大腸桿菌轉基因體系建立和植物基因組提取

1、分子生物學實驗報告學院：生命科學學院專業(yè)年級：生技 093姓名：殷曉杰學好： 2009013452大腸桿菌轉基因體系的建立和植物基因組的提取摘要：分子生物學是在分子水平研究生命現(xiàn)象的一門學科，主要研究 生物大分子的結構、 功能和生物合成從而闡明生命現(xiàn)象本質。 分子生 物學在短短的幾十年間經(jīng)歷了一個飛速的發(fā)展過程， 從探究遺傳物質 的本質到闡明 DNA 的雙螺旋結構，從蛋白質的序列分析到 DNA 高 通量測序， 從生物大分子的基本結構到現(xiàn)在的基因組學、 蛋白質組學 等等，可以看到分子生物學的偉大前進。 于此相伴的是分子生物實驗 技術的飛速革新和發(fā)展。 分子生物學成了生命科學研究的基礎手段和 先進

2、前沿， 轉基因就是熱點之一。 本文先是對轉基因技術作了一個簡 單的綜述，然后主要是描述了實驗室大腸桿菌轉基因體系的建立和檢 測方法。實驗材料是含p38質粒的大腸桿菌（實驗室命名）和TOP10 大腸桿菌（用于制備感受態(tài)細胞） ，最后的檢測方法是用的經(jīng)典的southern bloti ng。另外，本文最后還簡述了植物基因組的提取方法。關鍵詞 大腸桿菌 轉基因體系 植物 基因組提取 前言 分子生物學是在分子水平研究生命現(xiàn)象的一門學科， 主要研究 生物大分子的結構、 功能和生物合成從而闡明生命現(xiàn)象本質。 分子生 物學在短短的幾十年間經(jīng)歷了一個飛速的發(fā)展過程， 從探究遺傳物質 的本質到闡明 DNA 的雙

3、螺旋結構，從蛋白質的序列分析到 DNA 高 通量測序， 從生物大分子的基本結構到現(xiàn)在的基因組學、 蛋白質組學等等，可以看到分子生物學的偉大前進。 于此相伴的是分子生物實驗 技術的飛速革新和發(fā)展。 分子生物學已然成了生命科學研究的基礎手 段和先進前沿，轉基因就是熱點之一。所謂的轉基因技術， 是將人工分離和修飾過的基因導入到生物體基因 組中，由于導入基因的表達， 引起生物體的性狀的可遺傳的修飾的 種實驗技術。 轉基因技術一般可分為目的基因的獲得、 粘性末端切割和載體的構建及轉導這幾個過程。 按照目的基因受體的不通過可以把轉基因技術分為植物轉基因技術和動物轉基因技術，還有細菌轉基因技術。對于植物轉基

4、因技術轉化方法目前已經(jīng)得到了很好的發(fā)展， 本上可以分成三類： 載體介導的基因轉化 （如農(nóng)桿菌介導法和病毒介 導法）、DNA直接導入法（如基因槍法、PEG法、脂質體法、電激法、顯微注射法、激光微束法、 超聲波法等）和種質系統(tǒng)介導的基因轉化如花粉管通道法、浸泡法和子房、胚囊注射法等）1 。轉基因動物的制作方法有顯微注射法、逆轉錄病毒感染胚胎法、精子載體法、卵 母細胞精子注射法、 ES 細胞介導的基因轉移法及人工酵母染色體法 等2 。對于微生物轉基因技術目的基因的轉導，可以通過制備感受態(tài) 細胞改變細胞的通透性來實現(xiàn)。目前，轉基因技術是一個非常熱門的研究技術， 應用的也是十分普遍， 同基因工程、細胞工

5、程緊密聯(lián)系在一起。轉基因的應用和研究熱點， 有以下幾個方面：1. 遺傳育種 傳統(tǒng)育種只能在同種或親緣關系很近的物種之間進行，且自發(fā)性突變作為選種的前提，其發(fā)生機率相當?shù)汀＾D基因技術則可克服上述問題。通過生物信息學以及分子生物學的 方法，預測并獲得一定優(yōu)越性的基因，通過轉基因技術獲得具 有該優(yōu)良性狀新的物種或者改良物種，是轉基因技術一個熱門 的研究方向。現(xiàn)在已經(jīng)的到了蓬勃的發(fā)展，并且還將繼續(xù)火熱 下去。2. 研究模型的建立 利用轉基因技術，可以很好的建立生命科學研究的實驗室研究的生物模型。例如，現(xiàn)代醫(yī)學研究證明人類 的大多數(shù)疾病都與遺傳有關，適當?shù)膭游锬Ｐ蛯ρ芯炕蛲蛔?而引起遺傳疾病的發(fā)病機制

