（推薦）布魯氏菌病實(shí)驗(yàn)研究及生物安全

1、1,布魯氏菌病實(shí)驗(yàn)研究及生物安全 Research Progress of Brucellosis in China and Control and Prevention,2,中國(guó)人間布魯氏菌病疫情1950-2014年,3,中國(guó)人間布魯氏菌病空間分布變化,4,中國(guó)家畜布魯氏菌病疫情,2014年中國(guó)布魯氏菌病疫情分布,中國(guó)人間布魯氏菌病疫情,5,6,2012/2013/2014年布病病例報(bào)告分析,7,Amsterdam, The Netherlands www.kit.nl,世界衛(wèi)生組織建議的人布魯氏菌病診斷,世衛(wèi)組織建議的檢測(cè)包括： 虎紅平板試驗(yàn)(RBT) 血清凝集試驗(yàn)(SAT) Coombs

2、試驗(yàn) 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT) ELISA 熒光偏振 布氏菌培養(yǎng) PCR 世衛(wèi)組織未具體確定流程、取舍值和檢測(cè)特征（診斷靈敏性和特異性） 沒(méi)有明確的陽(yáng)性和陰性預(yù)測(cè)值（PPV 11(3):221-5,不同來(lái)源（品牌）和批次的抗原質(zhì)量差異很大 難以解讀（弱陽(yáng)性） 由于暴露和非特異性反應(yīng)，在疾病流行地區(qū)的表現(xiàn)不良 需要確定取舍值 結(jié)論 診斷功效在很大程度上取決于制劑來(lái)源和疾病流行程度，需要確定取舍值,10,血清凝集檢測(cè),1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280,發(fā)現(xiàn)凝集抗體（IgM和IgG) 靈敏性隨疾病持續(xù)時(shí)間下降 頑固性和布病復(fù)發(fā)患者中表現(xiàn)不佳 在本地流行地區(qū)/暴露個(gè)體

3、中的特異性較低 流行地區(qū)的建議取舍值為1：320，提高特異性導(dǎo)致的低靈敏度 難以讀取和標(biāo)準(zhǔn)化 2-ME檢測(cè)可用于確診急性病 (IgM的指示性滴度降低2倍或2倍以上）,11,布氏菌可被堿性染料著色，如革蘭染色為陰性，姬姆莎染色呈紅色，布氏菌對(duì)染料吸收緩慢,布氏菌革蘭染色,12,雙相全血培養(yǎng)瓶 （已接種）,13,自動(dòng)培養(yǎng)儀和培養(yǎng)瓶,14,布氏菌生化鑒定,15,血平皿 布氏菌菌落,16,布氏瓊脂布魯氏菌菌落,17,布氏菌產(chǎn)生S2H試驗(yàn),18,BCSP31-PCR,引物和擴(kuò)增片段，產(chǎn)物223bp Primer1：B4 5-TGG CTC GGT TGC CAA TAT CAA-3 Primer2：B5

4、 5-CGC GCT TGC CTT TCA GGT CTG-3 檢測(cè)BCSP31基因的PCR方法，可以在屬的水平上檢測(cè)和鑒定布魯氏菌菌株 OIE推薦鑒定布魯氏菌種的方法之一,19,M DL2000 DNA Ladder1。B. melitensis 2. B. abortus 3. B. suis 4. B. ovis 5. B. neotomae 6.B. canis,M 1 2 3 4 5 6,布魯氏菌屬BCSP31-PCR電泳結(jié)果,-223bp,20,AMOS-PCR 鑒定布氏菌種,布魯氏菌DNA多態(tài)性一個(gè)原因就是插入序列分布，IS711就是一段插入序列，在數(shù)量和位置上都很保守，一個(gè)引

5、物錨定在IS711上，其他不同的引物分別選在與插入基因IS711鄰近的單染色體DNA上，代表種的特異性，通過(guò)擴(kuò)增帶的大小來(lái)鑒別種。設(shè)計(jì)5條引物的混合反應(yīng)體系，適用于布魯氏菌種間的鑒定方法，可鑒別布氏菌牛種1，2，4型、羊種布魯氏菌、豬種1型和綿羊附睪種。除了共有的178bp以外牛種布魯氏菌1，2，4型擴(kuò)增條帶為498bp，羊種布魯氏菌擴(kuò)增片段為731bp，豬種1型擴(kuò)增條帶為285bp，綿羊附睪種961bp。,21,19株標(biāo)準(zhǔn)菌株AMOS-PCR擴(kuò)增結(jié)果,1、22.DL2000 DNA Ladder 2-4.B. Melitensis 1-3 5-11.B. Abortus 1 -7 12.B.

