細(xì)胞復(fù)蘇與凍存

1、關(guān)于細(xì)胞復(fù)蘇細(xì)胞冷凍保存與復(fù)蘇原理 三木 轉(zhuǎn)自 體外培養(yǎng)的原理和技術(shù). 薛慶善 主編. 2001年2月.科學(xué)出版社, pp128-136 細(xì)胞冷凍保存與復(fù)蘇原理在低于-700C的超低溫條件下，有機(jī)體細(xì)胞內(nèi)部的生化反應(yīng)極其緩慢，甚至終止。因此，采取適當(dāng)?shù)姆椒▽⑸锊牧辖抵脸蜏?，即可使生命活動固定在某一階段而不衰老死亡。當(dāng)以適當(dāng)?shù)姆椒▽龃娴纳锊牧匣謴?fù)至常溫時，其內(nèi)部的生化反應(yīng)可恢復(fù)正常。所謂冷凍保存，就是將體外培養(yǎng)物或生物活性材料懸浮在加有或不加冷凍保護(hù)劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度（一般是低于-700C的超低溫條件），并在此溫度下對其長期保存的過程。而復(fù)蘇就是以一定的復(fù)溫速率

2、將凍存的體外培養(yǎng)物或生物活性材料恢復(fù)到常溫的過程。不論是微生物、動物細(xì)胞、植物細(xì)胞還是體外培養(yǎng)的器官都可以進(jìn)行凍存，并在適當(dāng)條件下復(fù)蘇。 水在低于零度的條件下會結(jié)冰。如果將細(xì)胞懸浮在純水中，隨著溫度的降低，細(xì)胞內(nèi)外的水分都會結(jié)冰，所形成的冰晶會造成細(xì)胞膜和細(xì)胞器的破壞而引起細(xì)胞死亡。這種因細(xì)胞內(nèi)部結(jié)冰而導(dǎo)致的細(xì)胞損傷稱為細(xì)胞內(nèi)冰晶的損傷。如果將細(xì)胞懸浮在溶液中，隨著溫度的降低，細(xì)胞外部的水分會首先結(jié)冰，從而使得未結(jié)冰的溶液中電解質(zhì)濃度升高。如果將細(xì)胞暴露在這樣高溶質(zhì)的溶液中且時間過長，細(xì)胞膜上脂質(zhì)分子會受到損壞，細(xì)胞便發(fā)生滲漏，在復(fù)溫時，大量水分會因此進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，造成細(xì)胞死亡。這種因保存溶液中

3、溶質(zhì)濃度升高而導(dǎo)致的細(xì)胞損傷稱為溶質(zhì)損傷或稱溶液損傷。當(dāng)溫度進(jìn)一步下降，細(xì)胞內(nèi)外都結(jié)冰，產(chǎn)生冰晶損傷。但是如果在溶液中加入冷凍保護(hù)劑，則可保護(hù)細(xì)胞免受溶質(zhì)損傷和冰晶損傷。因?yàn)槔鋬霰Ｗo(hù)劑容易同溶液中的水分子結(jié)合，從而降低冰點(diǎn)，減少冰晶的形成，并且通過其摩爾濃度降低未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，使細(xì)胞免受溶質(zhì)損傷，細(xì)胞得以在超低溫條件下保存。在復(fù)蘇時，一般以很快的速度升溫，1-2分鐘內(nèi)即恢復(fù)到常溫，細(xì)胞內(nèi)外不會重新形成較大的冰晶，也不會暴露在高濃度的電解質(zhì)溶液中過長的時間，從而無冰晶損傷和溶質(zhì)損傷產(chǎn)生，凍存的細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后仍保持其正常的結(jié)構(gòu)和功能。冷凍保護(hù)劑對細(xì)胞的冷凍保護(hù)效果還與冷凍速率、冷凍溫度和復(fù)

4、溫速率有關(guān)。而且不同的冷凍保護(hù)劑其冷凍保護(hù)效果也不一樣。 冷凍速率 冷凍速率是指降溫的速度，直接關(guān)系到冷凍效果。細(xì)胞在冷凍過程中會發(fā)生如下變化：當(dāng)細(xì)胞被冷至-50C時，因溶液中加有冷凍保護(hù)劑而降低溶液的冰點(diǎn)，細(xì)胞內(nèi)外溶液仍未結(jié)冰；當(dāng)被冷至-5-150C之間時，細(xì)胞外溶液先出現(xiàn)結(jié)冰而細(xì)胞內(nèi)仍保持未結(jié)冰狀態(tài)。細(xì)胞內(nèi)未結(jié)冰的水分子會比細(xì)胞外部分結(jié)冰溶液中的水分子具有更高的化學(xué)能。其結(jié)果是，細(xì)胞內(nèi)水分子為了和細(xì)胞外水分子保持化學(xué)能的平衡，會向細(xì)胞外流動。冷凍速度不同，細(xì)胞內(nèi)水分向外流動的情況也不相同：如果冷凍速度慢，細(xì)胞內(nèi)水分外滲多，細(xì)胞脫水，體積縮小，細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)濃度增高，細(xì)胞內(nèi)不會發(fā)生結(jié)冰；如果冷凍

5、速度快，細(xì)胞內(nèi)水分沒有足夠的時間外滲，結(jié)果隨著溫度的下降而發(fā)生細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰；如果冷凍速度非?？欤闯焖倮鋬觯?，則細(xì)胞內(nèi)形成的冰晶非常小或不結(jié)冰而呈玻璃狀態(tài)（玻璃化冷凍）。Luyet（1973）證實(shí)液體的凝固可分為兩種形式：一種是晶體化，溶液中的分子呈有序排列；另一種情況是非晶體即玻璃化，液體中的分子呈無序狀態(tài)，保持未凝固前的狀態(tài)。 不同的冷凍速度既然能使細(xì)胞內(nèi)發(fā)生不同的生理變化，也可以對細(xì)胞產(chǎn)生不同的損傷。當(dāng)冷凍速度過慢時，細(xì)胞脫水嚴(yán)重，細(xì)胞體積嚴(yán)重收縮，超過一定程度時即失去活性。同時冷凍速度過慢，還會引起細(xì)胞外溶液部分結(jié)冰，從而使細(xì)胞外未結(jié)冰的溶液中溶質(zhì)濃度增高，產(chǎn)生溶質(zhì)損傷。當(dāng)冷凍速度過快

6、時，細(xì)胞內(nèi)水分來不及外滲，會形成較到冰晶，造成細(xì)胞膜及細(xì)胞器的破壞，產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)冰晶損傷。超快速玻璃化冷凍對細(xì)胞存活來說是最為理想的冷凍方法。細(xì)胞內(nèi)外呈玻璃化凝固，無冰晶形成或形成很小的冰晶，對細(xì)胞膜和細(xì)胞器不致造成損傷，細(xì)胞也不會在高濃度的溶質(zhì)中長時間暴露而受損。 不同細(xì)胞的最適冷凍速率不同。小鼠骨髓干細(xì)胞、酵母、人紅細(xì)胞的最適冷凍速率分別為1.60C/min、70C/min和2000C/min。細(xì)胞與細(xì)胞之間的最適冷凍速率可在1.60C3000C/min，故對一種細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存之前，首先需要測定其最適冷凍速率，以保證獲得最高的冷凍存活率。 冷凍保存溫度 冷凍保存溫度是指能長期保存細(xì)胞的超低

