動物急性毒性實驗報告

1、 生物工程綜合實驗動物急性毒性實驗實驗報告集 班級 生工1411 學(xué)號 姓名 蘇州科技大學(xué)化學(xué)生物與材料工程學(xué)院 2017年實驗室學(xué)生守則一、嚴(yán)格遵守實驗室各項規(guī)章制度和管理措施，服從教師及實驗技術(shù)人員的指導(dǎo)。二、嚴(yán)格按照實驗要求，做好實驗預(yù)習(xí),實驗之前5分鐘進(jìn)入實驗室，及時、準(zhǔn)確地完成實驗任務(wù)，實事求是地完成實驗報告，杜絕弄虛作假。三、嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)定，愛護(hù)儀器設(shè)備及工具。凡不按教師的指導(dǎo)擅自操作引起儀器、設(shè)備損壞者，應(yīng)予賠償。四、愛護(hù)實驗室公共財物，節(jié)約水電、材料和試劑。未經(jīng)允許不得隨便挪動非實驗需用的其他儀器，不得隨便拆裝儀器或?qū)x器、工具帶至室外。五、持實驗室的嚴(yán)肅安靜，不得大聲喧嘩、

2、嘻鬧，嚴(yán)禁在實驗室內(nèi)抽煙和吃東西。六、嚴(yán)防事故，確保實驗室安全，發(fā)現(xiàn)異常情況，應(yīng)及時向有關(guān)教師和管理人員報告。七、每次實驗結(jié)束后，主動整理好儀器設(shè)備，歸還所借器材，關(guān)閉電源、水源，按指導(dǎo)老師的要求做好實驗結(jié)束工作及室內(nèi)外的清潔衛(wèi)生工作，經(jīng)指導(dǎo)老師許可后，方可離開。預(yù) 習(xí) 報 告名稱動物急性毒性實驗日期2017.11.27-2017-12.1實驗?zāi)康暮鸵螅菏箤W(xué)生了解毒理學(xué)研究中動物實驗的常規(guī)操作方法和技術(shù)；了解和掌握為了測定一種未知的環(huán)境化學(xué)物對有機(jī)體是否是安全的，必須進(jìn)行哪些試驗，獲得哪些必要的數(shù)據(jù)；這些試驗的基本步驟是什么，試驗數(shù)據(jù)應(yīng)該如何處理。了解和掌握實驗動物的選擇、抓取、常規(guī)染毒和生

3、物材料的采集方法等內(nèi)容、學(xué)習(xí)和掌握急性毒性試驗和生物指標(biāo)試驗的目的，原理，以及測定相關(guān)的參數(shù)，如半數(shù)致死劑量，生長抑制效應(yīng)等所需要的方法和步驟。實驗材料：活環(huán)毛蚓主要儀器：人工氣候箱，分光光度計，冷凍離心機(jī)，試管13支，移液器，振蕩水浴鍋，燒杯，研缽等主要步驟：1. 清腸：挑選一定數(shù)量具有生殖環(huán)帶的健康蚯蚓，用蒸餾水清洗，放于燒杯中，用保鮮膜封口，解剖針扎孔。將燒杯置于溫度為202 ，濕度約75%的人工氣候箱中清腸24h。2. 溶液配制：在直徑18cm的培養(yǎng)皿(或以1000mL燒杯代替)底鋪襯濾紙，以剛好遮住皿底為宜。按預(yù)備實驗確定的劑量，配制系列濃度，取適量倒入培養(yǎng)皿中，以剛好浸沒濾紙為宜3

