Realtime PCR檢測(cè)原理和問(wèn)題處理【技術(shù)材料】

1、Real-time PCR檢測(cè)技術(shù)原理和問(wèn)題處理,2014-06-25,1,技術(shù)研究,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)（Real-time PCR,熒光定量PCR（Realtime fluores-cence quantitative PCR,RTFQ PCR)是1996年由美國(guó)Applied Biosystems 公司推出的一種新定量實(shí)驗(yàn)技術(shù)，它是通過(guò)熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品模板的初始濃度,2,技術(shù)研究,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)（Real-time PCR,定量PCR的數(shù)學(xué)原理 定量PCR的化

2、學(xué)原理 定量PCR的光學(xué)原理,3,技術(shù)研究,什么是PCR,4,技術(shù)研究,PCR的反應(yīng)過(guò)程,5,技術(shù)研究,RT-PCR原理圖,6,技術(shù)研究,熒光定量PCR的數(shù)學(xué)原理,1、Baseline (基線) 2、Threshold (閾值) 3、Threshold Cycle (CT值) 4、DNA0 (初始模板,7,技術(shù)研究,基線,反應(yīng)熒光明顯增加前的背景熒光值。默認(rèn)為 3-15 cycles的信號(hào)值,線性圖譜,對(duì)數(shù)圖譜,8,技術(shù)研究,閾值,閾值= 基線（背景）信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即 PCR擴(kuò)增信號(hào)進(jìn)入相對(duì)穩(wěn)定對(duì)數(shù)增長(zhǎng)的最下限，通常設(shè)定在S型擴(kuò)增曲線的增長(zhǎng)拐點(diǎn)處附近,9,技術(shù)研究,Ct值,擴(kuò)增反應(yīng)中

3、，當(dāng)熒光信號(hào)增長(zhǎng)到大于閾值時(shí)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)，即PCR增長(zhǎng)信號(hào)與 Threshold發(fā)生交匯的循環(huán)數(shù)，也是FQ-PCR判斷陰陽(yáng)性和進(jìn)行定量分析的依據(jù),10,技術(shù)研究,DNA0,確定初始模板的濃度 初始DNA量越多, 熒光達(dá)到某一值（域值）時(shí)所需要的循環(huán)數(shù)越少 Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)就可計(jì)算出樣品中所含的模板量,11,技術(shù)研究,Real-time PCR動(dòng)力學(xué)曲線和四個(gè)階段,只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR 產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。 PCR理論方程只在指數(shù)期成立,12,技術(shù)研究,PCR產(chǎn)物的量與擴(kuò)增循環(huán)

4、數(shù)間的理論方程,Rn = RB + X0 (1+ e)n Rs Rn :第N次PCR循環(huán)時(shí)的熒光信號(hào)強(qiáng)度 RB :背景信號(hào)強(qiáng)度 X0 (1+ e)n Rs :每個(gè)分子的熒光強(qiáng)度與分子數(shù)目的乘積 經(jīng)過(guò)一系列移項(xiàng)、取對(duì)數(shù)等復(fù)雜數(shù)學(xué)公式變換： 得到：Ct = k lg X0 + b 線性方程， lg X0 越大，則CT值越小,13,技術(shù)研究,從熒光信號(hào)實(shí)現(xiàn)定量結(jié)果 一、檢測(cè)熒光信號(hào)增長(zhǎng)，獲取樣品CT值,14,技術(shù)研究,從熒光信號(hào)實(shí)現(xiàn)定量結(jié)果 二、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,15,技術(shù)研究,從熒光信號(hào)實(shí)現(xiàn)定量結(jié)果 三、以待測(cè)樣品的Ct值對(duì)DNA0作圖，得到定量結(jié)果,16,技術(shù)研究,定量PCR的數(shù)學(xué)原理 定量PCR的

5、化學(xué)原理 定量PCR的光學(xué)原理,17,技術(shù)研究,常用的熒光標(biāo)記方法,1、DNA雙鏈特異性染料 SYBR Green 、SYTO 9、LC Green、Evagreen 2、序列特異性探針 TaqMan 、Molecular Beacons（分子信標(biāo)）、Dual Probes (FRET)、LNA(Locked Nucleic Acid) Double-Dye probes,18,技術(shù)研究,SYBR Green I 工作原理,1、每形成一個(gè)DNA雙鏈，就有一定數(shù)量的染料結(jié)合上去 2、染料一結(jié)合，就產(chǎn)生熒光信號(hào) 3、信號(hào)強(qiáng)度與DNA分子總數(shù)目成正比,19,技術(shù)研究,SYBR Green I工作原理