7、溫度，在此溫度下，細(xì)胞生化反應(yīng)極其緩慢甚至停止，但經(jīng)過長期保存，在復(fù)蘇后仍能保持正常的結(jié)構(gòu)和功能。 不同的細(xì)胞和生物體以及使用不同的冷凍保存方法要取得同樣的冷凍保存效果，冷凍保存溫度可以不同。但從實(shí)際和效益的觀點(diǎn)出發(fā)，液氮溫度（-1960C）是 目前最佳的冷凍保存溫度。在-1960C時，細(xì)胞的生命活動幾乎完全停止，但復(fù)蘇后細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能完好。如果冷凍過程得當(dāng)，一般生物樣品在-1960C下均可保存十年以上。應(yīng)用-700C-800C保存細(xì)胞，短期內(nèi)對細(xì)胞的活性無明顯影響，但隨著凍存時間延長，細(xì)胞存活率明顯降低。在冰點(diǎn)到-400C范圍內(nèi)保存細(xì)胞的效果不佳。 復(fù)蘇速率 冷凍保護(hù)體外培養(yǎng)物，除了必須有

8、最佳的冷凍速率、合適的冷凍保護(hù)劑和凍存溫度外，在復(fù)蘇時也必須有最佳的復(fù)溫速率，這樣才能保證最后獲得最佳冷凍保存效果。 復(fù)溫速率是指在細(xì)胞復(fù)蘇時溫度升高的速度。復(fù)溫速率不當(dāng)也會降低凍存細(xì)胞存活率。一般來說，復(fù)溫速度越快越好。常規(guī)的做法是，在370C水浴中，于1-2分鐘內(nèi)完成復(fù)蘇。復(fù)溫速度過慢，細(xì)胞內(nèi)往往重新形成較大冰晶而造成細(xì)胞損傷。復(fù)溫時造成的細(xì)胞損傷非?？欤跇O短的時間內(nèi)發(fā)生。 冷凍保護(hù)劑 冷凍保護(hù)劑是指可以保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷的物質(zhì)。冷凍保護(hù)劑常常配制成一定的溶液。一般來講，只有紅細(xì)胞、大多數(shù)微生物和極少數(shù)有核的哺乳動物細(xì)胞懸浮在不加冷凍保護(hù)劑的水或簡單的鹽溶液中，并以最適的冷凍速率冷

9、凍，可以獲得活的凍存物。但對于大多數(shù)有核哺乳動物細(xì)胞來說，在不加冷凍保護(hù)劑的情況下，無最適冷凍速率可言，也不能獲得活的冷凍物。例如將小鼠骨髓細(xì)胞懸浮在不加冷凍保護(hù)劑的平衡鹽溶液中，并以0.36000C/min的冷凍速率降溫冷凍，98%以上的細(xì)胞會死亡；而加入甘油冷凍保護(hù)劑進(jìn)行冷凍保存時，98%以上的細(xì)胞都可存活。 冷凍保護(hù)劑可分為滲透性和非滲透性兩類。滲透性冷凍保護(hù)劑可以滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是一些小分子物質(zhì)，主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保護(hù)機(jī)制是在細(xì)胞冷凍懸液完全凝固之前，滲透到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生一定的摩爾濃度，降低細(xì)胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，從而保護(hù)細(xì)胞

10、免受高濃度電解質(zhì)的損傷，同時，細(xì)胞內(nèi)水分也不會過分外滲，避免了細(xì)胞過分脫水皺縮。甘油和DMSO并不防止細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰，在使用該類冷凍保護(hù)劑時，需要一定的時間進(jìn)行預(yù)冷，讓甘油或DMSO等成分滲透到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)外達(dá)到平衡以起到充分的保護(hù)作用。目前DMSO的應(yīng)用比甘油更為廣泛，但要注意的是，DMSO在常溫下對細(xì)胞的毒性作用較大，而在40C時，其毒性作用大大減弱，且仍能以較快的速度滲透到細(xì)胞內(nèi)。所以，凍存時DMSO平衡多在40C下進(jìn)行，一般需要4060分鐘。 非滲透性冷凍保護(hù)劑不能滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是些大分子物質(zhì)，主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羥乙基淀粉等。其保護(hù)

11、機(jī)制的假說很多，其中有一種可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物質(zhì)可以優(yōu)先同溶液中水分子結(jié)合，降低溶液中自由水的含量，使冰點(diǎn)降低，減少冰晶的形成；同時，由于其分子量大，使溶液中電解質(zhì)濃度降低，從而減輕溶質(zhì)損傷。 不同的冷凍保護(hù)劑有不同的優(yōu)、缺點(diǎn)。目前一般多采用聯(lián)合使用兩種以上冷凍保護(hù)劑組成保護(hù)液。由于許多冷凍保護(hù)劑（如DMSO）在低溫下能保護(hù)細(xì)胞，但在常溫下卻對細(xì)胞有害，故在細(xì)胞復(fù)溫后應(yīng)及時洗滌冷凍保護(hù)劑。 冷凍保存方法 按照冷凍保護(hù)液在凍結(jié)后是否形成冰晶來劃分，凍存方法可分為非玻璃化和玻璃化凍存兩種。非玻璃化凍存是利用各種溫級的冰箱分階段降溫至-700C-800C，然后直接投入液氮進(jìn)行保存；或者是

12、利用電子計(jì)算機(jī)程控降溫儀以及利用液氮的氣、液，按一定的降溫速率從室溫降至-1000C以下，再直接投入液氮保存的方法。以該種方法凍結(jié)的細(xì)胞懸液或多或少都有冰晶的形成。玻璃化凍存則是指利用多種高濃度的冷凍保護(hù)劑聯(lián)合形成的玻璃化冷凍保護(hù)液保護(hù)懸浮細(xì)胞，直接投入液氮進(jìn)行凍存的方法。以該中方法凍結(jié)的細(xì)胞懸液沒有冰晶的形成。但目前細(xì)胞凍存最常用的仍是前一種方法。 非玻璃化凍存方法 下面以腫瘤細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞為例，介紹非玻璃化凍存細(xì)胞的詳細(xì)過程。 主要材料 （1）儀器設(shè)備：普通冰箱、-300C低溫冰箱和-700C-800C超低溫冰箱、液氮凍存罐、高速離心機(jī)、電子計(jì)算機(jī)程控降溫儀等； （2）凍存管：容量為1m

13、l或1.5ml； （3）冷凍保護(hù)液：一般是以9份小牛血清或細(xì)胞培養(yǎng)液與1份DMSO混合而成?，F(xiàn)配現(xiàn)用，或配制后防入普通冰箱冰盒內(nèi)冷凍保存。使用前，于室溫下水浴溶解； （4）待凍存細(xì)胞：各種腫瘤細(xì)胞或雜交瘤細(xì)胞。 操作過程 1. 待凍存細(xì)胞懸液的制備 (1) 按常規(guī)方法消化處于對數(shù)生長期的細(xì)胞培養(yǎng)物，制備單細(xì)胞懸液，并計(jì)算細(xì)胞總數(shù)； (2) 將細(xì)胞懸液以8001000r/min離心5min，去上清夜； (3) 向細(xì)胞沉淀物中加入冷凍保護(hù)液，輕輕吹打混勻，使細(xì)胞密度達(dá)11061107個/ml； (4) 按每管11.5ml的量分裝于凍存管內(nèi)，擰緊管蓋； (5) 再凍存管上做好標(biāo)記，包括細(xì)胞代號及凍存

