基因工程復(fù)習(xí)題

1、123、名詞基因工程：按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)密的設(shè)計(jì)，通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)有目的地 改造生物種性， 使現(xiàn)有的物種在較短的時間內(nèi)趨于完善， 創(chuàng)造出更符合人們需求的新生物類 型。基因工程工具酶： 指體外進(jìn)行DNA合成、切割、修飾和連接等系列過程中所需要的酶，包括 DNA聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶、修飾酶和連接酶等?；蚬こ趟幬铮褐饕富蚬こ袒钚远嚯摹⒒蚬こ桃呙绾?DNA藥物等。45Tm DNA達(dá)至U 50%變性的溫度。復(fù)性：高溫變性的DNA被逐漸冷卻時，分開的兩條鏈又會重新結(jié)合成雙鏈DNA678雜交：復(fù)制起始位點(diǎn)：每一種生物DNA的復(fù)制總是從特定的位點(diǎn)開始，這個位點(diǎn)具有一定的核苷酸

2、序列，這個序列就叫復(fù)制起始位點(diǎn)。復(fù)制子：從復(fù)制起始位點(diǎn)開始復(fù)制出一個DNA分子或一個DNA片段的核苷酸序列稱為復(fù)制子。9啟動子：是一段提供RNA聚合酶識別和結(jié)合的 DNA序列，它位于基因的上游。10SD序列：在原核生物結(jié)構(gòu)基因的起錄點(diǎn)下游不遠(yuǎn)處， 總有一個5 -AGGAGG-3的序列，轉(zhuǎn) 錄出mRNAt的5 -AGGAGG-3序列，與核糖體30s亞基16SrRNA3端的5-CCUCCU-3互補(bǔ)， 成為30S亞基識別和結(jié)合 mRNA勺位點(diǎn)。這個序列就叫 SD序列。基因編碼區(qū)：轉(zhuǎn)錄mRNAh起始密碼AUG至休止密碼UAG或UAA UGA的各種遺傳密碼的核11 苷酸序列。1213141516轉(zhuǎn)錄終止

3、子： 在基因編碼區(qū)下游有一段使轉(zhuǎn)錄終止的核苷酸序列。限制性核酸內(nèi)切酶：是 一類能識別雙鏈 DNA中特殊核苷酸序列，并使每一條鏈的一個磷酸 二酯鍵斷開的內(nèi)脫氧核糖核酸酶。稀切酶：那些長的識別序列和富 GC或富AT的識別序列在 DNA分子中出現(xiàn)的概率很低，所 以把這些識別序列相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶稱稀切酶。同裂酶： 有一些限制性核酸內(nèi)切酶雖然來源不同，但是具有相同的識別序列。這樣的限制 性核酸內(nèi)切酶成為同裂酶。粘性末端： 兩條多聚核苷酸鏈上磷酸二酯鍵斷開的位置是交錯的，對稱得分布在識別序列 中心位置的兩側(cè)。這樣的切割的結(jié)果， 使DNA片段末端的一條鏈多出一至幾個核苷酸， 具有互補(bǔ)核苷酸的另一 DN

4、A片段末端可以連接，這樣的DNA片段末端叫做粘性末端。同時17181920平末端： 兩條多聚核苷酸鏈上磷酸二酯鍵斷開的位置處在識別序列的對稱結(jié)構(gòu)中心。這樣 的切割的結(jié)果產(chǎn)生的 DNA片段末端是齊平的。同尾酶： 有些限制性核酸內(nèi)切酶雖然識別序列不同，但是切割 有相同的黏性末端，稱這樣的一組限制性核酸內(nèi)切酶為同尾酶。Star 活性： 有些限制性核酸內(nèi)切酶在特定條件下可以在不是原來的識別序列處切割 種現(xiàn)象稱為STAR活性。部分酶切：選用的限制性核酸內(nèi)切酶對其在DNA分子上全部識別序列進(jìn)行不完全的切割。DNA分子所得的DNA片段具DNA這21限制性圖譜：當(dāng)一種DNA分子的核苷酸序列被全部測定后，意味著

5、此DNA分子上所有的限制性核酸內(nèi)切酶識別序列也已經(jīng)全部知道，可以繪制出DNA分子上每種限制性核酸內(nèi)切酶的1122識別序列的分布圖。PCR是模仿細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的 DNA復(fù)制過程進(jìn)行的，在體外由酶催化合成特異性DNA片段。232425寡核苷酸連桿： 是一種按預(yù)先設(shè)計(jì)，化學(xué)而成的寡核苷酸片段。一般由812 個核苷酸組成，以中線為軸，兩側(cè)互補(bǔ)對稱。其上有一種或幾種限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列，是連接 了寡核苷酸連桿的 DNA片段經(jīng)過這些限制性核酸內(nèi)切酶切割后，可以產(chǎn)生一定的黏性末端， 便于與具有相同黏性末端的另一DNA片段連接。多克隆位點(diǎn)：MCS連桿：MCS這樣的連桿被稱為多克隆位點(diǎn)寡核苷酸連桿或簡稱MCS