4、. 濾紙實驗(1). 將清腸后的蚯蚓用去離子水沖洗干凈，濾紙吸干體表水分(2). 每組10條蚯蚓分別稱重，測量體長，供試(3). 每一培養(yǎng)皿放入10條蚯蚓(4). 保鮮膜封口，解剖針扎孔。4. 培養(yǎng)與觀察將培養(yǎng)皿置于人工氣候箱中培養(yǎng)，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)實驗條件：溫度為202，濕度為757%; 光照為1333 lx（間歇光照，即12h光照， 12h黑暗）。計算Cd2+ 暴露后蚯蚓18h的LC50、24h的LC50。5. 低濃度Cd2+急性毒性試驗(l). 在確定蚯蚓的24h LC50 后，進(jìn)行蚯蚓急性毒性實驗。設(shè)置空白對照組，空白對照組用去離子水代替受試物；染毒實驗前重復(fù)上述（1）步驟的清腸。(2). 在

5、蚯蚓的致死范圍內(nèi)設(shè)置4個濃度梯度（0、1/5LC50、1/3 LC50、1/2 LC50）進(jìn)行蚯蚓急性毒性試驗。每組8條。(3). 實驗24h 后取各濃度處理組蚯蚓3 條做平行試驗，洗凈剪取其環(huán)帶前部分，用磷酸緩沖液洗掉表面血液，用濾紙吸干水分，放入研缽加2 mL 磷酸緩沖液進(jìn)行研磨，再進(jìn)行離心（9，000 rmin-1）10 min，上清液即為粗酶液。(4).采用改進(jìn)鄰苯三酚自氧化法測定SOD活性。鄰苯三酚自氧化速率的測定：取4.5mL0.1molL -1Tris-HCl（pH =8.2）緩沖液，4.2 mL蒸餾水，混勻后在25水浴保溫20 min，取出后立即加入25預(yù)熱過的3 mmolL-

6、1 鄰苯三酚0.3 mL（以10 mmolL -1 HCl 配制，空白管用10 mmolL -1HCl代替鄰苯三酚的HCl 溶液），在25恒溫水浴鍋中水浴，迅速搖勻倒入比色皿（光徑1 cm），每隔30 s在325 nm處測定吸光度A值1次，共測3min。計算線性范圍內(nèi)每分鐘A 的增值，此即為鄰苯三酚的自氧化速率。樣品中SOD 酶活力測定：加入鄰苯三酚前，先加入一定體積的SOD 粗酶液（約0.2 mL，需稀釋），蒸餾水減少相應(yīng)體積（即粗酶液和蒸餾水總體積為4.2 mL），其它均與上述中所述一致，計算加粗酶液后鄰苯三酚自氧化速率。需稀釋至3min內(nèi)數(shù)值均有變化；數(shù)值大于1。每毫升反應(yīng)液中，每分鐘抑

7、制鄰苯三酚自氧化速率達(dá)50%的酶量定義為一個酶單位。酶活性單位的計算公式如下：教師簽名： 實驗報告動物急性毒性實驗一、 實驗?zāi)康模菏箤W(xué)生了解毒理學(xué)研究中動物實驗的常規(guī)操作方法和技術(shù)；了解和掌握為了測定一種未知的環(huán)境化學(xué)物對有機(jī)體是否是安全的，必須進(jìn)行哪些試驗，獲得哪些必要的數(shù)據(jù)；這些試驗的基本步驟是什么，試驗數(shù)據(jù)應(yīng)該如何處理。二、實驗原理濾紙接觸法毒性實驗簡單易行，實驗時間短，實驗成本較低，可對受試物毒性進(jìn)行初篩。 將蚯蚓與濕潤的濾紙上的受試物接觸，可測定土壤中受試物對蚯蚓的潛在影響。動物機(jī)體中有一套有效的抗氧化防御系統(tǒng)（Antioxidant defense），包括過氧化物歧化酶（Super