14、日期。 2. 分級冷凍 (1) 先將凍存管放入普通冰箱冷藏室（480C），約40min； (2) 接著將凍存管置于普通冰箱冷凍室（-100C-200C），約3060min； (3) 將凍存管轉(zhuǎn)入低溫冰箱（-300C），放置30min左右； (4) 然后將凍存管轉(zhuǎn)移到超低溫冰箱（-700C-800C），過夜； (5) 最后將凍存管投入液氮保存。 3. 記錄 做好凍存記錄。記錄內(nèi)容包括凍存日期、細(xì)胞代號、凍存管數(shù)、凍存過程中降溫的情況、凍存位置以及操作人員。 凍存結(jié)果 如此凍存的細(xì)胞，其存活率可達(dá)90%以上。 討論 在使用DMSO前，不要對其進(jìn)行高壓滅菌，因其本身就有滅菌作用。高壓滅菌反而會破壞其

15、分子結(jié)構(gòu)，以致降低冷凍保護(hù)效果。在常溫下，DMSO對人體有毒，故在配制時最好帶手套。 在將細(xì)胞凍存管投入液氮時，動作要小心、輕巧，以免液氮從液氮罐內(nèi)濺出。若液氮濺出，可能對皮膚造成凍傷。操作過程中最好帶防凍手套、面罩、工作衣或防凍鞋。 應(yīng)注意控制凍存細(xì)胞的質(zhì)量。既要在凍存前保障細(xì)胞具有高活力，還要確保無微生物污染，這樣的細(xì)胞才具有凍存價值。另外，在每批細(xì)胞凍存一段時間后，要復(fù)蘇12管，以觀察其活力以及是否受到微生物的污染。 凍存管宜采用塑料凍存管，不宜使用玻璃安瓿。因?yàn)樵趶?fù)蘇時，需要從-1960C的液氮中取出凍存管，立即投入37400C溫水中，溫差很大，玻璃安瓿瓶容易爆炸而發(fā)生危險。 玻璃化凍

16、存方法 以下以人單核細(xì)胞為例說明這種細(xì)胞凍存方法（Takhashi et al. 1986）。 主要材料 （1）冷凍保護(hù)液：為Hanks平衡鹽溶液加入20.5%DMSO（w/v）、15.5%乙酰胺（w/v）、10%丙二醇（w/v）和10%聚乙二醇（Mr 8000）而成。用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4，現(xiàn)配現(xiàn)用。 （2）凍存管：SILASTIC玻璃小管，內(nèi)徑3mm，外徑4.5mm； （3）設(shè)備：液氮儲存罐； （4）待凍存細(xì)胞：人類外周血單核細(xì)胞。 凍存過程 （1） 用常規(guī)方法分離全血中單核細(xì)胞； （2） 在冰浴中預(yù)冷冷凍保護(hù)液； （3） 將裝有單核細(xì)胞的離心管放置入盛有冰水的燒杯內(nèi)（

17、冰?。?（4） 沿離心管壁緩慢滴加預(yù)冷的冷凍保護(hù)液。滴加過程為：前3min以0.3ml/min速度滴加，后5min以0.6ml/min速度滴加，余下的凍存液以0.75ml/min速度滴加。2107個細(xì)胞要滴加15ml凍存液。滴加的時間在15min左右。最終細(xì)胞密度要在11061.5106個細(xì)胞/ml，邊滴加邊輕輕晃動離心管； （5） 輕輕吹吸混勻細(xì)胞冷凍懸液； （6） 將細(xì)胞冷凍懸液分裝于凍存管中。12cm長的凍存管裝0.8ml細(xì)胞冷凍懸液； （7） 將凍存管兩端以火焰封口； （8） 最后將凍存管直接投入液氮中保存。降溫速度約為6000C/min。 凍存結(jié)果 如此凍存的細(xì)胞，其存活率可達(dá)90

18、%以上。 討論 玻璃化凍存法對細(xì)胞活性的保存具有較好的效果，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，具有液氮儲存設(shè)備即可使用。目前，該方法已在胚胎冷凍方面得到廣泛應(yīng)用，但很少應(yīng)用于一般細(xì)胞的凍存。這可能與需要配制較復(fù)雜的凍存液以及冷凍前和復(fù)蘇后較煩瑣的操作有關(guān)。 因?yàn)椴ＡЩ鋬霰Ｗo(hù)液中的冷凍保護(hù)劑的濃度較高，室溫下對細(xì)胞具有毒性（但在40C時毒性大為減弱）。所以，冷凍保護(hù)液的滴加全過程必須在40C冰浴中進(jìn)行。另外，滴加速度要緩慢，如果滴加速度過快，則在細(xì)胞外產(chǎn)生很高的滲透壓，造成細(xì)胞膜的損傷，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，故要緩慢滴加，讓冷凍保護(hù)劑有足夠的時間緩慢滲透到細(xì)胞內(nèi)，達(dá)到細(xì)胞內(nèi)外的平衡。 凍存細(xì)胞的復(fù)蘇 非玻璃化凍存

19、的復(fù)蘇方法 主要材料 （1） 儀器設(shè)備：恒溫水浴箱、高速離心機(jī)； （2） 培養(yǎng)用液：完全培養(yǎng)液。 復(fù)蘇過程 （1） 調(diào)配370C400C的溫水，或?qū)⒑銣厮∠涞臏囟日{(diào)節(jié)至370C400C； （2） 從液氮中取出凍存管，立即投入370C400C 溫水中迅速晃動，直至凍存液完全溶解； （3） 將細(xì)胞凍存懸液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，加入約5ml培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻； （4） 將細(xì)胞懸液經(jīng)8001000r/min離心5min，棄上清夜； （5） 向細(xì)胞沉淀內(nèi)加入完全培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶內(nèi)，補(bǔ)足培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。 結(jié)果 復(fù)蘇后的細(xì)胞應(yīng)該保持其凍存時的活力，活細(xì)胞數(shù)達(dá)90%以上。 討論 細(xì)胞

20、凍存懸液一旦融解后，要盡快離心除去冷凍保護(hù)液，防止冷凍保護(hù)劑對細(xì)胞產(chǎn)生毒性。實(shí)驗(yàn)人員在復(fù)蘇細(xì)胞過程中，同樣應(yīng)具有自我保護(hù)意識，避免被液氮凍傷。 玻璃化凍存的復(fù)蘇方法 以下以人的單核細(xì)胞為例說明其過程（Takhashi et al. 1986）。 主要材料 （1）設(shè)備：高速離心機(jī)； （2）培養(yǎng)用液：添加20%胎牛血清的Hanks平衡鹽溶液、培養(yǎng)液。 操作過程 (1) 將凍存管從液氮中取出，立即投入冰浴中5min。復(fù)溫速率約5600C/min。一次可以進(jìn)行多個凍存管的復(fù)蘇； (2) 將凍存管兩端剪斷，可以將5ml細(xì)胞凍存懸液轉(zhuǎn)移到50ml離心管中； (3) 沿離心管壁緩慢加入已在冰浴中預(yù)冷的含20