6、連桿。26銜接頭： 是一種化學(xué)合成的寡核苷酸，含有一種以上的限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列。2728293031323334353637DNA芯片：是DNA片段以預(yù)先設(shè)計(jì)的排列方式固定在載玻片或尼龍膜上而組成的密集分子 排列。DNA連接酶：能催化雙鏈DNA片段緊靠在一起的 3羥基末端與5磷酸基團(tuán)末端之間形成磷 酸 2 酯鍵?；蚩寺≥d體：是以質(zhì)粒DNA分子為基礎(chǔ)構(gòu)件而成的克隆載體，主要用于原核生物和植物 的基因轉(zhuǎn)移以及建立基因組文庫和cDNA基因文庫。質(zhì)粒：一種寓于宿主細(xì)胞中染色體外裸露的雙鏈DNA分子。嚴(yán)緊型質(zhì)粒： 松弛型質(zhì)粒： 親和性質(zhì)粒： 不親和性質(zhì)粒： 不相容質(zhì)粒： 接合質(zhì)粒： 非接合質(zhì)粒

7、：拷貝數(shù)少的質(zhì)粒?？截悢?shù)多的質(zhì)粒。把能同寓于細(xì)胞中的不同質(zhì)粒成為親和性質(zhì)粒。 不能同寓于一個細(xì)胞中的質(zhì)粒。既不親和質(zhì)粒。38含有 tra 基因的質(zhì)粒。不含有 tra 基因的質(zhì)粒。部分質(zhì)粒雖不含tra基因，但含有bom位點(diǎn)，當(dāng)宿主細(xì)胞內(nèi)同時存在含有 mob基因的產(chǎn)物可打開非接合質(zhì)粒的oriT位點(diǎn)，借助于接合質(zhì)粒這個現(xiàn)象叫質(zhì)粒遷移作用。質(zhì)粒遷移作用：mob基因的輔助質(zhì)粒時，tra 基因的產(chǎn)物， 使非接合質(zhì)粒被動遷移到受體細(xì)胞中，394041424344顯性質(zhì)粒： 質(zhì)粒除了與控制本身復(fù)制和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因外，有的質(zhì)粒還攜帶一些其他的基 因，宿主細(xì)胞由于含有這樣的質(zhì)粒二呈現(xiàn)出新的形狀。隱蔽質(zhì)粒： 即使宿

8、主細(xì)胞含有某些質(zhì)粒，但無異樣性狀表露。R質(zhì)粒：顯性質(zhì)粒有抗抗菌素的抗性質(zhì)粒。穿梭質(zhì)粒：Ti 質(zhì)粒： 根癌農(nóng)桿菌含有一種內(nèi)源質(zhì)粒，當(dāng)農(nóng)桿菌同植物接觸時這種質(zhì)粒會引起植物產(chǎn)生 腫瘤。T-DNA： ti 質(zhì)粒進(jìn)入植物細(xì)胞的只有一小部分，把這種能轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞內(nèi)的T-DNA.。DNA片段成4546中間質(zhì)粒克隆載體： T-DNA 的部分序列插入大腸桿菌質(zhì)?？寺≥d體，由此構(gòu)件的克隆載體 承受外源基因后， 須先在輔助質(zhì)粒推動下進(jìn)入農(nóng)桿菌， 再在農(nóng)桿菌介導(dǎo)下送入植物細(xì)胞。 因 此，把這類克隆載體叫中間質(zhì)?？寺≥d體。TA克?。篜CR的賴熱DNA聚合酶具有一種非模版依賴性活性，這種活性可在 端加上一個非配對的脫氧

9、腺嘌呤核苷。根據(jù)這一特點(diǎn)研制出一種線性質(zhì)粒，其PCR產(chǎn)物的35端各帶一個不配對脫氧胸腺嘧啶核苷，采用該質(zhì)粒可將PCR產(chǎn)物以TA連接的方式直接進(jìn)行克隆。47DNA分子，左右兩端各有 12個核苷酸組成的入DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞后，黏性末端連接后形48495051cos位點(diǎn)：入噬菌體的DNA在噬菌體中是線狀5 突出黏性末端，而且兩者的核苷酸序列互補(bǔ)。 成環(huán)狀DNA分子。把此能連接的末端稱 cos位點(diǎn)。Cosmid克隆載體：根據(jù)入噬菌體克隆載體和質(zhì)?？寺≥d體兩者的性質(zhì)，取長補(bǔ)短，設(shè)計(jì)由 質(zhì)粒和含有cos位點(diǎn)的這種入DNA片段組裝成一類新的克隆載體。病毒質(zhì)粒克隆載體：克隆載體含有SV40完整早期轉(zhuǎn)錄區(qū)DNA