8、oxide dismutase, SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶 （Glutathione peroxidase, GPx）、過氧化氫酶（Catalase, CAT）等，它們可分解進(jìn)入生物體有傷害作用的異源氧化物。由于能反映多種污染物的毒性，而且其變化可定量檢測，因此抗氧化酶常被用作指示環(huán)境污染的早期預(yù)警，是分子生態(tài)毒理學(xué)生物標(biāo)志物的研究熱點之一。三、實驗材料與方法1、實驗材料與試劑：活環(huán)毛蚓氯化鎘，Tris-HCl溶液，鄰苯三酚，磷酸緩沖液2、實驗儀器：人工氣候箱，分光光度計，冷凍離心機(jī)，試管13支，移液器，振蕩水浴鍋，燒杯，研缽。3、實驗方法：1. 清腸將直徑11cm的濾紙鋪于1000mL燒

9、杯杯底（或培養(yǎng)皿），加少量水，以剛浸沒濾紙為宜。挑選一定數(shù)量具有生殖環(huán)帶的健康蚯蚓，用蒸餾水清洗，放于燒杯中，用保鮮膜封口，解剖針扎孔。將燒杯置于溫度為202 ，濕度約75%的人工氣候箱中清腸24h。 2. 溶液配制在直徑18cm的培養(yǎng)皿(或以1000mL燒杯代替)底鋪襯濾紙，以剛好遮住皿底為宜。按預(yù)備實驗確定的劑量，配制系列濃度，取適量倒入培養(yǎng)皿中，以剛好浸沒濾紙為宜。3. 濾紙實驗(1). 將清腸后的蚯蚓用去離子水沖洗干凈，濾紙吸干體表水分。(2). 每組10條蚯蚓分別稱重，測量體長，供試。(3). 每一培養(yǎng)皿放入10條蚯蚓。(4). 保鮮膜封口，解剖針扎孔。4. 培養(yǎng)與觀察 (l). 將

10、培養(yǎng)皿置于人工氣候箱中培養(yǎng)，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)實驗條件：溫度為202，濕度為757%; 光照為1333 lx（間歇光照，即12h光照， 12h黑暗）。 (2). 在202環(huán)境培養(yǎng)。 (3). 18h 、24h各計數(shù)1次，記錄死亡數(shù)，同時還有蚯蚓的病理癥狀和行為。蚓體對針刺無反應(yīng)判為死亡。24h后每組活蚯蚓分別稱重，測量體長。24h后結(jié)束實驗。 (4).計算Cd2+ 暴露后蚯蚓18h的LC50、24h的LC50。5. 低濃度Cd2+急性毒性試驗 (l). 在確定蚯蚓的24h LC50 后，進(jìn)行蚯蚓急性毒性實驗。設(shè)置空白對照組，空白對照組用去離子水代替受試物；染毒實驗前重復(fù)上述（1）步驟的清腸。(2). 在

11、蚯蚓的致死范圍內(nèi)設(shè)置4個濃度梯度（0、1/5LC50、1/3 LC50、1/2 LC50）進(jìn)行蚯蚓急性毒性試驗。每組8條。 (3). 實驗24h 后取各濃度處理組蚯蚓3 條做平行試驗，洗凈剪取其環(huán)帶前部分，用磷酸緩沖液洗掉表面血液，用濾紙吸干水分，放入研缽加2 mL 磷酸緩沖液進(jìn)行研磨，再進(jìn)行離心（9，000 rmin-1）10 min，上清液即為粗酶液。 (4).采用改進(jìn)鄰苯三酚自氧化法測定SOD活性。 鄰苯三酚自氧化速率的測定：取4.5mL0.1molL -1Tris-HCl（pH =8.2）緩沖液，4.2 mL蒸餾水，混勻后在25水浴保溫20 min，取出后立即加入25預(yù)熱過的3 mmo

12、lL-1 鄰苯三酚0.3 mL（以10 mmolL -1 HCl 配制，空白管用10 mmolL -1HCl代替鄰苯三酚的HCl 溶液），在25恒溫水浴鍋中水浴，迅速搖勻倒入比色皿（光徑1 cm），每隔30 s在325 nm處測定吸光度A值1次，共測3min。計算線性范圍內(nèi)每分鐘A 的增值，此即為鄰苯三酚的自氧化速率。 樣品中SOD 酶活力測定：加入鄰苯三酚前，先加入一定體積的SOD 粗酶液（約0.2 mL，需稀釋），蒸餾水減少相應(yīng)體積（即粗酶液和蒸餾水總體積為4.2 mL），其它均與上述中所述一致，計算加粗酶液后鄰苯三酚自氧化速率。需稀釋至3min內(nèi)數(shù)值均有變化；數(shù)值大于1。 四、實驗結(jié)果與

