食品毒理學(xué)第6章一般毒性作用

1、第六章 一般毒性作用,根據(jù)接觸毒物時(shí)間的長(zhǎng)短，可將產(chǎn)生的一般 毒性作用分為急性毒性、亞慢性毒性和慢性 毒性。 按毒物接觸時(shí)間長(zhǎng)短所進(jìn)行的觀察和評(píng)價(jià)毒 效應(yīng)的試驗(yàn)即為急性毒性試驗(yàn)、亞慢性毒性 試驗(yàn)和慢性毒性試驗(yàn)。,6-1 急性毒性作用,一、概念 急性毒性(acute toxicity)：指機(jī)體（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或人） 一次或24小時(shí)內(nèi)多次接觸外源化學(xué)物后在短期內(nèi) 所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)。包括一般行為和外觀改變、 大體形態(tài)變化及死亡效應(yīng)。,注意： 1.急性接觸的次數(shù)：一次或24h內(nèi)多次。 2.中毒效應(yīng)出現(xiàn)的時(shí)間：一般為714天。 3.中毒效應(yīng)的強(qiáng)度。,二、急性毒性試驗(yàn)的目的 1. 測(cè)試并求出毒物的的致死劑量以及

2、其他急性毒性 參數(shù)，通常以LD50為最主要參數(shù)，并根據(jù)LD50的 大小進(jìn)行急性毒性分級(jí)。 2. 通過觀察動(dòng)物的表現(xiàn)、毒作用強(qiáng)度和死亡情況， 初步評(píng)價(jià)毒物對(duì)機(jī)體的毒效應(yīng)特征、靶器官、劑 量反應(yīng)關(guān)系和對(duì)人體產(chǎn)生損害的危險(xiǎn)性。 3. 為亞慢性、慢性毒性試驗(yàn)研究以及其他毒理試驗(yàn) 提供接觸劑量和觀察指標(biāo)選擇的依據(jù)。 4. 為毒理學(xué)機(jī)制研究提供線索。,三、急性毒性試驗(yàn)方法要點(diǎn)1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇,（1）原則 （2）具體要求 （3）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的性別：雌雄各半。 （4）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組與數(shù)量：一般46組， 每組10只。 （5）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的預(yù)檢：12周的檢疫期。 （6）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的給藥前禁食處理 大鼠、小鼠：隔夜禁食（禁食

3、4h）；染毒后禁食4h。 禁食時(shí)要保障飲水。,盡量選擇對(duì)化學(xué)毒物的代謝和毒效應(yīng)表現(xiàn) 與人的反應(yīng)盡可能一致的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物； 易于飼養(yǎng)管理、試驗(yàn)操作方便的動(dòng)物； 繁殖生育力較強(qiáng)、數(shù)量較大能夠保障供應(yīng)； 價(jià)格較低，易于獲得。,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的物種和品系 首選哺乳動(dòng)物，大小鼠最為常用。 大鼠：Spragur-Dawley（SD），Wistar 小鼠：昆明種，NIH，ICR 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的年齡和體重：剛成年，且健康、未曾 交配和受孕的動(dòng)物。 大鼠：180240克 小鼠：1825克 同一次試驗(yàn)、同一批實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體重變異范 圍不得超過其平均體重的20。,常用劑型： 水溶液；混懸液；油溶液。 試驗(yàn)前新鮮配制。 受試物染毒量

4、規(guī)定： 小鼠0.2ml/10g，一次灌胃體積不超過1.0ml/只 大鼠1.0ml/100g，一次灌胃體積不超過5ml/只 3染毒方法 灌胃,2受試物及處理,試驗(yàn)所用受試物的總量應(yīng)一次備齊，且應(yīng) 為同一批號(hào)。 受試物成分與配方應(yīng)穩(wěn)定不變。,4劑量選擇與分組 5毒性作用觀察 中毒體征及發(fā)生過程； 死亡情況和時(shí)間分布； 體重； 病理檢查。 6觀察時(shí)間和周期 觀察時(shí)間：染毒當(dāng)天應(yīng)連續(xù)或多次觀察，以 后每天2次或多次觀察直至試驗(yàn)結(jié)束。 觀察周期：一般是14天。 7. 計(jì)算LD50,(1)查閱文獻(xiàn) 了解化學(xué)毒物的理化特性，生產(chǎn)批號(hào)及純 度，雜質(zhì)成分與含量等。 確定使用哪一種計(jì)算方法求LD50，然后再設(shè)計(jì)劑