21、%胎牛血清的Hanks平衡鹽溶液。前10min以0.2ml/min的速度加入，后10min以0.5ml/min的速度加入，接著的15min以0.75ml/min的速度加入，最后30min以1ml/min的速度加入。全過程約為65min，都在冰浴中進(jìn)行； (4) 將稀釋后的細(xì)胞懸液以400r/min離心5min，去除上清。向細(xì)胞沉淀中加入培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞，用于培養(yǎng)。 結(jié)果 復(fù)蘇后的細(xì)胞應(yīng)該保存其凍存時的活力，活細(xì)胞數(shù)達(dá)90%以上。 討論 復(fù)蘇時，冷凍保護(hù)液的稀釋及去除過程與凍存前冷凍保護(hù)液的滴加過程一樣，不能在室溫下而必須在40C冰浴中進(jìn)行，避免在室溫下冷凍保護(hù)劑對細(xì)胞產(chǎn)生毒性。稀釋過程也要緩

22、慢進(jìn)行，保證有足夠的時間讓冷凍保護(hù)劑從細(xì)胞內(nèi)滲出，以達(dá)到細(xì)胞內(nèi)外的平衡，避免高滲透壓的損傷。 關(guān)于細(xì)胞的冰凍和復(fù)蘇 huyanhui 細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇 一、原理在不加任何條件下直接凍存細(xì)胞時，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會形成冰晶，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機(jī)械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等，能引起細(xì)胞死亡。如向培養(yǎng)液加入保護(hù)劑，可使冰點(diǎn)降低。在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細(xì)胞。貯存在130以下的低溫中能減少冰晶的形成。細(xì)胞復(fù)蘇時速度要快，使之迅速通過細(xì)胞最易受損的50，細(xì)胞仍能生長，活力受損不大。目前常用的保護(hù)劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，它們對細(xì)胞無毒性，分子量

23、小，溶解度大，易穿透細(xì)胞。二、操作步驟（一）凍存1、消化細(xì)胞（同實(shí)驗(yàn)二），將細(xì)胞懸液收集至離心管中。2、1000rpm離心10分鐘，棄上清液。3、沉淀加含保護(hù)液的培養(yǎng)，計(jì)數(shù)，調(diào)整至5106/ml左右。4、將懸液分至凍存管中，每管1 ml。5、將凍存管口封嚴(yán)。如用安瓿瓶則火焰封口，封口一定要嚴(yán)，否則復(fù)蘇時易出現(xiàn)爆裂。6、貼上標(biāo)簽，寫明細(xì)胞種類，凍存日期。凍存管外拴一金屬重物和一細(xì)繩。7、按下列順序降溫：室溫4（20分鐘冰箱冷凍室（30分鐘）低溫冰箱（30 1小時）氣態(tài)氮（30分鐘）液氮。注意：操作時應(yīng)小心，以免液氮凍傷。液氮定期檢查，隨時補(bǔ)充，絕對不能揮發(fā)干凈，一般30立升的液氮能用11.5月。

24、（二）復(fù)蘇1、準(zhǔn)備一個茶缸或1000ml的燒壞，內(nèi)裝2/3杯37的溫水。2、從液氮中取出凍存管、迅速置于溫水中并不斷攪動。使凍存管中的凍存物在1分鐘之內(nèi)融化。3、打開凍存管，將細(xì)胞懸液吸到離心管中。4、1000rpm離心10分鐘，棄去上清液。5、沉淀加10ml培養(yǎng)液，吹打均勻，再離心10分鐘，棄上清液。6、加適當(dāng)培養(yǎng)基后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，37培養(yǎng)，第二天觀察生長情況。三、試劑和器材器材：液氮罐、凍存管（塑料螺口專用凍存管或安瓿瓶）、離心管、吸管、離心機(jī)等試劑：0.25胰酶、培養(yǎng)基、含保護(hù)劑的培養(yǎng)基（即凍存液）附：凍存液配制：培養(yǎng)基加入甘油或DSMO，使其終濃度達(dá)520%。保護(hù)劑的種類和用量

25、視不同細(xì)胞而不同。配好后4下保存。 kwzy 凍存時，可以直接將裝有細(xì)胞的凍存管放到液氮中效果非常好復(fù)蘇時可省略步驟將上清夜吸干凈后，直接用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液將細(xì)胞轉(zhuǎn)到培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板（細(xì)胞數(shù)量少的情況下）中。 gdognchun 我感覺只要DMSO的濃度保持在10就可以了，血清的濃度影響不是很大的。我曾經(jīng)用90的血清10的DMSO也用過50DMEM+40%血清10DMSO凍存細(xì)胞，復(fù)蘇后細(xì)胞都能成活。并且我是在細(xì)胞離心后用凍存液懸浮后，分裝到凍存管中-80度過夜，后直接存放于液氮中。antitrust 細(xì)胞凍存時要計(jì)數(shù)，但發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室里很少有人做！請問大家計(jì)數(shù)有什么呀？ hz_kirk 不用液氮，在1

26、10度的冰箱中行不行？ multibliss 血清1. 血清必須貯存於-20-70，若存放於4，請勿超過一個月。如果一次無法用完一瓶，可將其4045ml分裝於無菌50ml離心管中，由於血清結(jié)凍時體積會增加約10，必須預(yù)留此膨脹體積之空間，否則易發(fā)生污染或容器凍裂之情形。 2. 一般廠商提供之血清為無菌，不需再無菌過濾。若發(fā)現(xiàn)血清有許多懸浮物，則可將血清加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾，勿直接過濾血清。 3. 瓶裝（500ml）血清解凍步驟 (逐步解凍法)：-20或-70 4冰箱溶解一天室溫下全溶後再分裝，一般以50ml無菌離心管可分裝4045ml。在溶解過程中須規(guī)則搖晃均勻（小心勿造成氣泡），使溫度與成分

27、均一，減少沈澱的發(fā)生。勿直接由-2037解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沈澱。 4. heat-inactivation是指56, 30分鐘加熱已完全解凍之血清。加熱過程中須規(guī)則搖晃均勻。此熱處理之目的是使血清中之補(bǔ)體成份（complement）去活化。除非必須，一般不建議作此熱處理，因?yàn)闀斐缮驖瘴镏@著增多，且會影響血清之品質(zhì)。補(bǔ)體參與之反應(yīng)有：cytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells and platelets, enhanced phag

28、ocytosis, chemotaxis and activation of lymphocytic and macrophage cell type。 5. 勿將血清置於37太久，若在37放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩(wěn)定之成份亦會因此受到破壞，而影響血清之品質(zhì)。 6. 血清之沈澱物 6.1. 凝絮物：發(fā)生之原因有許多種，但普遍之原因是血清中之脂蛋白（lipoprotein）變性及解凍後血清中存在之血纖維蛋白（fibrin）造成，這些凝絮沈澱物不會影響血清本身之品質(zhì)。若欲減少這些凝絮沈澱物，可用離心3000rpm, 5min去除，或離心後上清液可以加入培養(yǎng)基中一起過濾。不建議用