10、序列和DNA復(fù)制起始位點(diǎn)，以 及質(zhì)粒DNA的復(fù)制起始位點(diǎn)和選擇標(biāo)記基因。定位整合克隆載體： 除了一般質(zhì)粒克隆載體必須具備的元件外，韓必須含有一個或兩個與 整合平臺DNA區(qū)域核苷酸序列同源的 DNA片段。整合平臺：受體細(xì)胞基因組上給定的一個DNA區(qū)域，是外源DNA定位整合的位置。5253545556基因打靶： 利用基因整合平臺系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因的方法。YAC克隆載體：將酵母染色體DNA的端粒，DNA復(fù)制起點(diǎn)和著絲粒以及必要的選擇標(biāo)記基因 序列克隆到大腸桿菌質(zhì)粒 PBR322中，構(gòu)建成YAC克隆載體。誘導(dǎo)型表達(dá)克隆載體： 啟動子必須在特殊的誘導(dǎo)條件下才有轉(zhuǎn)錄活性或比較高的轉(zhuǎn)錄活性 的表達(dá)克隆載體。反義核酸

11、技術(shù) ：利用人工合成的或組成的與靶基因互補(bǔ)的一段反義 性的與靶基因結(jié)合，達(dá)到封閉其表達(dá)的目的。目的基因： 從現(xiàn)有的生物群體中， 根據(jù)需要分離出用于克隆的基因。DNA或 RNA片段，特異575859重疊基因：不同基因共同用同一段DNA核苷酸序列，它們的核苷酸系列是彼此重疊的，這樣的基因稱重疊基因?；蚪M文庫： 某種生物的基因組的全部遺傳信息通過克隆載體儲存在一個受體菌群體之中， 這個群體及為這種生物的基因組文庫。cDNA基因文庫：某種生物基因組轉(zhuǎn)錄的部分或全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的各種 cDNA片段分別與克隆載體重組，儲存在一種受體菌群體中，這樣的群體叫cDNA基因文庫。6061RACE是指mR

12、NA為模版，反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA的第一條鏈，然后用 PCR技術(shù)擴(kuò)增出從某個特 定位點(diǎn)到3端或到5端之間的未知核苷酸序列。套式PCR是指用兩對引物擴(kuò)增同一個樣品的方法。在兩對引物中，一對引物與靶序列的復(fù)性結(jié)合位點(diǎn)處于另一對引物擴(kuò)增的DNA序列內(nèi)，前者稱為內(nèi)部引物，后者稱為外側(cè)引物。62錨定 PCR：指通過增加錨定引物接頭的方式來擴(kuò)增合成未知序列或未全知序列的方法。6364多重 PCR： 否及其數(shù)量。定量 PCR：利用多對引物同時擴(kuò)增模版上的多個靶序列，以確定待檢測的基因片段存在與通過PCR擴(kuò)增來定量擴(kuò)增體系中的 DNA或 RNA的起始拷貝數(shù)量。6566功能互補(bǔ)克隆技術(shù)：利用被克隆的DNA片段與寄

13、主細(xì)胞的染色體 DNA在功能上有同源互補(bǔ)性來進(jìn)行目的基因直接分離。表達(dá)序列標(biāo)簽： 基因序列中一段能特異的標(biāo)記或表征基因的序列，通常它含有足夠的結(jié)構(gòu) 信息以顯示出該基因與其他基因的差異。67代表差別分析： 通過突變型與野生型基因組之間的差異比較來分離和鑒定突變基因的方法。6869CG島：人類基因組大多數(shù) CG位點(diǎn)都是高度甲基化的，但仍有少數(shù)的CG位點(diǎn)是低甲基化或非甲基化的，這種低甲基化或非甲基化的剪接位點(diǎn)篩選法CG位點(diǎn)就是CG島。：利用與剪接位點(diǎn)序列一致的簡并寡核苷酸作為探針來篩選目的基因。70717273表面展示技術(shù)：細(xì)胞或細(xì)胞表面， 基因的噬菌體，細(xì)菌或細(xì)胞。轉(zhuǎn)化：重組質(zhì)粒DNA分子通過與膜

14、蛋白結(jié)合進(jìn)入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表 達(dá)的過程。感受態(tài)細(xì)胞：處于能吸收周圍環(huán)境中 DNA分子的生理狀態(tài)的細(xì)胞。轉(zhuǎn)導(dǎo)：通過入噬菌體顆粒感染宿主細(xì)胞的途徑把外源DNA分子轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞內(nèi)的過程。將目的基因克隆在特定的表達(dá)載體中，使其表達(dá)產(chǎn)物顯示在活的噬菌體，然后根據(jù)表達(dá)產(chǎn)物的某些生物學(xué)活性的檢測來篩選， 富集和克隆帶有目的747576原生質(zhì)體 ：除去細(xì)胞膜的剩余細(xì)胞部分?；驑尫ǎ?利用高速運(yùn)行的金屬顆粒轟擊細(xì)胞時能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的現(xiàn)象，將包裹在金屬顆粒表面的外源DNA分子隨之帶入細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)的基因轉(zhuǎn)化方式。脂質(zhì)體：由人工構(gòu)建的磷脂雙分子層組成的膜狀結(jié)構(gòu)，可以將DNA包在其內(nèi)，并通過脂質(zhì)體