5、 量分組。 LD50的計(jì)算方法常用寇氏法、概率單位法、霍恩氏法等。 找出與受試化學(xué)毒物結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)近似的化學(xué) 物的毒性資料，并以文獻(xiàn)資料中相同的動(dòng)物種系 和相同接觸途徑所測(cè)得的LD50值作為受試化學(xué)物的 預(yù)期毒性中值。,（2）預(yù)試驗(yàn) 設(shè)定以此預(yù)期值作為待測(cè)化學(xué)物的中間劑量組， 并在該劑量的上下各設(shè)計(jì)l2個(gè)劑量組作為預(yù) 試驗(yàn)劑量。 根據(jù)確定的劑量組進(jìn)行染毒。 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的死亡資料確定組距。 可根據(jù)以下公式計(jì)算出劑量分組： i=(lgLD90-lgLD10)(n-1) 或：i=(lgLD100-lgLD0)(n-1) 式中i為組距(相鄰的兩個(gè)劑量組對(duì)數(shù)劑量之差)； n為設(shè)計(jì)的劑量組數(shù)。,（3）正

6、式試驗(yàn) 根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)所選用的LD50計(jì)算方法來確定組數(shù)。 例如，幾率單位法、寇氏法一般設(shè)510個(gè)劑量組； 霍恩氏法固定設(shè)4個(gè)劑量組。 求得i值后，以最低劑量組(LD0或LD10)的對(duì)數(shù)劑量 加上一個(gè)i值，即是第二個(gè)劑量組的對(duì)數(shù)劑量，依 此類推直至最高劑量組，查各自的反對(duì)數(shù)即得出各 組劑量的真實(shí)值。 1 2 3 4 5 6 LgLD0 LgLD0+i LgLD0+2i LgLD0+3i LgLD0+4i ,死亡和死亡時(shí)間 重點(diǎn)觀察和記錄每只動(dòng)物死亡的時(shí)間，特 別是最早出現(xiàn)死亡的時(shí)間以及各個(gè)劑量組 動(dòng)物的死亡數(shù)。,體重 在觀察試驗(yàn)動(dòng)物中毒癥狀的過程中，應(yīng)同時(shí)觀察 體重的變化。 體重可以反映動(dòng)物中毒

7、后的整體變化。 體重改變的原因很多： *若化學(xué)毒物刺激或損傷消化道可出現(xiàn)試驗(yàn)動(dòng)物飲食減少 甚至拒食，表現(xiàn)為體重減輕； *若化學(xué)毒物引起腹瀉，將影響食物吸收和利用，體重也 會(huì)減輕； *如果化學(xué)毒物影響水的攝取或腎功能急性損傷，也可能 在體重上反映出來。,寇氏法（Karbor）,1. 預(yù)試驗(yàn)：預(yù)試實(shí)驗(yàn) 取小鼠16只，隨機(jī)分 成4組，組間劑量之比為2:1。記錄各組動(dòng)物 死亡率，粗略獲得最大的不致死量（LD0） 和最大的致死量（LD100）。 2. 正式試驗(yàn) 動(dòng)物數(shù)：除另有要求外，一般設(shè)510個(gè)劑 量組，每組610只動(dòng)物為宜。,劑量確定：在LD0與LD100之間按等比級(jí)數(shù) 插入幾個(gè)中間劑量組。相鄰劑量

8、公比，按下式 計(jì)算：i= (lgLD100-lgLD0)(n-1) （1） n為欲分組數(shù)； 則各組劑量分別為下列各數(shù)值的反對(duì)數(shù)： lgLD0 lgLD0+i lgLD0+2i lgLD0+3i lgLD0+4i .。 設(shè)通過預(yù)試驗(yàn)，求得普魯卡因的lgLD0為164mg/kg, lgLD100為250mg/kg，準(zhǔn)備分成5組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，各組 劑量為多少？ 將以上數(shù)據(jù)代入公式（1）：i=0.046 故各組劑量分別為164，182，203，225，250mg/kg,給藥及觀察：取體重1822g小鼠80只， 隨機(jī)分為5組，每組16只，按上述求得的 劑量分組給藥，腹腔注入鹽酸普魯卡因， 觀察并記錄死亡百分

9、率。 結(jié)果記錄 (只) 劑 量 D(mg/kg) LogD=X 死亡數(shù)(只) 死亡率(%) p 16 250 2.3979 15 94.0 0.94 16 225 2.3522 13 81.3 0.813 16 203 2.3075 8 50.0 0.50 16 182 2.2601 5 31.3 0.313 16 164 2.2148 1 6.3 0.063,LD50計(jì)算 寇氏法：LD50=log-11/2(xi+xi+1)(pi-pi+1) 改良的寇氏法： LD50=log-1Xm-i(p-0.5) ， 式中： Xm為最高劑量的對(duì)數(shù)值 （log250=2.3979）； p 為各組動(dòng)物的死亡