6、是十分有效的。而用轉基因動物的 方法生產(chǎn)人類遺傳疾病模型則成為人類遺傳疾病研究的一個極 為有效的途徑 3 。3. 生物反應器的研究 利用轉基因受體生產(chǎn)轉入基因的產(chǎn)物是轉基因技術的另一個重要應用。在動物上，乳腺反應器就是一個較為成功的例子。發(fā)酵工程用的菌很多的也是轉基因菌，獲得的產(chǎn)物有些則是轉入目的基因所表達的3。4. 轉基因安全性研究 近年來轉基因生物安全性問題已引起了公眾的普遍擔憂 , 嚴重制約了轉基因技術成果的推廣應用。很多 研究者從轉基因安全性的角度，對轉基因技術進行了深入的探 究，開發(fā)出了許多安全轉基因技術。比如：無選擇性標記基因 技術、安全標記基因技術、葉綠體轉化技術、終止子技術、雄

7、 性不育技術、外源基因刪除技術。其中外源基因刪除技術表現(xiàn) 出很大的應用前景 4 。綜上是轉基因技術的一個簡單的介紹。 可以看出轉基因技術的科研價 值的重要性和應用的普遍性。 本次實驗旨在建立一個實驗室內(nèi)的大腸 桿菌的轉基因實驗體系， 同時涉及到了植物轉基因技術的準備實驗 植物基因組的提取及體外擴增。實驗材料、試劑、儀器1. 實驗材料1.1. 1 細菌培養(yǎng)：1）LB 培養(yǎng)基（提前配好） ，酵母提取液，氯化鈉，瓊脂粉，氫氧 化鈉（1MK L）,抗生素（氨芐青霉素）1.1. 2 質粒 DNA提取:LB液體培養(yǎng)基，LB平板培養(yǎng)基，溶液I : 50mmoJZL葡萄糖，lOmmol/LEDTA,25mmo

8、lTris-CI(PH8.0),溶液 口： 0.2mmol/LNaoH,1% SDS,溶液3: ph4.8的醋酸鉀溶液（5mol/L乙酸鉀60ml,冰乙酸11.5ml,水 28.5ml) ,TE 緩沖液(ph8.0 ) :10mmol/LTris-HCl,1mmol /LEDTA, 無水乙醇， 70乙醇。1.1. 3 瓊脂糖凝膠電泳：DNA羊品，TEB緩沖液（5X用時需稀釋10倍）點樣緩沖液LoadingBuffer（10 x ）:0.25 %溴酚藍，40%甘油，溴乙啶染色液（EB）: 10mgml 溴乙啶（致癌小心），瓊脂糖1.1.4質粒DNA酶切及電泳分析:EcoRI酶，入DNA,TEB緩

9、沖液（5X,用時稀釋10倍），點樣緩沖液loading Buffer （同上），溴乙啶染色液（EB,瓊脂糖。1.1. 5聚合酶鏈式反應（PCR技術體外擴增DNATapDNA聚合酶，10X反應緩沖液（含 25mmolMgCI2 Qntp,引物（P1,P2）溴乙啶染色液，點樣緩沖液1.1. 6質粒載體和外源DNA勺連接反應:目標DNA片段（RT-PCR擴增產(chǎn)物），載體（Pgemt-easy載體2 Xligation 緩沖液，T4DNAi接酶，ddH2O1.1. 7 感受態(tài)細胞勺制備及轉化:0.1mol /LCaCl2取20ulPCR產(chǎn)物進行1.2 %瓊脂糖電泳分析，LB液 體培養(yǎng)基（見前面），氨芐

10、青霉素（ 100mgml）1.1. 8 DNA 分析 Southern 雜交:Standard buffer ,Standard buffer 50% formamide,High SDS buffer ,Wash Solution I :2 x SSC,0.1 % SDS,Wash Solution n :0.5XSSC,0.1%SDS1.2. 1植物基因組DNA提取，酶切及電泳分析:），DNA extraction:500ml (31.885g sorbitol,6.05g Tris ph8.2Nuclei Lysis buffer:500ml(1M Tris ph7.5 100ml, 0

11、.25M EDTA 100ml , 5MNaCl 200ml , CTAB10g , ddH2O100ml),5 %sarkosyl(N- 月桂酰肌氨基鈉鹽 ） 500ml. 使用時將上述勺三種溶液按 1:1:0.4 比例 混勻，加入亞硫酸氫鈉（3.8g /1） ,65 C預熱，即為抽提液1.2. 2 RNA提取及純化:溶于DEPCDEPC處理的 ddH2O,RNA提取液（每 100ml 中含有）：Tris 6.06g ,LiCl 6.03g EDTA 10ml SDS 50g ; 8MLiCl:33.92g LiCllOOmIDE PC水飽和酚，氯仿，0.5M NaCI,溴乙啶，點樣緩沖液1

12、.2. 3 RT-PCR 擴增目的基因才 cDNA:RNA模板，cDNA引物，反轉錄緩沖液，Dntp,AMV反轉錄酶，RNA抑制劑（RNasin）, Taq 酶，10 x PCR緩沖液,引物（ p1,p2）2. 實驗儀器1 ）培養(yǎng)皿，2）帶帽試管，（ 3）涂布器，4）高溫滅菌鍋， （ 5）無菌操作臺，10,100,1000uI5）恒溫搖床（ SKY-211C,made in China ），（6） 移液槍， （ 7）臺式高速離心機（ eppendorf ,5417R ,madein Geramany）, （8）搖床（同上），（9）電泳儀DY7C型，北京六一儀器廠），（10）微波爐（LG品牌），