13、分析：1、受試物的基本物化性質(zhì)；實驗動物的飼養(yǎng)條件（包括溫度、濕度、光照條件等）。氯化鎘：外觀與性狀：無色單斜晶體 熔點()：568 相對密度（水=1）：4.05沸點()：960溶解性：易溶于水，溶于甲醇、乙醇。水溶液中的鎘離子可被硫離子沉淀。蚯蚓的飼養(yǎng)條件：溫度18-22，光照，保證濕度2、染毒處理前后蚯蚓外觀生長發(fā)育變化表（體重、體長、行為等）。表1 Cd2+染毒處理前蚯蚓外觀生長發(fā)育變化表項目Cd2+處理濃度（mg L-1）0(CK)12345數(shù)量（條）111111111312總體重（g）6.106.215.935.826.165.77平均體重（g）0.550.560.540.530.4

14、70.48平均體長(cm)6.747.126.956.687.36.22行為正常蠕動正常蠕動正常蠕動正常蠕動正常蠕動正常蠕動表2 Cd2+染毒處理24h后蚯蚓外觀生長發(fā)育變化表項目Cd2+處理濃度（mg L-1）0(CK)12345數(shù)量（條）1111111040總體重（g）5.726.214.474.111.160平均體重（g）0.510.560.410.410.290平均體長(cm)6.436.656.295.364.50行為正常蠕動蠕動減弱蠕動減弱蠕動減弱蠕動減弱無分析：由表1，2可見除了全部死亡的蚯蚓之外，在體重和體長方面，其余各組的蚯蚓總體重和平均體重均減小，平均體長均減小，濃度最高的

15、一組減小的幅度最大。在蚯蚓的行為活動方面，染毒前蚯蚓活力旺盛，正常蠕動，Cd2+處理24小時之后，除對照組里的蚯蚓正常蠕動之外，其余各組的蚯蚓的行為活動均受到不同程度的影響，蠕動速度隨著Cd2+的濃度升高而逐漸減弱3、致死時各組蚯蚓個體的形態(tài)和解剖觀察：觀察結(jié)果主要部位（環(huán)狀帶）。解剖后蚯蚓的形態(tài)觀察：1組為對照組，可清晰地觀察到蚯蚓的體腔清晰透明，血管呈鮮紅色，腸道為正常的棕灰色，生殖腺呈白色球狀，對稱分布與兩側(cè)，結(jié)構(gòu)完整。2組染毒濃度較低，與1組差距不大，但血管顏色略微變深，腸道略微發(fā)黑。從3組開始，隨著染毒濃度的升高，體色逐漸變淺，體腔逐漸渾濁，血管顏色變深發(fā)黑，腸道顏色發(fā)黑，和體腔粘合

16、在一塊，生殖腺破碎化膿，顏色略微發(fā)黃，不再是純白色的球狀。染毒18小時蚯蚓形態(tài)觀察：1組為對照組，2-6組濃度梯度逐漸增加，由上圖觀察得，除對照組體表正常，蠕動正常之外，2-4組未死的蚯蚓出現(xiàn)部分癥狀，蠕動能力明顯減弱，身體變軟萎縮，體色變淺，環(huán)帶腫大充血呈黃色，有黃色體液滲出。5組和6組兩個濃度梯度蚯蚓有斷裂現(xiàn)象，有的斷成多節(jié)，呈串珠狀；濾紙上有血跡。染毒24小時蚯蚓形態(tài)觀察：1組為對照組，由于18小時第6組全部死亡，所以2-5組濃度梯度逐漸增加，對照組體表正常，但由于缺乏養(yǎng)分，蠕動速度減慢，成團(tuán)聚集在一起，2-3組正常存活，但上述癥狀更加明顯，且成團(tuán)聚集，4-5組出現(xiàn)死亡，死亡的蚯蚓癥狀如