6、 Abortus 9 13-17.B. Suis .1 -5 18. B. ovis 19. B. neotomae 20. B. canis 21.陰性對(duì)照,22,750bp 500bp 250bp,M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11,250bp223bp,布魯氏菌屬 種鑒定,1-5AMOS擴(kuò)增 1、c- 2、羊1 3、牛1 4、豬1 5、待檢菌株6-10 BCSP31-PCR ：6、羊1 7、牛1 8、豬1 9、OVIS 10、待檢菌株,23,多重PCR(Bruce ladder),Evaluation of a Multiplex PCR Assay (Bruce-lad

7、der) for Molecular Typing of All Brucella Species, Including the Vaccine Strains,24,B. abortus,B. melitensis,B. suis,B. cains,布氏菌 MLVA 分型,25,中國(guó)分離株的基因型分布,26,生物安全,布氏菌在病原微生物的危害等級(jí)劃分； 2類 屬于高致病性 實(shí)驗(yàn)室適用等級(jí)分類：BSL-3 其中弱毒株或疫苗株可在BSL-2實(shí)驗(yàn)室操作 小量標(biāo)本，初代分離等可以在BSL-2實(shí)驗(yàn)室操作 血清學(xué)檢測(cè)可以在BSL-1實(shí)驗(yàn)室操作,27,1、布魯氏菌 強(qiáng)毒菌株、疫苗菌株、弱毒菌株均可能造成人

8、體感染，感染所需菌量會(huì)有較大差別。 2 、實(shí)驗(yàn)活動(dòng)與實(shí)驗(yàn)室級(jí)別要求 布病血清學(xué)實(shí)驗(yàn)可以在BSL-1實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行 未知標(biāo)本分離菌、少量菌株實(shí)驗(yàn)、弱毒菌株的實(shí)驗(yàn)在BSL-2實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行 布氏菌的抗原制備、菌種保存在BSL-3,生物安全,28,29,注：,a大量活菌操作：實(shí)驗(yàn)操作涉及“大量”病原菌的制備，或易產(chǎn)生氣溶膠的實(shí)驗(yàn)操作（如病原菌離心、凍干等）。 c樣本檢測(cè)：包括樣本的病原菌分離純化、藥物敏感性實(shí)驗(yàn)、生化鑒定、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)、PCR核酸提取、涂片、顯微觀察等初步檢測(cè)活動(dòng)。 d非感染性材料的實(shí)驗(yàn)：如不含致病性活菌材料的分子生物學(xué)、免疫學(xué)等實(shí)驗(yàn)。,30,生物安全,病原微生物實(shí)驗(yàn)室感染分析 實(shí)驗(yàn)室獲得性感

9、染（laboratory-acquired infection） 由于沒(méi)有監(jiān)測(cè)、報(bào)告系統(tǒng)，數(shù)據(jù)資料不全 生物安全包括：實(shí)驗(yàn)室實(shí)踐、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)、個(gè)人防護(hù)措施和安全設(shè)備,31,生物安全,美國(guó)一份文件統(tǒng)計(jì) 實(shí)驗(yàn)室感染43%由細(xì)菌，27%由病毒，15%由立克次體 布氏菌是最常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)室獲得性感染 最多的操作是：動(dòng)物攻毒試驗(yàn)，凍干菌種，強(qiáng)毒株的大量抗原制備等,32,生物安全,感染途徑 吸入、皮膚粘膜污染、攝入等 吸入感染 很多操作可產(chǎn)生氣溶膠，如：感染動(dòng)物的皮毛、糞便，燒接種環(huán)、抽真空、離心、攪拌、研磨等 氣溶膠5um液滴核會(huì)懸浮于空中， 皮膚粘膜污染：含病原體的液體濺在眼睛、口鼻粘膜及其他皮膚感染 攝