13、（11）恒溫水浴箱（DK4208型，上海精宏實），（12） PCR擴增儀（GeneAmp 9700,made inSingapore） ，（13）凝膠成像系統(tǒng)，（14） 1.5mI 離心管， （15）離心管架，（ 16）雜交爐3. 實驗材料含P38質粒的大腸桿菌大腸桿菌TOP 10黃化干旱脅迫處理的小麥幼苗實驗流程1. 整體實驗流程結構圖（1） 大腸桿菌轉基因體系的建立整體實驗方案流程見下圖1,具體實驗操作后面將敘述。（2） 植物基因組的提取和體外擴增基本而言，植物是我們轉基因技術應用的熱點， 所以設計了下面的植 物基因組的提取和體外擴增實驗。圖1.大腸桿菌轉基因實驗體系流程圖廠植物基因組DN

14、A提取電泳植物RNA勺提取-J1 .檢cDNAPCR 擴增測圖2 .植物DNA提取和RNA提取及cDNA擴增興：圖1中的直線表示理論上對于目的基因的檢測應該是對轉入目的 基因后的大腸桿菌而言的。2. 具體操作方法母菌活化3 7度過夜培養(yǎng)，然后挑取單克隆擴大培養(yǎng)（37度，22 0轉每分鐘，8 9小時）1.2質粒提取和PCR質粒的提取采用的是堿裂解法，參看分子克隆實驗指南PCR程序如下:PCR體系如下:體系：50此94C3mi n10X buffer5此94 r45s10X dNTP5丄35cycles55 C45sPrimer P11 jJ_72 C60sPrimer P2172 C10min2

15、此1此 35此模板 酶 ddH208ul 樣 +2ul louding buffer，電壓：120V恒壓。用的是1癥脂糖膠。1.3質粒酶切和電泳檢測實驗酶切體系：20ul體系P lasmid10此EcoRI1此10X buffer2此ddH2O7此過夜反應。電泳檢測：如上。1. 4質粒載體連接P38質粒的PCR產(chǎn)物和商業(yè)化載體（Pgemt-easy載體）連接。20ul連接體系:1ul5ul1ul11ul2ulBuffer (10X)PCR片段產(chǎn)物Reac ptorT4-ligase ddHhO 過夜培養(yǎng)。1. 5感受態(tài)細胞的制備及轉化1.6克隆和藍白斑刪選感受態(tài)細胞的制備，實用氯化鈣對細胞壁進

16、行處理改變其通透性。 經(jīng)典實驗參看分子克隆實驗指南轉化:迅速冰浴1. 7southern 雜交 依據(jù)質粒PCF產(chǎn)物合成的地高辛探針，雜交對象是質粒酶切產(chǎn)物。具體操作參看分子克隆實驗指南。2. 1植物DNA勺提取、PCR及電泳檢測植物DNA提取采用液氮研磨CTAB抽提法，具體操作參看分子克隆 實驗指南。電泳檢測：同上。PCF程序:3mi n45s45s60s10min94 r94r35cycles55 C_ 2C72 C2. 2植物RNA勺提取和cDNA勺擴增RNA提取采用試劑盒提取法。提取方法參看 Trizol試劑盒說明書。CDN擴增PCR擴增體系:體系:10山1丄 1此 4丄 1此 2丄 1

17、此酶RNase buffer ddH20 dNT POligoPCR程序：3min45s35cycles45s60s10min電泳檢測：0.8%瓊脂糖膠。點樣類上。實驗結果1.質粒DNA2.酶切DNAPicture 1I.-即JPicture 2/麻邇I3.質粒PCR3IL4.小麥基因組435.小麥RNA:r6.小麥cDNA7.雜交轉膜8.southem雜交顯色結果分析和討論1.對于質粒的提取電泳結果而言，質粒在提取過程中發(fā)生了開環(huán)解旋或者斷裂相結果顯示出現(xiàn)了多條帶。這里要說的是就是不能迷信課本，認為只會出現(xiàn)三條帶，而是要具體問題具體分析。雖然有了質粒的損傷，但只要我們酶切的目的片段完整，對后續(xù)的實驗不會有太大的影響。2.對于酶切的電泳結果，可謂是一波三折。其中Picturel最后在正確情況下跑出來的結果。Picture2是在高濃度的緩沖液下電泳結果, 發(fā)現(xiàn)畫面粘稠，跑的不開。而且，在電泳的一開始的時候正負極也弄 反了。這一點是對細節(jié)的忽視，這是最大的教訓和收獲。另外，只對 電泳結果而言，除了右邊的 marker其余條帶跑的并不清楚。在該出 現(xiàn)的地方， 沒有明顯的亮的條帶而且條帶過長。 初步談論認為是