17、上所述，而存活的蚯蚓體色明顯變淺，幾乎不蠕動，同樣成團(tuán)聚集。4、記錄不同受試物濃度對應(yīng)的死亡情況，以劑量對數(shù)為橫坐標(biāo)，死亡百分率為縱坐標(biāo)作 圖并求得半數(shù)致死濃度LC50。表3 Cd2+染毒處理18h后蚯蚓的死亡情況統(tǒng)計表項目Cd2+處理濃度（mg L-1）0(CK)12345數(shù)量（條）111111111312死亡數(shù)（條）0000712死亡率（%）000053.8%100%平均死亡數(shù)（條）0.275平均死亡率（%）25.6%計算出18h的LC50=1557.908表4 Cd2+染毒處理24h后蚯蚓的死亡情況統(tǒng)計表項目Cd2+處理濃度（mg L-1）0(CK)12345數(shù)量（條）111111111

18、312死亡數(shù)（條）0001912死亡率（%）0009.1%33.3%100%平均死亡數(shù)（條）0.318平均死亡率（%）29.7%計算出24h的LC50=1314.8115、計算并分析Cd2+處理對環(huán)毛蚓SOD酶活的影響。1) 鄰苯三酚的自氧化速率計算可得A=0.0532) Cd2+處理對環(huán)毛蚓SOD酶活的影響各處理樣品的鄰苯三酚的自氧化速率Cd2+處理對環(huán)毛蚓SOD酶活的影響SOD酶活Cd2+處理濃度（mg L-1）0(CK)1/5LC501/3LC501/2LC5010.0500.1130.1500.19720.0750.0960.1380.18430.0620.1050.1420.201平

19、均酶活性0.0620.1050.1430.194分析：隨著Cd2+處理濃度增加，環(huán)毛蚓SOD的平均酶活性增加。因為SOD（超氧化物歧化酶）是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，具有特殊的生理活性，能消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，所以隨著Cd2+ 濃度升高，環(huán)毛蚓體內(nèi)代謝有毒物質(zhì)的速度也越來越快，因此SOD酶活性越來越高。6、蛋白質(zhì)的測定Cd2+處理濃度（mg L-1）0(CK)1/5LC501/3LC501/2LC50體重（g）0.440.420.360.47蛋白濃度(g/L)1.1581.6572.1552.654五、結(jié)論本次實驗的目的在于解毒理學(xué)研究中動物實驗的常規(guī)操作方法和技術(shù)，了解測定一種未知的環(huán)境化學(xué)物對生物體是否是安全的，必須進(jìn)行哪些試驗，獲得哪些必要的數(shù)據(jù)；這些試驗的基本步驟是什么，試驗數(shù)據(jù)應(yīng)該如何處理等等。同時我們也了解了實驗動物蚯蚓的生活習(xí)性和受試物氯化鎘的理化性質(zhì)，和掌握了急性毒性試驗以及測定相關(guān)的參數(shù)，如半數(shù)致死劑量，生長抑制效應(yīng)等所需要的方法和步驟。通過對蚯蚓染毒前后的性狀比較可從表觀上觀察到重金屬對有機(jī)體的巨大毒害作用，而通過計算蚯蚓體內(nèi)消除有毒物質(zhì)的SOD酶活性，可充分認(rèn)識到生物體對外來有毒物質(zhì)的侵害做出的一系列應(yīng)對措施。近年來，隨著人口增加及經(jīng)濟(jì)發(fā)展，我國面臨的土壤環(huán)境安全問題越加突出。重金屬和石油類的污染，致使生態(tài)環(huán)境和