29、過濾步驟去除這些凝絮沈澱物，因?yàn)闀枞^濾膜。 6.2. 顯微鏡下觀察之“小黑點(diǎn)”：通常經(jīng)過熱處理之血清，沈澱物的形成會顯著的增多。有些沈澱物在顯微鏡下觀察像是“小黑點(diǎn)”，常會誤認(rèn)為血清遭受污染，而將血清放在37中欲培養(yǎng)此“微生物“，但在37環(huán)境下，又會使此沈澱物增多，更會誤認(rèn)為微生物之增殖，但以培養(yǎng)細(xì)菌之培養(yǎng)基檢測，又沒有污染。一般而言，此小黑點(diǎn)應(yīng)不會影響 細(xì)胞之生長，但若懷疑此血清之品質(zhì)，應(yīng)立即停用，更換另一批號的血清。 7. 血清之生長測試 7.1. 材料： 7.1.1. MDCK cell (ATCC CCL-34或CCRC 60004) 7.1.2. MEM (alpha modif

30、ied minimal essential medium, GibcoBRL 12000-022 ) 7.1.3. 6-well TC plate (or 35mm TC dish) 7.1.4. methanol 7.1.5. glacial acetic acid 7.1.6. 10% Giemsa solution(GibcoBRL 10092-013) 7.2. 步驟： 7.2.1. 以MEM with 10%FBS（已測試過）培養(yǎng)MDCK細(xì)胞於T75 flask至80% confluency。 7 .2.2. 以trypsin-EDTA處理細(xì)胞，離心後，加入適量不加血清之MEM製成細(xì)

31、胞懸浮液，並測細(xì)胞濃度。以不加血清之MEM稀釋細(xì)胞濃度為1102活細(xì)胞數(shù) / ml。 7.2.3. 將1 ml細(xì)胞懸浮液接種入6-well plate中，並另加入1 ml含不同濃度的血清（20 % , 10 % , 4 % , 2 % , 1 % , 0.4 %）之MEM，使血清最終濃度為10 % , 5 % , 2 % , 1 % , 0.5 % , 0.2 %。用已測試過之血清同時進(jìn)行對照組試驗(yàn)。 7.2.4. 37，5 % CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5-7天，期間不需更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞群落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸即可。 7.2.5. 去除培養(yǎng)基，加入1 ml Carnoys固定液（甲醇

32、：冰醋酸3：1），室溫下靜置10 min。 7.2.6. 去除固定液，水洗二次。 7.2.7. 加入1 ml 10% Giemsa solution，室溫下靜置染色2-3 min。 7.2.8. 去除染液，水洗二次。 7.2.9. 以肉眼計(jì)數(shù)群落數(shù) 7.2.10. 計(jì)算SPE ( Serum Plating Efficiency )： SPE = ( no. of colonies / well ) / 100 x 100% 7.2.11. 計(jì)算RPE(Relative Plating Efficiency)： SPE = total colonies of six well (test) /

33、 Total colonies of six well (control) x 100% 7.3. 比較各濃度血清培養(yǎng)基之RPE，即可得知待測血清對細(xì)胞生長的影響。 7.4. 訂購多量同一批號的優(yōu)良血清，置於-70保存之。 multibliss 冷凍細(xì)胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結(jié)晶而對細(xì)胞造成傷害，導(dǎo)致細(xì)胞之死亡。 細(xì)胞活化後，約需數(shù)日，或繼代一至二代，其細(xì)胞生長或特性表現(xiàn)才會恢復(fù)正常例如產(chǎn)生單株抗體或是其他蛋白質(zhì)。 材料 37C 恆溫水槽 新鮮培養(yǎng)基 無菌吸管 / 離心管 / 培養(yǎng)瓶 液氮或乾冰容器 步驟： 操作人員應(yīng)戴防護(hù)面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。 自液氮或乾冰容器

34、中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由於熱脹冷縮過程，此時蓋子易鬆掉。 將新鮮培養(yǎng)基置於 37C 水槽中回溫，回溫後噴以 70% 酒精並擦拭之，移入無菌操作臺內(nèi)。 取出冷凍管，立即放入 37C 水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在 1 分鐘內(nèi)全部融化，以 70% ethanol 擦拭保存管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。 取出 0.9ml 解凍之細(xì)胞懸浮液，緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(nèi) (稀釋比例為 1:101:15)，混合均勻，放入 CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。另取 0.1ml 解凍細(xì)胞懸浮液作存活測試。 解凍後是否立即去除冷凍保護(hù)劑 (例如 DMSO 或 glycerol)，依細(xì)胞種類而異，一般而言，大都不需要立

35、即去除冷凍保護(hù)劑。惟若要立即去除，則將解凍之細(xì)胞懸浮液加入含有 5-10ml 培養(yǎng)基之離心管內(nèi)，離心 1,000 rpm, 5 分鐘，移去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基，混合均勻，放入 CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養(yǎng)後隔日更換培養(yǎng)基。 soso_fan 一般凍存的密度是14*10的六次方。還有我們用的是德國的無血清凍存液，上面推薦復(fù)蘇是直接稀釋培養(yǎng)就可以了，沒有必要離心洗滌。 freechange: 細(xì)胞冷凍和復(fù)蘇基本原理：在長期的細(xì)胞培養(yǎng)過程中可能會出現(xiàn)微生物污染或基因型改變等情況，會導(dǎo)致具有優(yōu)良特性細(xì)胞系的丟失。為防止這些細(xì)胞的丟失，細(xì)胞可以經(jīng)快速冷凍并幾乎無限期保存

36、在非常低的溫度下，如液氮（-176）。試劑和設(shè)備：冷凍液: 90%滅活血清+10%DMSO（或甘油），用0.45m微孔濾膜過濾除菌，4保存；培養(yǎng)液；臺盼藍(lán)溶液（0.4%溶解于PBS）；70%乙醇；組織培養(yǎng)瓶；15-50 ml 無菌圓錐底離心試管；離心機(jī)；血球計(jì)數(shù)板；超凈工作臺；光學(xué)顯微鏡；37水??；冷凍管；-80冰箱；液氮和液氮容器。操作步驟：（一）冷凍細(xì)胞1 收集對數(shù)生長期細(xì)胞；2 以25l臺盼藍(lán)溶液稀釋25l細(xì)胞懸液；用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并計(jì)算細(xì)胞存活率（至少應(yīng)該在90%以上）；3 細(xì)胞懸液在4 條件下200g離心10分鐘；4 將沉淀的細(xì)胞重新懸浮在冷凍液中（大約5106細(xì)胞/0.5 ml 冷