15、與原生質(zhì)體的融合或由于原生質(zhì)體的吞噬作用，把外源DNA轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)。777879轉(zhuǎn)化子：導(dǎo)入外源DNA分子后能穩(wěn)定存在的受體細(xì)胞?？寺〉暮Y選：報(bào)告基因： 在植物轉(zhuǎn)基因研究中， 載體攜帶著選擇標(biāo)記基因通常稱為報(bào)告基因。8081828384858687888990雜交探針： 具有一定序列的核苷酸片段，它與能互補(bǔ)的核苷酸序列復(fù)性雜交并且通過適當(dāng) 標(biāo)記進(jìn)行檢測。亞克?。?將克隆片段進(jìn)一步片段化后再次克隆。增強(qiáng)子：能夠增強(qiáng)啟動子轉(zhuǎn)錄活性的DNA順式作用序列。衰減子： 基因表達(dá)調(diào)控的精細(xì)調(diào)控裝置，它利用原核生物轉(zhuǎn)錄與翻譯相偶連的特性，依賴自身巧妙的特征序列和相應(yīng)的 RNAT級結(jié)構(gòu)，對基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)行開關(guān)式的微

16、調(diào)作用， 從而保證 原核生物在相關(guān)操縱子處于阻遏的狀態(tài)下仍能以一個基底水平合成氨基酸，核苷酸和抗生素等。絕緣子： 是基因表達(dá)調(diào)控元件，也是一種邊界元件，它能阻止臨近的調(diào)控元件對其所界定 基因的啟動子起增強(qiáng)或抑制作用。反義子：一類與特定 DNA序列互補(bǔ)的小分子 RNA成為反義RNA編碼反義 RNA的 DNA稱為 反義子。反義RNA 一類與特定DNA序列互補(bǔ)的小分子 RNA成為反義RNA 外源基因表達(dá)系統(tǒng)： 目的基因與表達(dá)載體重組后，導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞，并能在其中有效 的表達(dá)，產(chǎn)生目的基因產(chǎn)物。包涵體： 在一定的條件下，外源基因的表達(dá)產(chǎn)物在大腸桿菌中積累并致密的聚集在一起， 形成無膜的裸露結(jié)構(gòu)。融

17、合蛋白： 將外源蛋白基因與受體菌自身蛋白基因重組在一起， 以這種方式表達(dá)的蛋白叫融合蛋白。自主復(fù)制型質(zhì)粒載體：該質(zhì)粒含有酵母基因組的DNAM制起始區(qū)，選擇標(biāo)記和基因克隆位但不改變兩個基因閱讀框，9192939495著絲粒型質(zhì)粒載體： 該質(zhì)粒載體是在自主復(fù)制型質(zhì)粒載體的基礎(chǔ)上構(gòu)建而成的，增加了酵 母染色體有絲分裂穩(wěn)定序列元件， 因而能保證質(zhì)粒載體在細(xì)胞分裂是平均的分配到子細(xì)胞中 去，同時提高質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定性。酵母人式染色體： 該載體包含酵母染色體自主復(fù)制序列，著絲粒序列，端粒序列，酵母菌 選擇標(biāo)記基因以及大腸桿菌的復(fù)制子和選擇標(biāo)記基因等。轉(zhuǎn)基因動物： 人類按照自己的意愿有目的，有計(jì)劃，又根

18、據(jù)，有預(yù)見的將外源基因?qū)雱?物細(xì)胞內(nèi)。基因芯片：采用原位合成或顯微印刷技術(shù)，將數(shù)以萬計(jì)的DNA探針固定于支持物的表面上,產(chǎn)生的二維DNA探針陣列。點(diǎn)等關(guān)鍵元件。表達(dá)盒： 酵母表達(dá)載體的重要元件， 它由啟動子， 分泌信號序列和終止子等組成。1基因工程最突出的優(yōu)點(diǎn)是什么？ 基因工程最突出的優(yōu)點(diǎn)，是打破了常規(guī)育種難以突破物種之間的界限，可以使原核生 物和真核生物之間 | 、動物與植物之間、甚至人與其他生物之間的遺傳信息進(jìn)行重組和轉(zhuǎn)移。人 的基因可以轉(zhuǎn)移到大腸桿菌中表達(dá)，細(xì)菌的基因可以轉(zhuǎn)移到植物中表達(dá)。2基因工程的理論依據(jù)是什么？1)2)3)4)5)6)不同基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)。 基因是可以切割的

19、。 基因是可以轉(zhuǎn)移的。多肽與基因之間存在對應(yīng)關(guān)系。 遺傳密碼是通用的。 基因可以通過復(fù)制把遺傳信息傳遞給下一代。3. 作為克隆載體的 DNA分子必須具備的主要條件是什么？(1) 作為克隆載體 DNA分子合適的位置有一至多個克隆位點(diǎn)供外源DNA片斷組入克隆載體DNA分子。(2) 克隆載體能攜帶外源 DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞， 或者停留在細(xì)胞質(zhì)中能自主復(fù)制。(3) 克隆載體必須具有用于選擇克隆子的標(biāo)記基因。(4) 克隆載體必須是安全的，不應(yīng)含有對受體細(xì)胞有害的基因，并且不會任意轉(zhuǎn)入除了 受體細(xì)胞以外的其他生物的細(xì)胞，尤其是人的細(xì)胞。4構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的基本策略是什么？(1) 構(gòu)建的質(zhì)粒克隆載體應(yīng)該是