6、圖片演示,20,技術(shù)研究,熔解曲線(Dissociation curve,目的：在PCR之后分析產(chǎn)物特異性 基本程序： -解鏈； -復(fù)性； -升溫檢測(cè)； -降溫； 軟件自動(dòng)分析,21,技術(shù)研究,融解曲線(Dissociation curve,PCR雙鏈產(chǎn)物熒光強(qiáng)度與溫度的函數(shù)圖，用于確認(rèn)產(chǎn)物的特異性。 Tm值：50%DNA變成單鏈時(shí)所需要的溫度，此溫度與雙鏈DNA的長(zhǎng)度、GC含量有關(guān)，可部分代表產(chǎn)物序列的特異性； PCR反應(yīng)完成后，控制體系溫度緩慢升高，雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA，SYBR Green被釋放，熒光信號(hào)逐漸減弱； 當(dāng)體系到達(dá)某一特定溫度時(shí)，某些DNA雙鏈會(huì)突然完全解離，熒光強(qiáng)度

7、也顯著減弱； 對(duì)融解曲線求一階導(dǎo)數(shù)，峰值代表斜率改變最大值，該處所對(duì)應(yīng)的橫坐標(biāo)值（溫度），即Tm,22,技術(shù)研究,融解曲線(Dissociation curve,PCR雙鏈產(chǎn)物熒光強(qiáng)度與溫度的函數(shù)圖，用于確認(rèn)產(chǎn)物的特異性,原始圖譜,導(dǎo)數(shù)圖譜,只有染料法才需要做熔解曲線，探針?lè)](méi)必要,23,技術(shù)研究,SYBR Green I的優(yōu)缺點(diǎn),成本低 不需要制備序列特異的針對(duì)性探針，且試劑便宜 適合初步篩查 先用SYBR篩查，再對(duì)少數(shù)關(guān)鍵樣品用探針?lè)ù_認(rèn) 配合熔解曲線分析 需鑒定PCR反應(yīng)是否有雜帶、引物二聚體 特異性問(wèn)題 不能分辨主帶與雜帶，給出所有雙鏈DNA的總信號(hào) 多重定量問(wèn)題 每個(gè)PCR管只能檢測(cè)

8、一個(gè)目標(biāo)基因,24,技術(shù)研究,Taqman原理,Taqman熒光定量技術(shù)是以Taqman熒光探針為基礎(chǔ)，Taqman熒光探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)和一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)。探針完整時(shí)，發(fā)射基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的53外切酶活性將探針酶切降解，使熒光發(fā)射基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步，從而實(shí)現(xiàn)定量,25,技術(shù)研究,TaqMan探針的作用機(jī)理,26,技術(shù)研究,Taqman探針,優(yōu)點(diǎn) 靈敏、特異性高： 每擴(kuò)增一個(gè)特異產(chǎn)物只釋放一個(gè)分子的熒

9、光染料，實(shí)時(shí)檢測(cè)特異擴(kuò)增片斷，非特異產(chǎn)物對(duì)檢測(cè)信號(hào)沒(méi)有影響，有效提高檢測(cè)的專(zhuān)一性 有多種不同波長(zhǎng)的熒光基團(tuán)對(duì)可供選擇，可以實(shí)現(xiàn)在同一管內(nèi)檢測(cè)多重PCR，降低成本也提高效率和準(zhǔn)確性 避免了熒光染料對(duì)PCR反應(yīng)的影響 缺點(diǎn) 探針設(shè)計(jì)有一定難度，需要驗(yàn)證效果 探針合成質(zhì)量對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有較大影響 熒光標(biāo)記成本較高,27,技術(shù)研究,多重檢測(cè),原理 同一樣本，多對(duì)引物，分別擴(kuò)增不同的靶基因 不同的探針識(shí)別不同的靶基因 不同的熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記不同的探針 目的 提高效率，節(jié)省時(shí)間 降低研究成本 特點(diǎn) 一次提取DNA/RNA、一次反應(yīng)、定量多個(gè)基因 要保證信號(hào)之間互不干擾,28,技術(shù)研究,常用的熒光染料,29,技

10、術(shù)研究,30,技術(shù)研究,定量PCR的數(shù)學(xué)原理 定量PCR的化學(xué)原理 定量PCR的光學(xué)原理,31,技術(shù)研究,32,技術(shù)研究,33,技術(shù)研究,熒光PCR區(qū)別于其他PCR方法主要有以下優(yōu)點(diǎn),1) 全封閉反應(yīng)，無(wú)需PCR后處理 2) 特異性強(qiáng)，靈敏度高 3) 采用對(duì)數(shù)期分析，摒棄終點(diǎn)數(shù)據(jù)，定量準(zhǔn)確 4) 定量范圍寬，可達(dá)到10個(gè)數(shù)量級(jí) 5) 儀器在線式實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，結(jié)果直觀，避免人為判斷 6) 可實(shí)現(xiàn)一管雙檢或多檢7) 操作安全，縮短時(shí)間，提高效率 8) 利于自動(dòng)化和聯(lián)網(wǎng)管理,34,技術(shù)研究,定量PCR常見(jiàn)問(wèn)題處理,35,技術(shù)研究,擴(kuò)增曲線-Amplification Plot,36,技術(shù)研究,標(biāo)準(zhǔn)曲線-

