA）：該法以抗人IgG抗體致敏紅細(xì)胞為指示細(xì)胞，直接指示固相血小板抗原抗體免疫反應(yīng)，檢測血小板抗體。若血小板上存在抗體，則指示細(xì)胞呈擴(kuò)散分布，為陽性；若無抗體

13、，則指示細(xì)胞聚集在底部，呈扣狀，為陰性,特點(diǎn),該方法操作簡單，微量，重復(fù)性、特異性和敏感性均較理想，固相化的血小板及抗IgG指示細(xì)胞能長久保存?zhèn)溆?，可開展大量樣本的檢測工作,基因分型方法,1.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)序列特異引物分型技術(shù)（PCR-SSP）的原理： 設(shè)計(jì)特異性引物，利用引物3端的特異性，直接擴(kuò)增相應(yīng)的HPA片段，PCR產(chǎn)物凝膠電泳以后，以紫外線透射來檢測，DNA條帶的存在或缺失即可確定基因型,特點(diǎn),SSP-PCR操作比較簡單，耗時(shí)較少，適合小批量標(biāo)本，是目前HPA基因定型中最常用的一種技術(shù),2.實(shí)時(shí)定量PCR,實(shí)時(shí)定量PCR原理：在PCR指數(shù)擴(kuò)增期間，利用連續(xù)監(jiān)測熒光信號的強(qiáng)弱來即時(shí)測定特

14、異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量。這一方法成功運(yùn)用于HPA-1、-2和-3基因定型,特點(diǎn),它廣泛應(yīng)用于定量檢測mRAN表達(dá)水平，其特點(diǎn)是易操作、高通量、敏感性高和特異性強(qiáng),基因芯片技術(shù)（DNAmicroarray,基因芯片技術(shù)利用正向雜交的方法，制成針對HPA基因SNP位點(diǎn)的DNA芯片；用熒光標(biāo)記的HPA型特異性探針分別與芯片進(jìn)行雜交，用軟件分析樣品的雜交結(jié)果，從而確定樣品的HPA基因型。此技術(shù)特點(diǎn)是一次性可同時(shí)檢測大量樣品，快速，準(zhǔn)確,限制性片段長度多態(tài)性分析（PCR-RFLP,原理是：限制性內(nèi)切酶能夠識別DNA序列上的特異性位點(diǎn)，并切割產(chǎn)生一定長度的DNA片段。相關(guān)基因片斷用含SN

15、P區(qū)域的引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用一種限制性酶進(jìn)行降解，酶解的PCR產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳，最后在紫外線下進(jìn)行DNA片斷的帶型分析,該法特點(diǎn)是RFLP是利用限制性內(nèi)切酶酶解相應(yīng)位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物，不需探針雜交，但被測的HPA基因需有合適的限制性酶切位點(diǎn),聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等位基因（序列）特異性寡核苷酸雜交,PCR-ASO）：用PCR擴(kuò)增SNP的基因序列，擴(kuò)增產(chǎn)物連接到尼龍膜支持物上，再與標(biāo)記的等位基因特異性的指示物-寡核苷酸探針雜交,該方法特點(diǎn)是以雜交為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)，但需嚴(yán)格控制雜交條件和設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)對照避免假陽性和假陰性,同源雙鏈優(yōu)先形成試驗(yàn)（PCR-PHFA,原理：雙標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物（標(biāo)準(zhǔn)雙鏈D

16、NA，它的兩條鏈分別被生物素和鄰苯二甲酸二壬酯(dinonylphthalate,DNP)標(biāo)記與未標(biāo)記的待測DNA雙鏈之間雜交時(shí)的競爭該,方法特點(diǎn)：不需要電泳，可用軟件進(jìn)行結(jié)果判讀,血小板抗原同種免疫的反應(yīng)機(jī)制,HPA可誘導(dǎo)受血者體內(nèi)產(chǎn)生一系列同種免疫反應(yīng)。通常有兩種反應(yīng)途徑：直接途徑和間接途徑,直接途徑,受血者CD4+T細(xì)胞上的T細(xì)胞受體直接與外源HPA同種抗原決定簇反應(yīng)。供體抗原呈遞細(xì)胞表面的MHC類分子呈遞外源HPA同種抗原決定簇,間接途徑,外源HPA同種抗原決定簇被受體抗原呈遞細(xì)胞加工后，受體CD4+T細(xì)胞上的T細(xì)胞受體識別受體自身的抗原呈遞細(xì)胞表面MHC類分子呈遞的外源HPA同種抗原決定簇,在這兩種途徑中，CD4+T細(xì)胞活化需要充分的共刺激因子。CD4+T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，如白介素-2和干擾素家族，可刺激初始B細(xì)胞發(fā)育為分泌抗體的漿細(xì)胞。直接識別途徑是一個(gè)強(qiáng)而快的反應(yīng)，它可激起整個(gè)TCR受體庫中5%的受體。間接