測(cè)序技術(shù)介紹

1、,測(cè)序技術(shù)介紹,測(cè)序技術(shù)發(fā)展史,一代測(cè)序,1954 年，Whitfeld 等用化學(xué)降解法測(cè)定多聚核糖核苷酸序列，是關(guān)于DNA 測(cè)序技術(shù)的較早報(bào)道。 1977 年，Sanger 發(fā)明DNA 雙脫氧核苷酸末端終止測(cè)序法（chain terminator sequencing）， A.M.Maxam 和W. Gilbert 發(fā)明DNA 化學(xué)降解測(cè)序法(chemical degradation sequencing)， 2 項(xiàng)技術(shù)的出現(xiàn)，標(biāo)志第1 代測(cè)序技術(shù)誕生。,Sanger 測(cè)序法的原理,每一次DNA 測(cè)序反應(yīng)都由4 個(gè)獨(dú)立反應(yīng)組成； 由于DNA 雙鏈中核苷酸以3，5-磷酸二酯鍵相連，因此在測(cè)序過(guò)

2、程中摻入2，3-雙脫氧核苷三磷酸ddNTP（不含3-OH），當(dāng)ddNTP 位于DNA 雙鏈的延伸末端時(shí)， 無(wú)羥基3端不能與其他脫氧核苷酸形成3，5-磷酸二酯鍵， 因此，DNA 雙鏈合成便終止； 若在終止位點(diǎn)摻入ddATP，則新生鏈末端為A，若摻入ddTTP、ddCTP、ddGTP，相應(yīng)地，新生鏈末端則是T、C 或G。,該測(cè)序技術(shù)的具體做法如下：將模板、引物、4 種dNTP（其中含有一種為放射性同位素標(biāo)記的核苷酸）與DNA 聚合酶共同保溫，形成的混合物包含許多長(zhǎng)短不一的片段， 最后利用聚丙烯酰胺變性凝膠電泳（SDS-PAGE）分離該混合物，得到放射性同位素自顯影條帶圖譜，人們依據(jù)凝膠電泳圖即可讀

3、出DNA 雙鏈的堿基序列組成。,自動(dòng)化測(cè)序?qū)嶋H上已成為當(dāng)今 dna序列分析的主流。美國(guó)PE ABI公司已生產(chǎn)出373型、377型、310型、3700和3100型等dna測(cè)序儀，其中310型是臨床檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室中使用最多的一種型號(hào)。,測(cè)序過(guò)程中的常見(jiàn)問(wèn)題分析,在進(jìn)行DNA測(cè)序時(shí)，緊接引物的10 30 Bases有時(shí)不一定能完全讀清楚。 由于DNA結(jié)構(gòu)上的原因，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)反應(yīng)中途無(wú)法進(jìn)行之情況。如：G/C rich; G/C Cluster；Poly A、 Poly T的連續(xù)結(jié)構(gòu)等。此外，另一種情況為反應(yīng)中途出現(xiàn)的套峰現(xiàn)象，此種情況一般為DNA結(jié)構(gòu)中的重復(fù)序列，造成測(cè)序用引物和模板之間有二個(gè)以上的結(jié)合

4、位點(diǎn)。具體問(wèn)題分析如下： 1： 測(cè)序結(jié)果有很多套峰，出現(xiàn)很多N值原因分析：PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行測(cè)序，在PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度以后將無(wú)反應(yīng)信號(hào)，機(jī)器將產(chǎn)生許多N值。在序列的起始端出現(xiàn)N值，主要是由于有未去除的染料單體造成的干擾峰，是機(jī)器無(wú)法正確判讀出位何值。有時(shí)，引物二聚體或者起始端小片段的丟失，也會(huì)出現(xiàn)N值。模版本身含雜合序列，有等位基因。,測(cè)序過(guò)程中的常見(jiàn)問(wèn)題分析,2：為什么找不到我的PCR引物序列？用PCR引物作為測(cè)序引物，所測(cè)序列是從引物3末端后第一個(gè)堿基開(kāi)始的，所以就找不到您的測(cè)序引物了?？梢赃M(jìn)行反向測(cè)序，得到引物的反向互補(bǔ)序列。還可以將所測(cè)片段克隆到適當(dāng)載體中，由于通用引物與插入序列有一段距離

