人類白細胞抗原,血小板抗原檢測技術.ppt

1、人類白細胞抗原檢測技術，血小板抗原檢測技術,輸血科 朱伯平,人類白細胞抗原,HLA(human leukocyte antigen） ，(人類白細胞抗原)系統(tǒng)是目前所知人體最復雜的多態(tài)系統(tǒng)。自1958年發(fā)現(xiàn)(Jean Dausset)第一個HLA抗原，到20世紀70年代，HLA便成為免疫、遺傳學、免疫生物學和生物化學等學科的一個重要新興研究領域,HLA功能,生物學功能：器官和骨髓移植前供、受者組織相容性配型 其他方面：親子鑒定以及人類遺傳學方面,首個艾滋病治愈病例出現(xiàn) 移植骨髓后獲抗體,2011年06月03日 ,對于醫(yī)生胡特而言，病人蒂莫西雷布朗就像漆黑抗艾研究道路上的一道亮光。這名被冠以“柏

2、林病人”的特殊病患同時兼有白血病和艾滋病。在醫(yī)學界看來，布朗已經(jīng)是即將踏入墳墓的人，然而在接受骨髓移植后，布朗竟然奇跡般得以重生。這一事件震驚了整個醫(yī)學界，醫(yī)生們從他的身上看到了醫(yī)學界的奇跡：終結(jié)艾滋,人類白細胞抗原(HLA,HLA抗原分布相當廣泛，見于所有的有核細胞上，但在淋巴細胞上的密度最高 血小板上的HLA抗原是血小板膜表面的固有結(jié)構(gòu)成分，主要是HLA-I類的A、B位點的抗原,HLA-I類抗原是引起血小板同種免疫和血小板輸注無效的主要抗原，約占80,HLA抗原檢測技術,人類白細胞抗原檢測技術已廣泛應用于器官移植前的組織配型 檢測方法：血清學方法、細胞學方法和基因分型方法 與臨床輸血的關系

3、HLA抗原可引起免疫應答HLA抗體發(fā)熱性非溶血性輸血反應和血小板輸注無效,HLA血清學方法,血清學方法：是用一系列已知的抗HLA抗原的標準血清來檢測未知淋巴細胞表面的HLA抗原型別,微量淋巴毒實驗 原理：淋巴細胞膜表面具有HLA抗原，而分型血清中含有抗特定HLA抗原的細胞毒抗體，該抗體與淋巴細胞膜上的相應的HLA抗原結(jié)合后在補體的參與下?lián)p傷細胞膜，經(jīng)染料染色后，通過觀察細胞是否被染色來判斷待測細胞是否損傷或死亡，進而判斷抗原、抗體反應的強度,微量淋巴細胞毒試驗記分,抗血清的來源和標準,通過妊娠、輸血和同種器官移植等免疫作用產(chǎn)生HLA同種抗體 使用純化的HLA抗原免疫動物，可產(chǎn)生HLA異種抗體

4、使用雜交瘤技術，可獲得單克隆抗體 少數(shù)存在的天然抗體,質(zhì)量標準,1.血清特異性程度（FP3%，F(xiàn)N14%） 2.血清的強度，采用強度指數(shù)SI表示，SI70,HLA細胞學方法,純合細胞分型方法 預致敏淋巴細胞試驗 混合淋巴細胞培養(yǎng),純合細胞分型方法,該方法的原理為帶有A/A純合抗原的細胞（HTC）作為刺激細胞，帶有未知抗原X/X的檢測細胞作為應答細胞，在兩種細胞組成的單向混合淋巴細胞培養(yǎng)反應（MLC）中，如果發(fā)生刺激反應，表明受檢細胞能夠識別A抗原當成外來抗原，所以受檢細胞不具有A抗原，反之受檢細胞可能是A抗原的 雜合子或純合子,預致敏淋巴細胞試驗,在應答細胞A與刺激細胞B的初次混合淋巴細胞培養(yǎng)

5、反應(MLC)中，經(jīng)過9-12天培養(yǎng)，應答細胞A增生為淋巴細胞后變成小淋巴細胞，即為預致敏淋巴細胞（PL,混合淋巴細胞培養(yǎng),兩個無關個體的淋巴細胞，在體外適當?shù)?環(huán)境下混合培養(yǎng)后可以互相激發(fā)，使細胞活化并向母細胞轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生分裂增生現(xiàn)象，即為混合淋巴細胞培養(yǎng)方法（MLC）。 現(xiàn)MLC主要用于實體器官移植前的快速相容性檢測。分雙向MLC和單向MLC,HLA基因分型方法,PCR限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP） 序列特異性引物PCR（PCR-SSP） PCR序列特異性寡核苷酸探針分型技術（PCR-SSO） PCR單核苷酸序列分析（PCR-SBT） 基因芯片 流式細胞術,粒細胞抗原、抗體檢測,血