10、率，以小數(shù)表示(如80%寫作0.8)； p為各組動(dòng)物死亡率的總和(p1+p2+p3+p4+p5)； i為相鄰兩組劑量(D)對(duì)數(shù)值之差，即： log250-log225=0.0457。 p=2.626 LD50=log-12.3979-0.0457(2.626-0.5) =200(mg/kg),四、急性毒性分級(jí)和評(píng)價(jià),6-2 蓄積毒性作用,一、基本概念,1蓄積作用（accumulation）：外源性化學(xué)物質(zhì)連續(xù)反復(fù)地進(jìn)入機(jī)體，其吸收速度或總量超過代謝轉(zhuǎn)化排出的速度或總量時(shí)，化學(xué)物質(zhì)就可能在體內(nèi)逐漸增加并貯留，這種現(xiàn)象稱為化學(xué)物質(zhì)的蓄積作用。,2物質(zhì)蓄積（material accumulation

11、）：當(dāng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物反復(fù)多次接觸化學(xué)毒物后可以用分析方法在體內(nèi)測(cè)出其原型或代謝產(chǎn)物時(shí)，稱為物質(zhì)蓄積。,3功能蓄積（function accumulation）：化學(xué)物質(zhì)長(zhǎng)期接觸機(jī)體后，機(jī)體內(nèi)雖不能測(cè)出其原形的型或代謝產(chǎn)物，卻出現(xiàn)了慢性毒性作用，稱之為功能蓄積。,二、研究目的 蓄積毒性試驗(yàn)是研究化學(xué)毒物基礎(chǔ)毒性的重 要內(nèi)容之一，目的是通過試驗(yàn)求出蓄積系數(shù) K，了解化學(xué)毒物蓄積毒性的強(qiáng)弱，并為慢性 毒性試驗(yàn)及其他有關(guān)毒性試驗(yàn)的劑量選擇提 供參考。,三、研究方法,（一）蓄積系數(shù)法,1蓄積系數(shù)：是多次染毒使半數(shù)動(dòng)物出現(xiàn)效應(yīng)或死亡的蓄積劑量ED50(n)與一次染毒使半數(shù)動(dòng)物出現(xiàn)相同效應(yīng)（或死亡）的劑量ED50

12、(1)的比值。 KED50(n)ED50(1) KLD50(n)LD50(1),2實(shí)驗(yàn)方案 （1）固定劑量法 （2）劑量遞增法 （3）劑量固定的20天蓄積法,（二）生物半減期法,蓄積系數(shù)法是一種以生物效應(yīng)為指標(biāo)，用經(jīng)驗(yàn)系數(shù)（K）評(píng)價(jià)蓄積作用的方法，即將多次染毒與一次染毒所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)（或死亡）進(jìn)行比較。,固定劑量法： 先求出LD50， 選取相同條件的40只動(dòng)物，分為兩組（染毒組 和對(duì)照組），每組至少20只，雌雄各半。 試驗(yàn)組在120l5 LD50的范圍內(nèi)選定一個(gè) 劑量，每日以固定劑量、定時(shí)和相同途徑進(jìn)行 染毒,試驗(yàn)期間觀察記錄每組動(dòng)物死亡數(shù)。 當(dāng)試驗(yàn)組累積發(fā)生一半動(dòng)物死亡即可終止試驗(yàn)。 計(jì)算

13、累積總接觸劑量LD50(n)，根據(jù)公式計(jì)算 K值，按下表進(jìn)行評(píng)價(jià)。 若接觸劑量已累積達(dá)到5個(gè)LD50劑量，也可終止試驗(yàn)。,蓄積系數(shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn),劑量遞增法：,在試驗(yàn)期間，當(dāng)化學(xué)毒物引起動(dòng)物累積死亡一半時(shí)即可終止 試驗(yàn)，計(jì)算K值進(jìn)行評(píng)價(jià)。一般來說，在試驗(yàn)第21天也可結(jié)束 試驗(yàn)，因?yàn)檫@之前如果動(dòng)物沒有死亡或死亡數(shù)不足一半，說 明其累積劑量已達(dá)5.26LD50，即K5。使用本方法時(shí)要注意 染毒期間定期(每4天一次)給動(dòng)物稱重，按實(shí)測(cè)體重，調(diào)整化 學(xué)毒物的染毒絕對(duì)量。,6-3 亞慢性和慢性毒性,一、亞慢性毒性作用,1概念：亞慢性毒性（subchronic toxicity）是指實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或人連續(xù)較長(zhǎng)期接觸較