5、，就可以測(cè)出您的引物序列。 3：測(cè)序結(jié)果和文獻(xiàn)資料不一樣，為什么?原因有很多，如同一種動(dòng)物，在不同的種族之間，或者不同的個(gè)體之間，基因序列也不一定完全一樣。如果是PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序, 那還有PCR過(guò)程中的錯(cuò)配因素等等。我們提供的測(cè)序結(jié)果是客戶樣品序列的忠實(shí)結(jié)果，不能保證和文獻(xiàn)序列完全一致。 4：過(guò)短的PCR產(chǎn)物為什么不適于直接測(cè)序？首先由于一般的PCR產(chǎn)物純化試劑盒要求產(chǎn)物片段大于200bp,過(guò)短的PCR產(chǎn)物不能進(jìn)行純化；再者，測(cè)序的前50bp和后50bp的序列是不好的，所以不適于直接測(cè)序。,測(cè)序過(guò)程中的常見(jiàn)問(wèn)題分析,5：酒精如果沒(méi)有揮發(fā)完全,在約300bp處會(huì)出現(xiàn)連續(xù)異常的G峰，酒精揮發(fā)時(shí)間

6、過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致DNA斷裂。 第一個(gè)峰，重疊干擾。如果不判讀為干擾峰，那就說(shuō)明樣品不純，如果是基因組DNA，就很好地說(shuō)明了樣品為雜合子，該位點(diǎn)可能存在SNP現(xiàn)象（T/G）。如果判讀為干擾峰，我們只需認(rèn)定樣品此處堿基為T(mén)為行了。 第二個(gè)峰，錯(cuò)位干擾。如果不判讀為干擾峰，則說(shuō)明樣本可能比預(yù)期多一個(gè)堿基（G），如果判讀為干擾峰，我們?nèi)灾恍枵J(rèn)定樣品此處堿基為T(mén)為行了。,測(cè)序過(guò)程中的常見(jiàn)問(wèn)題分析,6：為什么用PCR產(chǎn)物或質(zhì)粒測(cè)序時(shí)，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)套峰現(xiàn)象? 下圖是pGEM-T載體測(cè)序的結(jié)果，在83位點(diǎn)處測(cè)序結(jié)果出現(xiàn)雙峰，即模板中含有兩個(gè)或兩個(gè)以上的相同載體，但是插入片段不同。 解決辦法：重新挑取單克隆或者重新提取

7、質(zhì)粒。需要注意的是，重新進(jìn)行PCR反應(yīng)或者酶切鑒定僅能證明該克隆含有插入片段，并不足以證明模板的單一。,測(cè)序過(guò)程中的常見(jiàn)問(wèn)題分析,7：poly結(jié)構(gòu)的測(cè)序結(jié)果 以polyT為例，在polyA/T結(jié)構(gòu)之后往往出現(xiàn)移碼現(xiàn)象，而在polyG/C之后會(huì)往往導(dǎo)致測(cè)序信號(hào)的衰減。解決辦法：使用反向引物對(duì)模板進(jìn)行測(cè)序，測(cè)到該poly結(jié)構(gòu)處，即可完成模板全長(zhǎng)的拼接。,第二代測(cè)序技術(shù)（Next-Generation Sequencing）,各自的優(yōu)點(diǎn),454 測(cè)序平臺(tái)得到的片段能夠達(dá)到400 bp，并且讀長(zhǎng)的質(zhì)量高； Solexa 測(cè)序平臺(tái)的性價(jià)比最高，在數(shù)據(jù)量相同的情況下，測(cè)序成本僅為454 測(cè)序平臺(tái)的1/10