37、凍液）；5 將細(xì)胞懸液加入到冷凍管中，每管0.5 ml；6 將冷凍管置于-80冰箱中；7 24小時后，將冷凍管移入液氮罐中；8 在記錄本或電腦中記錄下每一個冷凍管的位置以確保在以后應(yīng)用時能夠找到每一個冷凍管。（二）細(xì)胞復(fù)蘇1 將冷凍管迅速由液氮轉(zhuǎn)入到37水浴中，冷凍管的頂部保持在水面以上以避免任何污染，不定時攪拌加速解凍；2 當(dāng)細(xì)胞完全解凍后，用含70%乙醇的紗布擦拭冷凍管消毒；3 將解凍后細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含4預(yù)平衡培養(yǎng)液的試管中；4 細(xì)胞懸液在4下200g離心10分鐘；5 棄上清，將細(xì)胞重新懸浮在新鮮培養(yǎng)液中；6 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶，CO2孵箱中培養(yǎng)；7 是用倒置顯微鏡檢查細(xì)胞存活率以及細(xì)胞密

38、度，如果細(xì)胞密度過高，用培養(yǎng)液稀釋至適宜濃度。對照試驗(yàn)在冷凍細(xì)胞被移入到液氮罐中一段時間后，取出一管細(xì)胞復(fù)蘇并進(jìn)行培養(yǎng)以檢測存活率。實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)及說明：1 嚴(yán)格遵守液氮操作規(guī)則（即戴上合適的手套和護(hù)目鏡），液態(tài)氮對眼睛極為有害；2 對一瓶細(xì)胞培養(yǎng)液要盡可能多分裝幾個冷凍管；3 延長暴露在DMSO中的時間對細(xì)胞有害，因此冷凍和解凍操作要盡可能快；4 細(xì)胞可以暫時穩(wěn)定保存在-80 達(dá)數(shù)月；5 每批次冷凍和復(fù)蘇的細(xì)胞的存活率可能會不相同，為避免這個問題，每次細(xì)胞凍存最好分兩批以上進(jìn)行；6 DMSO可以防止在細(xì)胞內(nèi)部出現(xiàn)冰結(jié)晶，凍存過程需要逐步降低溫度；7 如果復(fù)蘇后細(xì)胞難以恢復(fù)到良好狀態(tài)，可以使用含10

39、%鼠胚胎成纖維母細(xì)胞培養(yǎng)上清的培養(yǎng)液以促進(jìn)恢復(fù)；8 也可以用含20%熱滅活胎牛血清和10%DMSO的培養(yǎng)液為冷凍液。Jurkat 細(xì)胞復(fù)蘇zwangw ：Jurkat 細(xì)胞，體外培養(yǎng)及凍存前狀態(tài)良好，凍存時細(xì)胞計(jì)數(shù)為活細(xì)胞數(shù)大于90%，細(xì)胞總數(shù)大于10E6個，凍存液為10%DMSO（Sigma）加90%胎牛血清（Hyclone），凍存體積為1ml/管（凍存管為NUNC產(chǎn)品，1.8ml）。凍存條件為4度適應(yīng)數(shù)小時、20度凍數(shù)小時后置液氮口過夜，最后入液氮。同時凍存的其他細(xì)胞復(fù)蘇后均挺好，可Jurkat細(xì)胞怎么也復(fù)蘇不出，無論是復(fù)蘇后直接將凍存液加入新鮮基中還是離心后加入新鮮培養(yǎng)基均無活細(xì)胞，復(fù)蘇

40、出來的細(xì)胞大多為細(xì)胞碎片，偶有活細(xì)胞也維持不了24小時，可能是凍存時的問題。請各位高手指點(diǎn)，問題到底出在哪里，是否Jurkat 細(xì)胞有特殊的凍存要求？謝謝！ jiangql：Jurkat 細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞中比較難以凍存的一種，你的問題是凍存方法不對。各種細(xì)胞對DMSO的敏感度是不同的。凍存保護(hù)劑DMSO的作用是避免凍存產(chǎn)生的冰晶對細(xì)胞的損傷，但本身對細(xì)胞有毒性，MTT法中就是用它來溶解細(xì)胞的，而你“4度適應(yīng)數(shù)小時、20度凍數(shù)小時”，過渡的時間過長，所以你“復(fù)蘇出來的細(xì)胞大多為細(xì)胞碎片”。最好的凍存方法是用程序冷凍儀，一般實(shí)驗(yàn)不用這么復(fù)雜，簡便的方法保持降溫速度基本是-1/min，也就是說4度20

41、30min，20度凍0.51h，-80度過夜或數(shù)天，最后入液氮。其它的因素也會影響結(jié)果，而你“其他細(xì)胞復(fù)蘇后均挺好”，相信已經(jīng)知道，就不多說了。供參考。zwangw：謝謝，我也一直懷疑是DMSO的濃度過高引起的細(xì)胞死亡，沒有想到細(xì)胞逐步冷凍時間也有講究。上次復(fù)蘇的細(xì)胞覺得沒活，但我沒有立即處理掉，放了一個星期后細(xì)胞竟奇跡般的長了起來，只是細(xì)胞碎片太多，較難與活細(xì)胞分離，離心也不行，只能在慢慢傳代的過程中稀釋了。 carlzeiss：Jurkat應(yīng)該很好養(yǎng)，也很容易凍。DMSO的濃度的確是很重要，一般人上來就選10%，但其實(shí)ATCC有很多細(xì)胞建議5%。我個人喜歡8%。但這個細(xì)胞10%是沒問題的。

42、有人凍不好就用90%血清，其實(shí)這也是浪費(fèi)。需要注意的是先用合成培養(yǎng)基配DMSO，細(xì)心的話會發(fā)現(xiàn)這時會產(chǎn)熱。在冰浴中保持低溫，然后再加血清，記住10%血清就足夠了。最好別忘記過濾除菌，需要凍的細(xì)胞一般都是重要細(xì)胞，要是在這步污染就虧了。4度適應(yīng)沒什么壞處，但是20就不對了，細(xì)胞最怕就是0 至40的冰晶期，因此如沒有程序降溫儀，可將細(xì)胞直接放80冰箱，過幾天再移液氮。有一種簡易的降溫裝置，是控制細(xì)胞在深低溫冰箱中溫度下降速度的，忘記是什么公司的，但一般的細(xì)胞是用不著的。 zengcao：贊同jiangql的方法，我也是那樣做的。但4度1h30min，20度凍30min，-80度過夜，然后投入液氮。

43、血清一般為20-30% maodan：像U937、Jurkat這種懸浮細(xì)胞，養(yǎng)的時候都比較好養(yǎng)，但復(fù)蘇時就相對比較困難。我做的經(jīng)驗(yàn)是：離心去掉大部分凍存液上清加入新鮮1640培養(yǎng)基，放置一段時間2-3天甚至再長一段時間，期間不用更換培養(yǎng)基但要每天觀察，直到細(xì)胞狀態(tài)好細(xì)胞數(shù)增多，如Jurkat細(xì)胞出現(xiàn)抱團(tuán)現(xiàn)象，這時再按常規(guī)方法培養(yǎng)就行了。懸浮細(xì)胞剛復(fù)蘇細(xì)胞碎片是比較多，但一旦細(xì)胞狀態(tài)好生長速度也比較快，多傳幾次就好了。 caicaizi：我一般直接放入-80，過夜或放一段時間都沒問題，但凍存管周圍要保溫良好，如泡沫盒或棉花。 細(xì)胞復(fù)蘇后都死掉了？ 雪景：細(xì)胞（小鼠的成纖維細(xì)胞）復(fù)蘇后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞逐漸