14、大劑量的外源性化學(xué)物所產(chǎn)生的中毒效應(yīng)。,2亞慢性毒性試驗(yàn)的目的 3亞慢性毒性試驗(yàn)的方法要點(diǎn),研究受試物亞慢性毒性劑量反應(yīng)關(guān)系，確定 未觀察到有害作用的劑量（NOAEL）和可觀察 到有害作用的最低劑量（LOAEL），提出安全 限量參考值。 觀察受試物亞慢性毒作用特點(diǎn)和毒作用靶器官。 觀察受試物亞慢性毒性作用的可逆性。 為慢性毒理試驗(yàn)的劑量設(shè)計(jì)和觀察指標(biāo)選擇提供依據(jù)。 為受試物毒性機(jī)制研究和將研究結(jié)果外推到人提供依據(jù)。,（1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇,物種和品系 一般要求選擇兩種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物： 嚙齒類（大鼠：Wistar和SD） 非嚙齒類（犬：Beagle犬）,性別、年齡和動(dòng)物數(shù) 兩種性別，雌雄各半； 初斷乳動(dòng)

15、物，大鼠68周齡，體重80100g； 大鼠每組不少于20只，犬、猴每組不少于6只。,微生物學(xué)、寄生蟲學(xué)等級(jí)和飼養(yǎng)環(huán)境 亞慢性毒性試驗(yàn)要求大鼠應(yīng)使用清潔級(jí)及以上等級(jí)，并飼養(yǎng)在屏障環(huán)境內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)。,（2）染毒方式 應(yīng)盡量選擇與人接觸途徑相似的方式； 應(yīng)與預(yù)期進(jìn)行的急性毒性試驗(yàn)的接觸途徑相 一致。 染毒頻率多為每日一次，連續(xù)90天。 在進(jìn)行食品安全性評(píng)價(jià)時(shí)一般采用經(jīng)口染毒 途徑。 有三種方式：灌胃法、喂飼法、膠囊法。,劑量設(shè)計(jì)的原則： 最少設(shè)三個(gè)劑量組和一個(gè)陰性（溶劑）對(duì)照組。 高劑量組應(yīng)能引起明顯的毒性或少量動(dòng)物 死亡（少于10）； 低劑量組應(yīng)無中毒反應(yīng)，相當(dāng)于未觀察到 有害作用劑量（NOAEL）

16、； 理想的中劑量組約相當(dāng)于觀察到有害作用 的最低劑量（LOAEL）。,劑量設(shè)計(jì) 高劑量：1/20LD501/5LD50 三個(gè)劑量組間的組距應(yīng)為310倍，不少于2倍。 以實(shí)際攝入量的100倍作為其中一個(gè)劑量。,（3）劑量選擇和分組,（4）觀察指標(biāo) 一般指標(biāo)： * 外觀體征、行為活動(dòng)； * 動(dòng)物體重； * 飼料消耗量 實(shí)驗(yàn)室檢查： * 血液學(xué)檢查：血液學(xué)常規(guī)指標(biāo) * 血液生化學(xué)檢查 系統(tǒng)尸解和組織病理學(xué)檢查 * 臟器重量和臟器系數(shù) * 病理學(xué)檢查 其他指標(biāo),4. 亞慢性毒性評(píng)價(jià),最大無作用劑量小于或等于人的可能攝入 量的100倍者表示毒性較強(qiáng)，應(yīng)放棄該受 試物用于食品。 最大無作用劑量大于100倍

17、而小于300倍者， 應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行毒性試驗(yàn)。 大于或等于300倍者則不必進(jìn)行慢性毒性試 驗(yàn)，可進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)。,二、慢性毒性作用,1概念：慢性毒性（chronic toxicity）是 指實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或人長(zhǎng)期（甚至終生）低劑量 反復(fù)接觸外源性化學(xué)物所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)。,2慢性毒性試驗(yàn)的目的 研究慢性毒性劑量反應(yīng)關(guān)系。 為制定ADI提供依據(jù)。 觀察慢性毒作用特點(diǎn)和毒作用靶器官。 觀察慢性毒作用的可逆性。 為毒性機(jī)制研究和將毒性結(jié)果外推到人提供依據(jù)。,3慢性毒性試驗(yàn)方法要點(diǎn) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇：大鼠每組4060只。 染毒途徑和時(shí)限 經(jīng)口，每周56次；2年或終生。 劑量分組 觀察指標(biāo)（同亞慢性毒性試驗(yàn)）,根據(jù)亞慢性毒性試驗(yàn)的LOAEL來確定： 高劑量：1/51/2LOAEL； 中劑量：1/501/10LOAEL； 低劑量：1/100LOAEL。