8、； SOLiD 測(cè)序平臺(tái)準(zhǔn)確度能夠達(dá)到99.94%，在片段覆蓋率為15時(shí)，測(cè)序準(zhǔn)確度可接近100%。,2005年底，454公司推出第一個(gè)基于焦磷酸測(cè)序原理的高通量基因組測(cè)序系統(tǒng)Genome Sequencer 20 System，這是核酸測(cè)序技術(shù)發(fā)展史上里程碑式的事件。隨后，羅氏公司以1.55億美元收購(gòu)了454公司，并在2006年推出了更新的GS FLX測(cè)序系統(tǒng)，該系統(tǒng)可在10小時(shí)的運(yùn)行中獲得100萬(wàn)條讀長(zhǎng)（reads），46億個(gè)堿基信息（base pair），且準(zhǔn)確率達(dá)到99%以上。2008年，GS FLX系統(tǒng)再次升級(jí)，通量提高了5倍，讀長(zhǎng)和準(zhǔn)確率也有所增加。雖然454 GS測(cè)序平臺(tái)也許不是

9、市場(chǎng)占有率最高的測(cè)序儀，但截至2011年3月，利用該系統(tǒng)進(jìn)行研究的論文已發(fā)表超過(guò)1000余篇，而它在讀長(zhǎng)上的優(yōu)勢(shì)明顯勝于另兩套系統(tǒng)，因此在從頭測(cè)序（de novo）和宏基因組測(cè)序（meta genome）方面有著不可替代的地位。,2006年，Solexa公司也推出了自己的NGS系統(tǒng)Genome Analyzer，簡(jiǎn)稱GA。這套基于DNA簇（DNA cluster）、橋式PCR（Bridge PCR）和可逆阻斷（Reversible terminator）等核心技術(shù)的系統(tǒng)具有高通量、低錯(cuò)誤率、低成本、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。2007年，Illumina公司以6億美元的高價(jià)收購(gòu)了Solexa，使GA得以

10、商品化。GA最早期的版本一次運(yùn)行可獲得1Gb的數(shù)據(jù)，因此也有1Gb Analyzer的含義，而最新的Hiseq2000平臺(tái)則能夠在10天的運(yùn)行中獲得300Gb以上的數(shù)據(jù)，讀取的堿基長(zhǎng)度達(dá)到150bp左右。更有消息稱，Illumina已完成了600Gb的運(yùn)行測(cè)試并在部分客戶中開(kāi)展了前期體驗(yàn)，Tb（1000Gb）級(jí)的測(cè)試Run也將于年內(nèi)進(jìn)行。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，Illumina公司已售出超過(guò)600臺(tái)/套GA IIx和Hiseq2000平臺(tái)，2010年僅深圳華大基因研究院一家就購(gòu)買了128臺(tái)Hiseq2000，一舉成為全球最大的基因組測(cè)序與分析中心，Illumina公司在測(cè)序領(lǐng)域的影響力由此可見(jiàn)一斑。,在

11、Sanger測(cè)序時(shí)代，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（ABI）一直是該行業(yè)的龍頭老大，其壟斷地位無(wú)人能撼，從早期的377到全自動(dòng)化的3730 xl，ABI的測(cè)序儀被廣泛應(yīng)用在基因組學(xué)研究的各個(gè)方面。然而在第二代測(cè)序技術(shù)迅猛發(fā)展之初，ABI起步較晚，顯得有些漫不經(jīng)心。直到2005年454公司推出GS平臺(tái)，ABI的領(lǐng)先地位受到威脅，這才開(kāi)始發(fā)力，迅速收購(gòu)了研發(fā)NGS的一家小公司Agencourt，并于2007年推出了它的SOLiD測(cè)序平臺(tái)。此后SOLiD不斷升級(jí)，目前已到SOLiD 5版本（SOLiD 5500 xl）。SOLiD的全稱是Sequencing by Oligo Ligation Detect

12、ion，即寡聚物連接檢測(cè)測(cè)序，其基本原理是通過(guò)熒光標(biāo)記的8堿基單鏈DNA探針與模板配對(duì)連接，發(fā)出不同的熒光信號(hào)，從而讀取目標(biāo)序列的堿基排列順序。在該方法下，目標(biāo)序列的所有堿基都被讀取了兩遍，因此SOLiD最大的優(yōu)勢(shì)就是它的高準(zhǔn)確率。據(jù)悉，SOLiD 5平臺(tái)的測(cè)序通量已達(dá)到30Gb/天，成本低于60美元/Gb，準(zhǔn)確率高達(dá)99.99%。并且由于SOLiD系統(tǒng)采用的不是PCR反應(yīng)進(jìn)行DNA合成與測(cè)序，因此對(duì)于高GC含量的樣本，SOLiD系統(tǒng)具有非常大的優(yōu)勢(shì)。,2021/3/26,454測(cè)序原理,焦磷酸測(cè)序法（Pyrosequencing)的原理,2021/3/26,454測(cè)序原理,焦磷酸測(cè)序法（Py