44、死亡，現(xiàn)象是細(xì)胞膜的破裂，內(nèi)容物溢出，不知道是什么原因？ps 復(fù)蘇的方法應(yīng)該沒有問題，因?yàn)閺?fù)蘇別得細(xì)胞都沒有問題還有 我得細(xì)胞凍存之前使用DMEM培養(yǎng) 由于想換培養(yǎng)基凍存時就換了DMPI1640 不知道這樣影不影響復(fù)蘇？ Brokenarrow：體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞，其生命期限與物種等因素有關(guān)。例如：人胚成纖維細(xì)胞約可培養(yǎng)50代；恒河猴皮膚成纖維細(xì)胞能傳代超過40代；雞胚成纖維細(xì)胞則只有少數(shù)能培養(yǎng)30代；而小鼠成纖維細(xì)胞多數(shù)只能生長8代左右。 dora_ding：可能與凍存液或凍存的過程有關(guān)。 hkqu：小鼠成纖維細(xì)胞復(fù)蘇比較麻煩，很容易死亡。成活率主要還是看凍存時的操作和復(fù)蘇時間長短，換培養(yǎng)

45、基不應(yīng)該有影響的。另外一點(diǎn)復(fù)蘇洗滌時一定要把凍存液洗干凈，DMSO對細(xì)胞毒性較大。 echo：懷疑是凍存時出了問題。 雪景： 復(fù)蘇后加了培養(yǎng)基 馬上觀察就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)半數(shù)的細(xì)胞沒有細(xì)胞壁了 剩下的細(xì)胞內(nèi)容物均質(zhì) 大概三個小時后就都死得差不多了 難道真的是凍存出了問題 可惜不是我凍存的 或者培養(yǎng)基的滲透壓會不會有問題？另外 復(fù)蘇溶解37度大概2min左右，1000rpm 2-3min vanbastern：離心的轉(zhuǎn)速多少？這個也要當(dāng)心，太高的轉(zhuǎn)速對想對孱弱的細(xì)胞不利 雪景： 修正一下 出現(xiàn)問題的細(xì)胞是小鼠的胚胎細(xì)胞Balb C3T3細(xì)胞株 怎樣提高細(xì)胞復(fù)蘇成活率zzjm：求助：我的雜交瘤細(xì)胞復(fù)蘇后第

46、一天情況很好,但第二三天后就出現(xiàn)大量死亡甚至全軍覆沒,請問各位高手有何辦法提高細(xì)胞復(fù)蘇存活率.凍存液:10%的甘油,20%血清 qjm7717： 我凍細(xì)胞用的是8%DMSO加血清.雖然比較奢侈,但是復(fù)蘇出來效果不錯的.你可以試試.復(fù)蘇時24小時內(nèi)一定要換液.以免DMSO對細(xì)胞的毒性. 293細(xì)胞復(fù)蘇，第二天培養(yǎng)液即變黃，細(xì)胞成團(tuán) putaoqiu：細(xì)胞數(shù)量沒怎么增長，不貼壁，聚集成團(tuán)，不知道什么原因。離心收集加入新的培養(yǎng)液重新培養(yǎng)。 Tonyzhang：Bacteria contamination! bioflow：細(xì)胞數(shù)量可能太多，減少細(xì)胞量再試試。 zhaofei ：我們實(shí)驗(yàn)室的293細(xì)胞

47、復(fù)蘇時也存在同樣的問題，復(fù)蘇困難，死細(xì)胞太多，但不要著急，等它慢慢地爬。同時，293細(xì)胞培養(yǎng)時經(jīng)常會聚集成團(tuán)，各位是否也存在相同的問題？ 野原：（TO zhaofei） 293細(xì)胞的確存在復(fù)蘇困難的問題，但是一定不要輕易放棄，讓它慢慢復(fù)蘇就是。以前我在復(fù)蘇293時，到第三天時如果細(xì)胞還不理想就丟掉重新復(fù)蘇。印象極深的是：有一次也是第3天細(xì)胞還是貼壁極少，郁悶之下忘記丟掉，結(jié)果到第5天上午，奇跡出現(xiàn)了：發(fā)現(xiàn)細(xì)胞貼壁達(dá)到90，狀態(tài)非常好，可謂長勢喜人。所以在復(fù)蘇293時，一定要有耐心。另外，根據(jù)我自己養(yǎng)293的經(jīng)驗(yàn)：293的特點(diǎn)是貼壁并不牢，但是細(xì)胞相互之間卻聚集非常緊密。所以用消化時最好是含ED

48、TA的胰酶，使細(xì)胞充分分離，有利于細(xì)胞的貼壁。 putaoqi： 今天再看昨天換了培養(yǎng)液的，好像有一個細(xì)胞貼壁了。希望明天會更好。另外，我們實(shí)驗(yàn)室的老師說狀態(tài)不好還有一個原因是拿出來換罐凍融了幾次，導(dǎo)致其他凍存的細(xì)胞系復(fù)蘇也困難。 leeqiu：吹打不足，細(xì)胞分布不均勻時細(xì)胞容易成團(tuán)，特別是293，1、2代都是。培養(yǎng)液變黃考慮細(xì)胞接種太多或有感染。 seagate： 因?yàn)榘涯z原酶錯當(dāng)胰酶使用,結(jié)果消化不完全,細(xì)胞成團(tuán),培養(yǎng)液發(fā)黃,1月22日傳的代,1月24日19點(diǎn)仍然不見長,所以今天晚上我又加了胰酶消化重懸,希望能好起來. Douding：不用灰心，293復(fù)蘇一般都不容易，但是一旦堅(jiān)持下去，長

49、好后就很容易傳代了。 細(xì)胞復(fù)蘇注意的幾點(diǎn)事項(xiàng) Jimlulu：1 為獲得最高的存活率，收到細(xì)胞后最好盡快復(fù)蘇，如要繼續(xù)保存務(wù)必在 液 氮中保存。如在-70度下,細(xì)胞的存活率將大大降低，甚至死亡。2 復(fù)蘇時先準(zhǔn)備好10倍體積的新鮮培養(yǎng)液(血清濃度可稍高于凍存前細(xì)胞培養(yǎng)液中血清濃度)，例如1ml的凍存液用10ml培養(yǎng)液稀釋。3 從液氮中取除凍存管，旋緊管蓋，迅速置于37-39度的水域中不斷搖晃，務(wù)必使凍存液在1分鐘那融化。4 將融化后的凍存液加入到10倍體積的新鮮培養(yǎng)液中，以稀釋dmso的濃度，避免細(xì)胞中毒，24小時后更換培養(yǎng)液。（不推薦先離心去處凍存液，因?yàn)閯倧?fù)蘇的細(xì)胞應(yīng)將傷害降低到最小）有什么