20、能在轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞中進(jìn)行有效的復(fù)制，并且作為質(zhì) ?？寺≥d體希望在受體細(xì)胞中有較多的拷貝數(shù)。DNA片段克隆的位點(diǎn)并且這樣的克隆位(2) 構(gòu)建的質(zhì)?？寺≥d體必須含有允許外源地 點(diǎn)應(yīng)該盡可能的多。(3) 構(gòu)建的質(zhì)?？寺≥d體必須含有供選擇克隆子的標(biāo)記基因。(4) 構(gòu)建的質(zhì)?？寺≥d體 DNA分子應(yīng)盡可能的小。，構(gòu)建成不同用途的( 5)根據(jù)特殊需要，使得構(gòu)建的質(zhì)?？寺≥d體中組裝各種“元件”質(zhì)?？寺≥d體。5質(zhì)粒克隆載體的設(shè)計(jì)和構(gòu)建過程應(yīng)遵循的原則是什么？（1）選用合適的出發(fā)粒。（2）正確獲得構(gòu)建治理載體的元件。（3）組裝合適的選擇標(biāo)記基因。（ 4）選用合適的啟動子。（ 5）在能達(dá)到預(yù)期目的的前提下， 構(gòu)建的

21、質(zhì)?？寺≥d體的過程應(yīng)力求簡單。6簡述再生 TA 克隆載體的方法？ （1）克隆載體線性化。 （2）克隆載體末端補(bǔ)平反應(yīng)。 （ 3）克隆載體末端加 T 反應(yīng)。7.構(gòu)建入噬菌體克隆載體的基本策略是什么？在入DNA上切去部分非必須的區(qū)域，抹去多余的限制核酸內(nèi)切酶切割位點(diǎn)，插入可供選 擇的標(biāo)記基因， 建立外包裝系統(tǒng) 。&構(gòu)建入噬菌體克隆載體的基本技術(shù)路線是什么?.用限制性核酸內(nèi)切酶切去 入DNA上的非必須區(qū)。在入DNA上的非必須區(qū)內(nèi)組入選擇標(biāo)記基因。.建立重組入DNA分子體外包裝系統(tǒng)。123 9.構(gòu)建cosmid克隆載體的策略是什么？cosmid克隆載體結(jié)合了質(zhì)?？寺≥d體和入噬菌體克隆載體的優(yōu)點(diǎn)。研究表

22、明，只要保留入DNA片段兩端不少于280bp并含有cos位點(diǎn)以及與包裝相關(guān)的核苷酸序列，當(dāng)插入外源DNA片段 后總長度大于36.4kb，小于51bP,這樣的重組 入DNA分子就能進(jìn)行包裝和轉(zhuǎn)導(dǎo)受體細(xì)胞。但入DNA片段本身不能進(jìn)行體外包裝和增值，不能作為克隆載體使用。但是質(zhì)?？寺≥d體克隆能力一般不能超過10kb.由質(zhì)粒和含有cos位點(diǎn)的這種入DNA片段組裝成一類新的克隆載體。即cosmid 克隆載體。10cosmid 克隆載體的特征是什么？1構(gòu)建的cosmid克隆載體是一種環(huán)形雙鏈DNA分子，大小不超過36.4kb，般在10kb以下。2具有質(zhì)粒的性質(zhì)，可以在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)按質(zhì)粒復(fù)制的方式進(jìn)行復(fù)制

23、，具有轉(zhuǎn)化大腸桿 菌的功能，還有一些克隆位點(diǎn)。3克隆載體上有一個 cos 位點(diǎn)。4. 構(gòu)建的cosmid克隆載體較小，因此能承受較大的外源DNA片段。11使用 cosmid 克隆載體的基本程序是什么？先用一種限制性核酸內(nèi)切酶切割cosmid克隆載體，再用 DNA連接酶連接。出現(xiàn)具有兩個cos位點(diǎn)的二聯(lián)體線性 DNA分子，然后選用在兩個 cos位點(diǎn)之間具有識別序列的限制性核酸內(nèi)切 酶切割二聯(lián)體線性 DNA分子和部分切割待克隆的外源DNA片段，兩者混合，用DNA連接酶連接,就成為可用于體外包裝的樣品。 使用 cosmid 克隆載體也可以先用兩種限制性核酸內(nèi)切酶分別切割cosmid克隆載體，獲得各有

24、一個 cos位點(diǎn)的線性DNA片段，為防止自行連接，分別在堿性磷 酸酶處理，使其 5端脫去磷酸基團(tuán)，然后再用另一種限制性核酸內(nèi)切酶切割兩種線性DNA片段和部分切割待克隆的外源DNA片段，三者混合，再用DNA連接酶連接，就可用于體外包裝。12.構(gòu)建CaMV克隆載體的基本策備和途徑是什么？如何利用CaMV DNA能侵入植物細(xì)胞的特性，通過對CaMV DNA勺改造，使其能攜帶人們需要的目的基因?qū)氲街参锛?xì)胞，并且消除CaMV對植物的致病性，這就是構(gòu)建 CaMV克隆載體的基本策備。用CaMV克隆載體的主要途徑如下：1 .構(gòu)建互補(bǔ)克隆載體。2. 構(gòu)建置換型克隆載體。3. 構(gòu)建混合克隆載體。4. 構(gòu)建CaM