11、Standard Curve,37,技術(shù)研究,原始數(shù)據(jù)-Component,38,技術(shù)研究,各波長(zhǎng)的原始信號(hào)-Spectra,39,技術(shù)研究,融解曲線-Dissociation,40,技術(shù)研究,定量PCR實(shí)驗(yàn)中的10個(gè)常見(jiàn)缺陷,1.引物或探針的設(shè)計(jì)不過(guò)關(guān) 2.RNA模板質(zhì)量差 3.沒(méi)有使用“預(yù)混液”，導(dǎo)致差異的累積 4.發(fā)生污染 5.沒(méi)有使用無(wú)逆轉(zhuǎn)錄酶的陰性對(duì)照，排除基因組DNA的干擾 6.選取了不恰當(dāng)?shù)摹皟?nèi)參基因” 7.在使用SYBR Green染料的實(shí)驗(yàn)中，沒(méi)有引入“融解曲線分析” 8.沒(méi)有正確設(shè)置“基線”和“閾值線” 9.反應(yīng)體系“擴(kuò)增效率”低下 10.標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍沒(méi)有涵蓋樣品量的變化

12、,41,技術(shù)研究,導(dǎo)致異常實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的常見(jiàn)原因,錯(cuò)誤的熒光染料設(shè)置 錯(cuò)誤的反應(yīng)程序設(shè)置 熒光污染 反應(yīng)試劑質(zhì)量問(wèn)題 儀器硬件問(wèn)題 未正確密封而導(dǎo)致的試劑蒸發(fā),42,技術(shù)研究,實(shí)例1：沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)品沒(méi)有填寫(xiě)相應(yīng)的數(shù)值,43,技術(shù)研究,實(shí)例2：沒(méi)有擴(kuò)增曲線,原因1：PCR參數(shù)設(shè)置錯(cuò)誤 數(shù)據(jù)收集步驟只有一個(gè)循環(huán)，只收集了一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn),44,技術(shù)研究,實(shí)例2：沒(méi)有擴(kuò)增曲線,原因2：硬盤(pán)休眠，數(shù)據(jù)采集中斷,45,技術(shù)研究,實(shí)例3：基線下滑,從原始數(shù)據(jù)找原因 1-9循環(huán)，ROX的信號(hào)下降 基線設(shè)定4-13范圍內(nèi)，ROX信號(hào)值變化，F(xiàn)AM的信號(hào)值基本固定；FAM/ROX的校正后，基線不是水平的直線； 應(yīng)該

13、取ROX信號(hào)穩(wěn)定的10-20循環(huán)為合理的基線范圍,46,技術(shù)研究,實(shí)例3：基線下滑,修改基線范圍為10-20，重新分析,47,技術(shù)研究,實(shí)例3：基線下滑,基線范圍取10-20循環(huán)的數(shù)據(jù)，重新分析后的圖譜,48,技術(shù)研究,實(shí)例4：擴(kuò)增曲線彎曲,原因：基線設(shè)置的終點(diǎn)大于樣品CT值。通常是因?yàn)槟０錎NA濃度過(guò)高，若CT值 15，而基線范圍仍然取3-15其中基線熒光包含部分?jǐn)U增信號(hào)，導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)差偏大，閾值設(shè)定過(guò)高。 解決方案：減小基線終點(diǎn)設(shè)置至最小CT值前4個(gè)循環(huán)，重新分析數(shù)據(jù),49,技術(shù)研究,實(shí)例4：擴(kuò)增曲線彎曲,原因：樣品濃度跨度太大，有的樣品濃度太高，在同一基線設(shè)置情況下，會(huì)導(dǎo)致Ct值太?。ㄐ∮诨?/p>

14、線右側(cè)）的樣品的曲線在右側(cè)下跌。 解決方案：對(duì)于能檢測(cè)出Ct的樣品，讀出數(shù)據(jù)；濃度太高的樣品，需稀釋后另做實(shí)驗(yàn),50,技術(shù)研究,實(shí)例5-1：直線擴(kuò)增曲線,部分探針降解后，部分報(bào)告熒光基團(tuán)從探針上脫落 導(dǎo)致：基線抬高；擴(kuò)增與熒光信號(hào)的增加不一致,51,技術(shù)研究,實(shí)例5-2：直線擴(kuò)增曲線,擴(kuò)增曲線是一根水平直線 說(shuō)明沒(méi)有檢測(cè)到信號(hào)，提示實(shí)驗(yàn)失敗,52,技術(shù)研究,實(shí)例6：非特異性擴(kuò)增,SYBR Green I 實(shí)驗(yàn)，Dissociation curve分析,推薦措施：提高引物設(shè)計(jì)質(zhì)量，避免形成引物二聚體 補(bǔ)救措施：優(yōu)化引物濃度和退火溫度，專(zhuān)設(shè)高溫度的收集信號(hào)步驟,53,技術(shù)研究,實(shí)例7：重復(fù)性不佳,正常的原始數(shù)據(jù),54,技術(shù)研究,實(shí)例7：重復(fù)性不佳,不正常的原始數(shù)據(jù),原因：蓋子未蓋緊，溶液蒸發(fā),55,技術(shù)研究,疾病監(jiān)測(cè)中常用的反應(yīng)Mi