13、rosequencing)的原理,2021/3/26,454測(cè)序原理,焦磷酸測(cè)序法（Pyrosequencing)的原理,2021/3/26,454測(cè)序原理,在454測(cè)序儀中，A、T、G、C四種堿基是分別存儲(chǔ)在單獨(dú)的試劑瓶中的，每步反應(yīng)四種堿基依次加入反應(yīng)池，當(dāng)堿基配對(duì)結(jié)合，就會(huì)釋放出一個(gè)焦磷酸（PPi），而這個(gè)焦磷酸在酶的作用下，將熒光素氧化成氧化熒光素，并發(fā)出光信號(hào)，從而讀取出這一位置的堿基信息。 454測(cè)序儀的整個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟可大致概括為： 樣品處理 文庫(kù)制備 emPCR 反應(yīng)板準(zhǔn)備 上機(jī)測(cè)序,2021/3/26,454測(cè)序原理,樣品處理： 樣品處理主要是針對(duì)大片段的DNA分子，如基因組DN

14、A、Fosmid或BAC質(zhì)粒等，利用超聲或氮?dú)獯驍鄬⑦@些DNA分子片段化，然后采用瓊脂糖凝膠電泳回收或磁珠純化，選擇500-800bp的DNA片段。對(duì)于非編碼RNA或PCR產(chǎn)物，則不需要這一步驟。,2021/3/26,454測(cè)序原理,文庫(kù)制備包括接頭連接和磁珠純化兩步，454的文庫(kù)接頭分A、B兩種，各44bp，由20bp的PCR引物、20bp的測(cè)序引物及4bp（TCAG）的“key”堿基構(gòu)成，其中B接頭的5端帶有生物素（Biotin）標(biāo)記，用于磁珠純化步驟。經(jīng)過(guò)磁珠結(jié)合與DNA變性之后，只有A+目的片段+B形式的連接產(chǎn)物得以富集，另兩種形式（AA、BB）的產(chǎn)物都被去除。,2021/3/26,4

15、54測(cè)序原理,emPCR（乳液PCR)是454測(cè)序的一個(gè)關(guān)鍵步驟，將富集到的文庫(kù)與測(cè)序磁珠、各反應(yīng)物混合，加入特定的礦物油和表面活性劑，再利用振蕩器劇烈振蕩，使反應(yīng)體系形成油包水（water-in-oil）的穩(wěn)定乳濁液。在理想條件下，每一個(gè)液滴，或稱微反應(yīng)器（microreactor）中將只包含一個(gè)磁珠和一條單鏈DNA，通過(guò)控制該步驟的條件，1mL乳液中可以形成至少10的6次方個(gè)理想的微反應(yīng)器。經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后，每一個(gè)磁珠上將形成密集的DNA簇，這些DNA序列完全相同，即可用于后續(xù)的步驟。隨后，乳液混合物被打破，擴(kuò)增的片段依然結(jié)合在磁珠上。,2021/3/26,454測(cè)序原理,454測(cè)序的反應(yīng)