50、漏誤之處請各位戰(zhàn)友指正 lumangmang：樓主，這樣的帖子我搜了一下，還不少，建議你看看，/bbs/post/view?bid=66&id=&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0#不過你的方法也可以，我也一直這樣做，我覺得還是要看細(xì)胞，不同的細(xì)胞采用不同的復(fù)蘇方法，有的細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞就可以不離心，24小時后（不一定，只要細(xì)胞貼壁了）就可以換液，但對比較敏感的細(xì)胞，就得先離心去除凍存液對細(xì)胞的毒性。 dxb77：細(xì)胞復(fù)蘇時，加10倍體積培養(yǎng)液，離心后，添加新鮮培養(yǎng)液，24小時后換液一次，如果是貼壁細(xì)胞，則在貼壁后就可換液。如果是懸浮細(xì)胞，則倍量加液即

51、可。 westernblot：可以直接融化后直接離心,用5000,1min,去上清后加新鮮培養(yǎng)基,省你的培養(yǎng)基.復(fù)蘇的效率還可以,對喜歡偷懶的有用. curiouschild：主要看細(xì)胞種類的,像有的細(xì)胞皮實(shí)，不用離心，也不用10ml培養(yǎng)基，加4ml培養(yǎng)基，將凍存管里的1ml細(xì)胞加進(jìn)去就可以了。老師說離心即麻煩，且細(xì)胞怕振的，可以一貼壁就換培養(yǎng)基就好了 小白菜：不離心直接培養(yǎng)應(yīng)該會好些，這樣使對細(xì)胞的損傷降到最小。 sp2/0細(xì)胞復(fù)蘇后第二天，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基沒加青鏈霉素，有影響嗎angeltou：如題，今天看復(fù)蘇的細(xì)胞，有一些已經(jīng)委縮，還有一些透亮，比較大，但發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基沒加青鏈霉素，不知有沒有影響

52、？還有我的細(xì)胞情況正常嗎？一般sp2/0復(fù)蘇幾天能正常的培養(yǎng)？請各位戰(zhàn)友不吝賜教，我復(fù)蘇這個細(xì)胞已經(jīng)很多次了，情況不好，實(shí)驗(yàn)緩慢，心情郁悶。 笑佛：細(xì)胞復(fù)蘇的狀態(tài)和細(xì)胞、凍存的狀態(tài)、凍存復(fù)蘇技術(shù)都有關(guān)。對于青鏈霉素，我已經(jīng)有年頭不用了，個人習(xí)慣，你可以問問園子里的其它同志，可能有一些人也這樣。對細(xì)胞培養(yǎng)沒有如何影像。唯一的影像是如果污染的話，你會更快的發(fā)現(xiàn)（玩笑）。其實(shí)沒有用的，試試吧。 bbiron： 對細(xì)胞不會有影響，sp2/0細(xì)胞比較好養(yǎng)，如果你復(fù)蘇后細(xì)胞狀態(tài)不是很好，可能有一些細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)液中，這個并不要緊，可能是你，凍存過程中凍存的方法有一些問題，也可能向上面的哥們說的，凍存的時候

53、細(xì)胞狀態(tài)就不好，這個狠重要，如果你的培養(yǎng)條件都比較好的（培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱等都沒問題），你就少量的換下液，或是在培養(yǎng)瓶中加一些飼養(yǎng)細(xì)胞，主要是為了取出。死的細(xì)胞，有一些大的sp2、0細(xì)胞這個沒多大影響，如果你要是做細(xì)胞融合，你就把這些細(xì)胞重新克隆一下，取幾個生長較快。的和一下狀態(tài)較好的細(xì)胞，重新擴(kuò)大培養(yǎng)，這樣你的細(xì)胞生長就均一了。一個原則就是細(xì)胞不要經(jīng)常的處理，能不動就不要動，傳代，或是其他的處理都會影響細(xì)胞狀態(tài)，一般復(fù)蘇一個星期。細(xì)胞就會有一個好的狀態(tài)，當(dāng)然有的也會時間長一些，耐心些，一旦細(xì)胞狀態(tài)好了，它的繁殖速度是十分的快的。我這有這個細(xì)胞培養(yǎng)的照片，你可以看看它的密度。祝你有好的運(yùn)氣 hap

54、pyms： 樓上的，你的細(xì)胞多常時間傳一次？我的密度比你的大多了，基本上24小時傳一代，這個正常嗎？至于抗生素，我沒有加過。如果污染了就重養(yǎng)了。請問樓上的：如果你要是做細(xì)胞融合，你就把這些細(xì)胞重新克隆一下，取幾個生長較快。的和一下狀態(tài)較好的細(xì)胞，重新擴(kuò)大培養(yǎng)，這樣你的細(xì)胞生長就均一了。怎么重新克隆？是不是加8氮鳥嘌呤？ 笑佛 ：（TO happyms）SP 2/0 生長很快，半懸浮生長，換液的時候，全部倒掉的話（只留貼壁的），24小時換液也是正常的，如果你多留一些，24小時就必須換液了。3樓的同志說的很對，細(xì)胞要少動，尤其是狀態(tài)不好的時候，更不能洗滌去死細(xì)胞等等，那一定沒戲了。sp 2/0容易

55、養(yǎng)過，如果想減少換液次數(shù)，就要把貼壁的細(xì)胞吹起，少留。至于重新克隆，沒有必要吧，應(yīng)該是8AG篩選了。 Angeltou：感謝各位全面詳細(xì)的回答，我的細(xì)胞本來想換一次液的，看來還是少動為好了。 bbiron ：抱歉，我的照片引起大家的誤會了，這個細(xì)胞數(shù)量很少，這樣數(shù)量的細(xì)胞估計(jì)還可以長2天，在處理，我想是這樣，大家的實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)不是很多，可以少留些細(xì)胞在培養(yǎng)瓶里面，你就不用24小時就搞它了，天天搞十分的煩人。這樣的數(shù)量可以保證你過一個快樂的周末。我說的克隆，是不用8AG的，如果細(xì)胞大小不是很均勻，有的細(xì)胞十分的大，你就把它克一下，當(dāng)然長的快的，和慢的不差多少，sp2、0細(xì)胞不是每個都能進(jìn)行融合。保留

56、各種生長狀態(tài)的細(xì)胞，對于融合有一定好處，當(dāng)然這存在一個問題就是養(yǎng)時間長了。長的快的細(xì)胞，就對長的慢的構(gòu)成生長優(yōu)勢了。這個問題是存在的。 關(guān)于用8AG篩選的問題。一般半年多時間對sp2、0細(xì)胞篩選一次就行了，一般不會有不敏感的問題。其實(shí)讓這個東西還是比較好養(yǎng)的。 feal：我也在養(yǎng)sp2/o細(xì)胞，長的特別快，每天都要換液，在高倍鏡下看，細(xì)胞也不是很規(guī)則，過兩天就要做融和了，有點(diǎn)擔(dān)心啊，還有，我的細(xì)胞似乎不大能夠吹的起來，每次吹打會有很多泡沫，吹的時間也有點(diǎn)長的，這樣是不是對細(xì)胞損傷特別大啊，那有什么解決的辦法么 細(xì)胞復(fù)蘇 戀戀真言 ： 曾在園中看到過：不能使用與凍存前培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基。那么凍存前使用DMEM（含10胎牛血清Gibco）復(fù)蘇后使