6、清學方法 粒細胞凝集試驗（GAT） 粒細胞免疫瑩光試驗（GIFT） 單克隆抗體特異性粒細胞抗原捕獲試驗（MAIGA） ELISA方法 流式細胞術,基因分型技術,主要方法為PCR-RFLPPCR-SSP PCR-SSO等 1、PCR序列特異性引物 2、PCR限制性片段長度多態(tài)性,血小板血型抗原,血小板血型抗原主要有兩大類： 血小板相關抗原 血小板特異性抗原,血小板相關抗原：血小板表面存在的與其他細胞或組織共有的抗原 血小板特異性抗原（HPA）：通常將血小板表面由血小板特有的抗原決定簇組成，表現(xiàn)出血小板特有的遺傳多態(tài)性，并且不存在于其他細胞和組織上的抗原,血小板相關抗原,1、紅細胞血型抗原：血小板

7、上的ABH抗原物質(zhì)，包括機體所產(chǎn)生的以及由血漿中黏附在血小板表面的兩類抗原構(gòu)成。 2、HLA系統(tǒng)血型抗原：血小板表面主要存在HLA-類抗原，如HLA-A、HLA-B、HLA-C位點等,血小板特異性抗原,血小板特異性抗原(HPA)是由血小板特有的抗原決定簇組成，表現(xiàn)出血小板獨特的遺傳多態(tài)性，不存在于其它細胞和組織中 ，目前已發(fā)現(xiàn)的血小板特異性抗原已有8個系統(tǒng)16個抗原 國際命名原則是： 在系統(tǒng)前冠以HPA，即人類血小板抗原的英文縮寫。各抗原系統(tǒng)以公布日期的順序編號。對偶抗原按人群中頻率由高至 低用字母命名 (例如HPA-1a,HPA-2b,血小板特異性抗原,在白種人中HPA-1b表現(xiàn)頻率是26.

8、5%，是引起白種人血小板輸注無效發(fā)生的主要血小板特異抗原 在亞洲人中 HPA2b抗原頻率約為 26，是引起亞洲人血小板輸注無效發(fā)生的主要血小板特異抗原,血小板血型的臨床應用,一、血小板輸注無效 定義：血小板輸注無效-指患者輸注一定量的血小板后其增加值明顯低于預期值,血小板輸注無效是由于患者反復輸注血小板而產(chǎn)生了血小板同種抗體，導致再次輸入血小板時，發(fā)生免疫反應。 主要是由血小板HLA抗原（HLA-A，-B，-C）以及少數(shù)HPA抗原引起的,HLA抗體在所有病人中達到50%-90%，同時，也有17%-25%的HPA抗體出現(xiàn)，縮短輸注血小板的壽命。 在黃種人中，HPA-2b是引起血小板輸注無效的主要

9、原因之一。治療方法：輸注配合的濃縮血小板,觀察血小板效果的指標,校正血小板計數(shù)增加值 （Corrected Count Increment, CCI,計算公式,CCI=（輸注后血小板計數(shù)-輸注前血小板計數(shù)）體表面積/輸注血小板總數(shù)1011,診斷標準,輸注血小板后1小時CCI低于10109/L或24小時CCI低于7.5109/L,引起血小板輸注無效的原因,非免疫學原因 免疫學原因,非免疫學原因,脾功能亢進 感染 發(fā)熱 藥物作用 DIC 血小板的質(zhì)量問題,免疫學原因,人類白細胞抗原(HLA) 血小板特異性抗原(HPA) 如檢測到患者血清中含有HLA抗體或HPA抗體,即可判斷病人的無效輸注是由于同種

10、免疫引起 的 今后避免輸入相應的抗原,其他臨床應用,二、輸血后紫癜 多發(fā)生在女性，有輸血和妊娠史 三、新生兒同種免疫性血小板減少性紫癜 與新生兒溶血病的發(fā)病機制相似 四、特發(fā)性血小板性紫癜,血小板血型檢測技術,血小板血型（包括血小板抗原及對應抗體），在臨床醫(yī)學和輸血實踐中具有重要意義，利用可能的方法檢測血小板抗體，可以提高血小板輸注的安全性和有效性,血清學檢測,血小板免疫熒光試驗（PIFT）：既可用于血小板抗原鑒定，又可以用于血小板抗體檢測和交叉試驗 1、血小板抗原鑒定：待測血小板用于聚甲醛（PFA）或氯喹預處理，處理過的血小板 與已知的特異性抗血清孵育，洗滌，再與標記了異硫氰酸熒光素的抗人球

11、蛋白孵育，再次洗滌并在熒光顯微鏡下進行觀察,血小板抗體檢測和交叉試驗,利用已知抗原特異性的血小板細胞譜與待檢血清混合反應，其余步驟與血小板抗原鑒定類似，最后根據(jù)血清血小板細胞譜的反應情況，來鑒定血清中抗體的特異性,PIFT的優(yōu)點,因為在顯微鏡下只觀察熒光標記的血小板，所以可以避免由于細胞碎片等引起的非特異性反應。 多特異性的抗球蛋白可以識別,流式細胞術,流式細胞術(FCM)1986年,Rosenfeld等發(fā)明了此技術。該法將待測血清和熒光標記的已知型別的血小板抗體孵育后，用流式細胞儀檢測。FCM用于免疫性血小板減少癥患者的血小板相關抗體及血小板膜糖蛋白檢測,具有靈敏、快速、簡便的特點,是適用于