16、板稱為PTP（Pico Titer Plate），含有350萬(wàn)個(gè)由光纖組成的小孔，每個(gè)孔的直徑為29m，而測(cè)序磁珠的直徑為20m，因此每個(gè)孔中僅能容納一個(gè)磁珠。將磁珠與測(cè)序試劑加入PTP中，使之可用于上機(jī)測(cè)序。,2021/3/26,454測(cè)序原理,測(cè)序步驟如前所述，四種堿基在泵的控制下依次加入反應(yīng)板，反應(yīng)完成后再洗去，每延伸一個(gè)或若干個(gè)堿基，就會(huì)發(fā)出一次光信號(hào)，通過(guò)記錄信號(hào)的有無(wú)和強(qiáng)度，即可測(cè)定DNA序列。,2021/3/26,2021/3/26,454測(cè)序原理,優(yōu)缺點(diǎn)： 454測(cè)序準(zhǔn)確度較高，當(dāng)讀長(zhǎng)超過(guò)400bp時(shí)，其準(zhǔn)確性仍能達(dá)到99%以上； 主要的錯(cuò)誤來(lái)自于同聚物，即相同堿基的連續(xù)延伸，

17、如ATTTG這樣一段序列，A和G的讀取沒(méi)有問(wèn)題，但T只記錄了一次光信號(hào)，僅信號(hào)強(qiáng)度與ATG序列的T有所不同，因此同聚物越長(zhǎng)，可能產(chǎn)生的誤差就越大。 目前，由于454測(cè)序儀在讀長(zhǎng)上的明顯優(yōu)勢(shì)，它在大基因組從頭測(cè)序（de novo）、轉(zhuǎn)錄組分析、基因組結(jié)構(gòu)分析等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。,2021/3/26,Solexa測(cè)序,2021/3/26,Solexa測(cè)序,常用術(shù)語(yǔ)： SBS：邊合成邊測(cè)序反應(yīng)，每次SBS會(huì)延伸一個(gè)堿基，大約耗時(shí)70分鐘。 Run：?jiǎn)未紊蠙C(jī)測(cè)序反應(yīng)，可以產(chǎn)生4G-75G測(cè)序通量不等。 Lane：?jiǎn)斡镜?，每條泳道可以直接物理區(qū)分測(cè)序樣品，1次run最多可以同時(shí)上樣8條Lane。 Ch

18、annel：Lane的同義詞。 Tile：小區(qū)，每條Lane中排有2列tile，合計(jì)120個(gè)小區(qū)。每個(gè)小區(qū)上分布數(shù)目繁多的簇結(jié)合位點(diǎn)。 Cluster：簇，在Solexa測(cè)序技術(shù)中會(huì)采用橋式PCR方式生產(chǎn)DNA簇，每個(gè)DNA簇才能產(chǎn)生亮度達(dá)到CCD可以分辨的熒光點(diǎn)。,2021/3/26,Solexa測(cè)序,Index：標(biāo)簽，在Solexa多重測(cè)序（Multiplexed Sequencing）過(guò)程中會(huì)使用Index來(lái)區(qū)分樣品，并在常規(guī)測(cè)序完成后，針對(duì)Index部分額外進(jìn)行7個(gè)循環(huán)的測(cè)序，通過(guò)Index的識(shí)別，可以在1條Lane中區(qū)分12種不同的樣品。 Barcode: Index同義詞 Fast

19、a：一種序列存儲(chǔ)格式。一個(gè)序列文件若以FASTA格式存儲(chǔ)，則每一條序列的第一行以“”開(kāi)頭，而跟隨“”的是序列的ID號(hào)（即唯一的標(biāo)識(shí)符）及對(duì)該序列的描述信息；第二行開(kāi)始是序列內(nèi)容，序列短于61nt的，則一行排列完；序列長(zhǎng)于61nt的，則每行存儲(chǔ)61nt，最后剩下小于61nt的，在最后一行排列完；第二條序列另起一行，仍然由“”和序列的ID號(hào)開(kāi)始，以此類推。,2021/3/26,Solexa測(cè)序,Fastq：Fastq是Solexa測(cè)序技術(shù)中一種反映測(cè)序序列的堿基質(zhì)量的文件格式。第一行以“”符號(hào)開(kāi)頭，后面緊跟一個(gè)序列的描述信息；第二行是該序列的內(nèi)容；第三行以“+”符號(hào)開(kāi)頭，后面緊跟的內(nèi)容與第一行一樣