10、入感染：誤食和不洗手吃食物 接種感染,33,當(dāng)實(shí)驗(yàn)室活動(dòng)涉及傳染或潛在傳染性生物因子時(shí)，應(yīng)進(jìn)行危害程度評(píng)估。危害程度評(píng)估應(yīng)至少包括下列內(nèi)容：生物因子的種類（已知的、未知的或未知傳染性的生物材料）、來(lái)源、傳染性、致病性、傳播途徑、在環(huán)境中的穩(wěn)定性、感染劑量、濃度、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、預(yù)防和治療。危害程度評(píng)估應(yīng)由適當(dāng)?shù)挠薪?jīng)驗(yàn)的專業(yè)人員進(jìn)行。,生物安全的評(píng)估,34,生物安全設(shè)備,生物安全柜 吸附墊：在操作臺(tái)上放上貼有吸附材料的塑料薄膜，每日更換，可以把操作臺(tái)的污染減少到最低程度。 柜內(nèi)實(shí)驗(yàn)器材和材料的取出：生物安全實(shí)驗(yàn)室的廢棄的污染性材料、使用過(guò)的包裝材料、容器、紙張等廢棄物，都收裝好或者經(jīng)高壓滅菌器滅菌

11、后拿到緩沖區(qū)：實(shí)驗(yàn)中或完畢后，必須從安全柜中取出非滅活的病原體時(shí)，應(yīng)裝好放在消毒液槽中，使容器外側(cè)被消毒后取出，消毒液種類因病原體不同而異。,35,生物安全設(shè)備,回收容器：在安全柜內(nèi)配置回收污染物質(zhì)的容器：配置存放污染的玻璃器皿和廢棄物容器。容器中必須配有消毒液，將污染物質(zhì)完全浸沒(méi)。這些回收容器至少每天操作完畢后蓋好以防污染。再次使用時(shí)需重新清配置消毒液。 瓶蓋：安全柜內(nèi)使用的瓶子不用橡膠塞，而用螺旋蓋，開(kāi)啟時(shí)可減少氣溶膠的發(fā)生。 消毒火焰：用火焰消毒是經(jīng)典的微生物學(xué)操作方法，但是由于會(huì)產(chǎn)生氣溶膠，并顧慮使柜內(nèi)氣流紊亂，盡量不使用。,36,良好的內(nèi)務(wù)行為,應(yīng)指定專人監(jiān)督保持良好內(nèi)務(wù)的行為。工作區(qū)應(yīng)時(shí)刻保持整潔有序。禁止在工作場(chǎng)所存放可能導(dǎo)致阻礙和絆倒危險(xiǎn)的大量物品。 所有用于處理污染性材料的設(shè)備和工作表面在每班工作結(jié)束、有任何漏出或發(fā)生了其他污染時(shí)應(yīng)使用適當(dāng)?shù)脑噭┣鍧嵑拖尽?對(duì)漏出的樣本或培養(yǎng)物應(yīng)在風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估后清除并對(duì)涉及區(qū)域去污染。清除時(shí)應(yīng)使用有效的安全預(yù)防措施、安全方法和個(gè)人防護(hù)裝備。,37,良好的內(nèi)務(wù)行為,內(nèi)務(wù)行為改變時(shí)應(yīng)報(bào)告實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人以確保避免發(fā)生無(wú)意識(shí)的風(fēng)險(xiǎn)或危險(xiǎn)。 實(shí)驗(yàn)室行為、工作習(xí)慣或材料改變可能對(duì)內(nèi)務(wù)和/或維護(hù)人員有潛在危險(xiǎn)時(shí)，應(yīng)報(bào)告實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人，并書(shū)面告知內(nèi)務(wù)和維護(hù)人員的管理者。 應(yīng)制定在發(fā)生事故或漏出導(dǎo)致