25、V融合基因克隆載體系統(tǒng)。13. 構(gòu)建RSV反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體的策略是什么？由于反轉(zhuǎn)入病毒是一類 RNA病毒，不能直接構(gòu)建克隆載體，所以首先必須從感染的動物細(xì)胞 中分離出原病毒DNA然后根據(jù)不同需要刪去部分序列，組入選擇標(biāo)記基因、目的基因和一些調(diào)控元件，克隆到大腸桿菌源質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)的克隆載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌受體細(xì)胞，獲得大量含 反轉(zhuǎn)錄病毒原病毒重組 DNA分子，成為不同類型的反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體。14. Ad 克隆載體構(gòu)建的策略是什么？ 首先構(gòu)建一個含多克隆酶切位點(diǎn)和篩選標(biāo)志的質(zhì)粒， 該質(zhì)粒含有病毒基因組某段早期序列， 然后將含有一個啟動子一外源基因一poly(A)的表達(dá)盒子插入上述質(zhì)粒中Ad的E

26、1、E3或E4至右側(cè) ITR 區(qū)之間，構(gòu)建承載有外源基因的穿梭質(zhì)粒。其次是構(gòu)建一個含有非必須區(qū)基因缺失后 的環(huán)狀腺病毒 DNA的質(zhì)粒，該質(zhì)?？稍诰w內(nèi)復(fù)制；最后，載有外源基因的穿梭質(zhì)粒與攜帶環(huán) 狀腺病毒DNA的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，通過同源重組，即獲得重組腺病毒。15.桿狀病毒轉(zhuǎn)移克隆載體的構(gòu)建策略是什么？ 在基礎(chǔ)質(zhì)粒上插入多角體蛋白基因及其兩端側(cè)翼，并在多角體蛋白基因啟動子下游去 除編碼區(qū)，而插入多克隆位點(diǎn)，用于外源基因的克隆，外源基因插入后形成重組桿狀病毒克隆 載體。重組桿狀病毒克隆載體再與野生型AcNPV DNA一起共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生同源重組，使得外源基因整合到病毒基因組中。由于多角

27、體基因被取代，不能形成多角體，通過病 毒空斑測定就可以識別陽性克隆。利用AcNPV病毒克隆載體，在昆蟲細(xì)胞進(jìn)行外源表達(dá)，已成功表達(dá)多種蛋白分子。由于這類表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)量高，性能穩(wěn)定、操作簡單，已經(jīng)成為當(dāng)前最佳 的表達(dá)系統(tǒng)之一。16雙酶切法繪制限制性圖譜的原理17痘苗病毒克隆載體用于表達(dá)外基因的特點(diǎn)是什么？ 1表達(dá)的產(chǎn)物具有與天然產(chǎn)物相近的生物活性和理化性質(zhì)。 2重組痘苗病毒具有較好的免疫原性。3外源基因的插入量大。4. 宿主細(xì)胞廣泛。5表達(dá)產(chǎn)物可以進(jìn)行各種翻譯后修飾、無需佐劑就可刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫、 純化過程相對簡單、產(chǎn)物對外界環(huán)境穩(wěn)定及易于保存運(yùn)輸。18.直接分離目的基因的方法有哪

28、些？16利用痘苗病毒系統(tǒng)表達(dá)的外源目的基因在實(shí)驗(yàn)動物可提供保護(hù)性免疫反應(yīng)。、限制性核酸內(nèi)切酶切分離法。、物理化學(xué)方法有：密度梯度離心法、單鏈酶解法和分子雜交法。 、雙抗體免疫法分離編碼蛋白的基因。、利用酶促反轉(zhuǎn)錄法直接從特定的mRNA分離基因。19鳥槍法從基因組中分離目的基因的策略是什么？ 利用機(jī)械剪切力和超聲波等物理方法或限制型核酸內(nèi)切酶酶切等生物化學(xué)方法將生物細(xì)胞的染色體打斷，隨后通過 T4 DNA連接酶把這些片段于適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒載體進(jìn)行重組，轉(zhuǎn)化受體菌 后進(jìn)行無性繁殖，獲得一大群含有不同外源DNA片段的克隆，再用簡便的篩選方法從眾多的轉(zhuǎn)化菌株中篩選出含有某一目的基因的菌株，從中獲得索要的基因

29、。20.簡述不經(jīng)分級分離的基因組DNA文庫的構(gòu)建過程?21簡述考斯質(zhì)?；蚪M文庫的構(gòu)建過程？ 22.用考斯質(zhì)粒作為構(gòu)建基因組文庫載體的優(yōu)缺點(diǎn)有哪些？1 、考斯質(zhì)粒比入噬菌體 DNA能容納更大的外源 DNA片段，構(gòu)建的完整的基因組文庫所 需要的克隆數(shù)目減少，便于克隆和篩選。2 、載體本身的分子很小，便于直接分析插入片段的限制性核酸內(nèi)切酶圖譜。3 、缺點(diǎn)是：帥選困難、重組效率低、文庫不易貯存。23. YAC克隆載體的主要組成部分？YAC載體是以PBR322質(zhì)粒DNA為骨架構(gòu)建的，帶有 pBR322質(zhì)粒DNA的復(fù)制位點(diǎn)ori和篩選標(biāo)記Amp,此外還加入作為酵母染色體所必需的一些組成成分：一段來自酵母