20、，同樣是該序列的描述信息；而第四行是第二行中的序列內(nèi)容每個(gè)堿基所對(duì)應(yīng)的測(cè)序質(zhì)量值。 PF%：PF%是指符合測(cè)序質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的簇的百分比（Multiplexed Sequencing），與測(cè)序的通量相關(guān)聯(lián)。 Read：Solexa是成簇反應(yīng)的，每個(gè)簇對(duì)應(yīng)一條DNA序列片段，成為一個(gè)read。,2021/3/26,Solexa測(cè)序,2021/3/26,Solexa測(cè)序,2021/3/26,Solexa測(cè)序,2021/3/26,Solexa測(cè)序,2021/3/26,Solexa測(cè)序,2021/3/26,Solexa測(cè)序,2021/3/26,Solexa測(cè)序,2021/3/26,Solexa測(cè)序,2021

21、/3/26,Solexa測(cè)序,應(yīng)用： Solexa平臺(tái)的應(yīng)用范圍極廣，幾乎囊括了目前基因組學(xué)研究的所有方面，例如基因組從頭測(cè)序（de novo）、重測(cè)序（re-sequencing）、基因組結(jié)構(gòu)分析、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、表達(dá)譜分析、小RNA及非編碼RNA測(cè)序、表觀遺傳學(xué)研究等等。,2021/3/26,SOLiD測(cè)序,2021/3/26,SOLiD測(cè)序,2021/3/26,SOLiD測(cè)序,2021/3/26,SOLiD測(cè)序,2021/3/26,SOLiD測(cè)序,2021/3/26,SOLiD測(cè)序,2021/3/26,SOLiD測(cè)序,2021/3/26,SOLiD測(cè)序,2021/3/26,SOLiD測(cè)序,2

22、021/3/26,SOLiD測(cè)序,2021/3/26,SOLiD測(cè)序,2021/3/26,SOLiD測(cè)序,2021/3/26,SOLiD測(cè)序,2021/3/26,SOLiD測(cè)序,2021/3/26,SOLiD測(cè)序,2021/3/26,SOLiD測(cè)序,2021/3/26,三者比較,測(cè)序技術(shù)讀取長(zhǎng)度（），在種測(cè)序技術(shù)中最長(zhǎng)，可以對(duì)未知基因組進(jìn)行從頭測(cè)序，但其通量最低（）。當(dāng)遇到（如 等）時(shí)，堿基個(gè)數(shù)和熒光信號(hào)強(qiáng)度不成線性關(guān)系，即判斷重復(fù)堿基有困難。,2021/3/26,三者比較,屬于高度自動(dòng)化的系統(tǒng)，讀取片段比其它種類的測(cè)序多，適合進(jìn)行大量小片段的測(cè)序（如），其測(cè)序通量大，其新機(jī)型產(chǎn)出量為，但基于

23、可逆反應(yīng)時(shí)隨反應(yīng)輪數(shù)增加效率降低、信號(hào)減弱，并且讀長(zhǎng)（通常為）比短，給從頭測(cè)序拼接帶來(lái)困難。,2021/3/26,三者比較,技術(shù)每個(gè)堿基讀取次，有非常高的準(zhǔn)確性，特別是針對(duì)的檢測(cè)。此外，靈活的系統(tǒng)和完善的磁珠編碼系統(tǒng)可以進(jìn)行樣品的來(lái)分割測(cè)序區(qū)域，特別適用于具有高質(zhì)量參考基因組序列物種的重測(cè)序，但是該測(cè)序讀長(zhǎng)（）最短，并且讀取長(zhǎng)度受反應(yīng)輪數(shù)的限制，給從頭測(cè)序拼接帶來(lái)困難。,2021/3/26,第三代測(cè)序技術(shù),原理： 脫氧核苷酸用熒光標(biāo)記，顯微鏡可以實(shí)時(shí)記錄熒光的強(qiáng)度變化。當(dāng)熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸被摻入DNA鏈的時(shí)候，它的熒光就同時(shí)能在DNA鏈上探測(cè)到。當(dāng)它與DNA鏈形成化學(xué)鍵的時(shí)候，它的熒光基團(tuán)就被DNA聚合酶切除，熒光消失。這種熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸不會(huì)影響DNA聚合酶的活性，并且在熒光被切除之后，合成的DNA鏈和天然的DNA