12、臨床診斷的新方法,單克隆抗體免疫固定血小板抗原方法（MAIPA）：該法先制備羊抗鼠IgG包被的多孔板，另外，將鼠抗人血小板糖蛋白單克隆抗體和帶有抗體的血小板共同孵育，再將孵育后的復合物加入多孔板，孵育，洗滌，最后加入酶聯(lián)羊抗人抗體和酶反應底物后顯色，定量測定血小板抗體,特點,此方法敏感度高、特異性強，即使是血小板上抗原數(shù)量很少的HPA-5抗原，也能檢測出。MAIPA方法可靈敏地檢測血小板特異性抗體,簡易致敏紅細胞血小板血清學試驗（SEPSA）：該法以抗人IgG抗體致敏紅細胞為指示細胞，直接指示固相血小板抗原抗體免疫反應，檢測血小板抗體。若血小板上存在抗體，則指示細胞呈擴散分布，為陽性；若無抗體

13、，則指示細胞聚集在底部，呈扣狀，為陰性,特點,該方法操作簡單，微量，重復性、特異性和敏感性均較理想，固相化的血小板及抗IgG指示細胞能長久保存?zhèn)溆?，可開展大量樣本的檢測工作,基因分型方法,1.聚合酶鏈式反應序列特異引物分型技術（PCR-SSP）的原理： 設計特異性引物，利用引物3端的特異性，直接擴增相應的HPA片段，PCR產(chǎn)物凝膠電泳以后，以紫外線透射來檢測，DNA條帶的存在或缺失即可確定基因型,特點,SSP-PCR操作比較簡單，耗時較少，適合小批量標本，是目前HPA基因定型中最常用的一種技術,2.實時定量PCR,實時定量PCR原理：在PCR指數(shù)擴增期間，利用連續(xù)監(jiān)測熒光信號的強弱來即時測定特

14、異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量。這一方法成功運用于HPA-1、-2和-3基因定型,特點,它廣泛應用于定量檢測mRAN表達水平，其特點是易操作、高通量、敏感性高和特異性強,基因芯片技術（DNAmicroarray,基因芯片技術利用正向雜交的方法，制成針對HPA基因SNP位點的DNA芯片；用熒光標記的HPA型特異性探針分別與芯片進行雜交，用軟件分析樣品的雜交結(jié)果，從而確定樣品的HPA基因型。此技術特點是一次性可同時檢測大量樣品，快速，準確,限制性片段長度多態(tài)性分析（PCR-RFLP,原理是：限制性內(nèi)切酶能夠識別DNA序列上的特異性位點，并切割產(chǎn)生一定長度的DNA片段。相關基因片斷用含SN

15、P區(qū)域的引物進行擴增，擴增產(chǎn)物用一種限制性酶進行降解，酶解的PCR產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳，最后在紫外線下進行DNA片斷的帶型分析,該法特點是RFLP是利用限制性內(nèi)切酶酶解相應位點擴增產(chǎn)物，不需探針雜交，但被測的HPA基因需有合適的限制性酶切位點,聚合酶鏈式反應等位基因（序列）特異性寡核苷酸雜交,PCR-ASO）：用PCR擴增SNP的基因序列，擴增產(chǎn)物連接到尼龍膜支持物上，再與標記的等位基因特異性的指示物-寡核苷酸探針雜交,該方法特點是以雜交為基礎的檢測技術，但需嚴格控制雜交條件和設置標準對照避免假陽性和假陰性,同源雙鏈優(yōu)先形成試驗（PCR-PHFA,原理：雙標記擴增產(chǎn)物（標準雙鏈D

16、NA，它的兩條鏈分別被生物素和鄰苯二甲酸二壬酯(dinonylphthalate,DNP)標記與未標記的待測DNA雙鏈之間雜交時的競爭該,方法特點：不需要電泳，可用軟件進行結(jié)果判讀,血小板抗原同種免疫的反應機制,HPA可誘導受血者體內(nèi)產(chǎn)生一系列同種免疫反應。通常有兩種反應途徑：直接途徑和間接途徑,直接途徑,受血者CD4+T細胞上的T細胞受體直接與外源HPA同種抗原決定簇反應。供體抗原呈遞細胞表面的MHC類分子呈遞外源HPA同種抗原決定簇,間接途徑,外源HPA同種抗原決定簇被受體抗原呈遞細胞加工后，受體CD4+T細胞上的T細胞受體識別受體自身的抗原呈遞細胞表面MHC類分子呈遞的外源HPA同種抗原決定簇,在這兩種途徑中，CD4+T細胞活化需要充分的共刺激因子。CD4+T細胞分泌的細胞因子，如白介素-2和干擾素家族，可刺激初始B細胞發(fā)育為分泌抗體的漿細胞。直接識別途徑是一個強而快的反應，它可激起整個TCR受體庫中5%的受體。間接