30、染色體的著 絲粒序列、一段控制酵母DNA復(fù)制的自主復(fù)制序列、一對酵母端粒序列、選擇記號TRP1和URA3 克隆位點(diǎn)。24.簡述使用PYAC4構(gòu)建YAC基因組文庫的基本過程？首先，選用限制性核酸內(nèi)切酶，EcoRI和BamHI對Pyac4作雙酶消化，結(jié)果產(chǎn)生出具有 EcoRI 黏性末端的兩條臂分子和一段端粒序列片斷，其中在每一條臂分子中都帶有一段端粒 序列和一個選擇記號。去除兩端端粒序列的DNA片段，分離回收 YAC雙臂，勇于與基因組 DNA片段連接重組。其次，選用適當(dāng)?shù)姆椒ㄖ苽渖矬w完整的染色體DNA并將其去段化。25簡述12cDNA基因文庫構(gòu)建的主要步驟？、分離細(xì)胞總RNA并從總RNA中分離純

31、化出mRNA。、以mRNA子為模板，合成 cDNA第一鏈。、雙鏈cDNA的合成，即將mRNA-DN雜交分子轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈 cDNA分子。26雙鏈1cDNA合成的方法有哪些？、大腸桿菌RNaseH酶降解取代法。、 oligo(dG) 寡聚引物引導(dǎo)法合成雙鏈 cDNA。、PCR法。、載體引物引導(dǎo)合成法。、固相支持物法。27簡述構(gòu)建入gtlOcDNA文庫的主要步驟？待克隆的雙鏈cDNA分子的兩端，必須具有能與入gt10載體DNA限制位點(diǎn)互補(bǔ)的黏性 末端。為此，先用EcoRI甲基化酶處理雙鏈 cDNA使其中可能存在的 EcoRI限制位點(diǎn)得到保護(hù)， 而免于受切割；然后使用DNA連接酶把EcoRI銜接物連接到

32、雙鏈 cDNA分子的兩端，通常每一個cDNA分子的末端都會串聯(lián)的連接上許多個銜接物，接著加入EcoRIxian限制煤徹底切割銜接物分子，使得每個cDNA分子末端都只留下單一的 EcoRI黏性末端。與此同時也用EcoRI限制酶切 割入gt10載體DNA并純化所產(chǎn)生的噬菌體 DNA雙臂，此時他們與待克隆的 cDNA分子只有互補(bǔ) 的EcoRI黏性末端。將兩者混合并加入DNA連接酶，就會共價(jià)連接形成兩端具有cos位點(diǎn)的串聯(lián)排列的重組噬菌體分子。 用包裝蛋白質(zhì)將重組噬菌體分子包裝成具有感染能力的噬菌體顆粒， 感染大腸桿菌培養(yǎng)物后，涂布在瓊脂平板上，就會產(chǎn)生出數(shù)千個獨(dú)立噬菌斑的平板，而且每一 個噬菌斑都是

33、由單一的重組噬菌體分子所形成的，此即入gtlOcDNA文庫。28與基因組文庫的構(gòu)建及基因分離方法相比，cDNA克隆的優(yōu)點(diǎn)主要有哪些?、cDNA克隆以mRNA為材料，特別適用于某些RNA病毒。、cDNA基因文庫的篩選比較簡單易行。、由于每一個cDNA克隆都含有一種 mRNA序列，這樣在目的基因的選擇中出現(xiàn)假陽 性的概率就會比較低。4 、cDNA克隆可用于在細(xì)菌中能進(jìn)行表達(dá)基因的克隆，直接應(yīng)用于基因工程操作。、cDNA克隆還可用于真核細(xì)胞 mRNA勺結(jié)構(gòu)和功能研究。29簡述功能互補(bǔ)法克隆基因的方法?基因互補(bǔ)克隆技術(shù)是經(jīng)典微生物學(xué)方法的一種地?cái)U(kuò)展和延伸。它主要是利用被克隆的DNA片段與寄主細(xì)胞的染色

34、體 DNA在功能上有同源互補(bǔ)性來進(jìn)行目的基因直接分離的。一種 最簡單的方法是：將大腸桿菌DNA的克隆片段“庫”重組 DNA分子分別導(dǎo)入一種大腸桿菌營養(yǎng)缺陷型菌株的受體細(xì)胞，然后將此受體細(xì)胞涂布在一種缺少該菌株所需要的營養(yǎng)底物的培養(yǎng)基 上，結(jié)果只有那些獲得了營養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因的受體細(xì)胞才會長成轉(zhuǎn)化子菌落。30簡述基因表達(dá)系列分析法的原理?1 、從轉(zhuǎn)錄物某一特定位置上分離得到一段 910bp 的寡核苷酸序列標(biāo)簽，它含有確定 一個獨(dú)特轉(zhuǎn)錄物的足夠信息量，可代表此轉(zhuǎn)錄物的特異性。2 、多個序列標(biāo)簽?zāi)芤藻^定酶識別位點(diǎn)序列相隔相互連成雙標(biāo)簽序列的多聯(lián)體，將該多聯(lián)體序列克隆到一個載體中，用連續(xù)的方法進(jìn)行多聯(lián)

35、體的序列分析，再通過計(jì)算機(jī)處理，確定 每一種序列代表轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的種類和出現(xiàn)頻率，由此實(shí)現(xiàn)對轉(zhuǎn)錄物的高效、快速和大量的分析。31簡述外顯子捕捉法的原理？使外源DNA片段中的外顯子與克隆位點(diǎn)中已知序列的外顯子在受體細(xì)胞內(nèi)剪接，經(jīng)逆 轉(zhuǎn)錄酶的作用或RT- PCR技術(shù)擴(kuò)增得到外援 DNA片段中的外顯子，相應(yīng)的方法稱為簡述外顯子捕 捉法的原理。32簡述基因的定位候選法用于分離鑒定人類遺傳疾病相關(guān)基因的主要步驟？cDNA即表達(dá)圖譜。1、把疾病相關(guān)基因定位于染色體的精細(xì)區(qū)段。、通過數(shù)據(jù)庫查找已定位于該區(qū)段各候選基因或3病程對照，4致疾病的發(fā)生，最終確定該候選基因卻是與某種疾病相關(guān)。、通過對這些基因所編碼的蛋白

36、質(zhì)進(jìn)行功能分析，研究其調(diào)控性質(zhì)，并與相應(yīng)的疾病 找出最有可能的候選治病基因。、對候選基因進(jìn)行致病突變測試， 即通過動物模型確定患者體內(nèi)發(fā)生的突變是否可導(dǎo)33簡述噬菌體表面顯示技術(shù)分離目的基因的原理？當(dāng)外源DNA片段插入絲狀噬菌體基因組的一個外被蛋白基因中時，如果兩者讀碼框保 持一致，這個外源 DNA片段所編碼的產(chǎn)物可與此外被蛋白一起以融合蛋白的形式表達(dá)，并顯示 在噬菌體的表面。利用抗此外源基因編碼產(chǎn)物的抗體，通過親和純化，就能從大量的噬菌體中 富集、分離出含有所要的基因的融合噬菌體。然后通過基因擴(kuò)增，得到大量所要的目的基因。34簡述酵母雙雜交系統(tǒng)的原理？35受體細(xì)胞選擇應(yīng)符合的基本原則？1、便

37、于重組DNA分子的導(dǎo)入。、能使重組的DNA分子穩(wěn)定存在于細(xì)胞中。 、便于重組體的篩選。、遺傳穩(wěn)定性高、易于擴(kuò)大培養(yǎng)或發(fā)酵生長。 、安全性高、無致病性、不會對外界環(huán)境造成生物污染。 、選用內(nèi)源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的細(xì)胞，56細(xì)胞內(nèi)的積累，或促進(jìn)外源基因的高效分泌表達(dá)。789利于外源基因蛋白表達(dá)產(chǎn)物在、受體細(xì)胞在遺傳密碼的應(yīng)用上無明顯偏倚性。、具有較好的轉(zhuǎn)譯后加工機(jī)制，便于真和目的基因的高效表達(dá)。、在理論研究和生產(chǎn)實(shí)踐上具有較高的應(yīng)用價(jià)值。36酵母菌是外源真核生物基因最理想的表達(dá)系統(tǒng)，其優(yōu)勢有哪些？1 、酵母菌是結(jié)構(gòu)最為簡單的真核生物之一，其基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理比較清楚，遺傳操作相 對較為

38、簡單。2 、具有真核生物蛋白翻譯后修飾加工系統(tǒng)。、不含有特異性的病毒,不產(chǎn)生毒素。、培養(yǎng)簡單,利于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn),成本低廉。、能將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中, 便于產(chǎn)物的提取和加工等。37. 利用CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞的過程？1養(yǎng)生命活動旺盛的菌株。2. 淀菌體。3. 合物處理。38. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的 Ti 質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法中,供轉(zhuǎn)化的外植體的選擇應(yīng)考慮哪些方面？1優(yōu)先考慮葉片、子葉、胚軸等作為外植體材料。2要注意外植體的年齡, 應(yīng)選擇轉(zhuǎn)化能力強(qiáng)的幼期外植體, 同時還要考慮其最佳感受時期。3轉(zhuǎn)化外植體易便于組織培養(yǎng)，并有較強(qiáng)的再生能力。4應(yīng)考慮外植體中易轉(zhuǎn)化的分生組織感受細(xì)胞所在的部位及其數(shù)量。39. 簡述農(nóng)桿菌 Ti 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的基本程序？1 .外植體的農(nóng)桿菌接種操作浸泡時間過長,外植體常因農(nóng)桿菌毒害而缺氧死亡。常采用較低的菌液0D值和較短的浸泡時間進(jìn)行外植體的接種。2. 將接種農(nóng)桿菌后的外植體培養(yǎng)在誘導(dǎo)組織或不定芽固體分化培養(yǎng)基