分子生物學3DNA的修復和轉座

1、DNA作為遺傳物質的兩個特性： 穩(wěn)定性: maintaining individual and species 變異性:for evolution 2.5 DNA2.5 DNA的損傷和修復的損傷和修復 在進化過程中生物細胞所獲得的修復在進化過程中生物細胞所獲得的修復DNADNA損傷的能力是生物能保持遺傳損傷的能力是生物能保持遺傳 穩(wěn)定性的關鍵。細胞中能進行修復的生物大分子只有穩(wěn)定性的關鍵。細胞中能進行修復的生物大分子只有DNADNA，表明，表明DNADNA對生對生 物的重要性。物的重要性。 在生物進化中，變異與遺傳是普遍存在的既對立又統(tǒng)一的矛盾，在生物進化中，變異與遺傳是普遍存在的既對立又統(tǒng)一

2、的矛盾，DNADNA分子分子 的變化并不是全部都可被修復的，因此生物才有變異和進化。的變化并不是全部都可被修復的，因此生物才有變異和進化。 DNA變異的三個主要來源： DNADNA復制不準確性復制不準確性 外界環(huán)境或內部因素對遺傳物質的損外界環(huán)境或內部因素對遺傳物質的損 傷傷 轉座子（轉座子（Transposon Transposon ）元件的插入造）元件的插入造 成成 2.5.12.5.1DNA DNA 變異或損傷的來源變異或損傷的來源 （1 1）DNADNA復制不準確性 DNA復制是嚴格而精確的事件，但也可能發(fā)生錯誤。雖然有堿基互補配對 和 pol的校正作用，但錯配率仍有10 -10 左右

3、。 染色體上有些位點是熱點，復制錯誤率高染色體上有些位點是熱點，復制錯誤率高 These mutation-prone sequences are repeats of simple di-, tri- or tetranucleotide sequences, which are known as . Mutations arise not only from errors in replication but also from damage to the DNA. Some damage is caused, as we shall see, by environmental facto

4、rs, such as radiation and so-called mutagens（誘變 劑）, which are chemical agents that increase the rate of mutation But DNA also undergoes spontaneous damage depends on an aqueous environment （2 2）外界環(huán)境或內部因素對）外界環(huán)境或內部因素對DNADNA的損傷的損傷 電離輻射電離輻射 Ionizing （x-and -rays）and nonionizing （UV） radiation produce a

5、variety of DNA lesions. 受到紫外線照射時，DNADNA鏈上相鄰的嘧啶以共價鍵連接形 成二聚體。(P56,(P56,圖2-322-32） 化學因素化學因素 烷化劑烷化劑：硫酸二甲酯，甲烷磺酸甲酯等使堿基烷化，導：硫酸二甲酯，甲烷磺酸甲酯等使堿基烷化，導 致復制時堿基錯配。致復制時堿基錯配。 如鳥嘌呤如鳥嘌呤 被烷化后，被烷化后， 與配對，與配對， 使轉使轉 變?yōu)?。變?yōu)椤?硝酸鹽硝酸鹽：亞硝酸鹽：亞硝酸鹽 能使能使C C脫氨變成脫氨變成U U， 經過復制就可使經過復制就可使 DNADNA上的上的G-CG-C變成變成 A-TA-T對。對。 DNA is also subjec

6、t to attack from reactive oxygen species (for example, O2-. H2O2, and OH). 活性氧的攻擊活性氧的攻擊 堿基類似物堿基類似物：如溴尿嘧啶（：如溴尿嘧啶（5-BU5-BU），）， - -氟尿嘧啶氟尿嘧啶(5-FU)(5-FU)等，它們的結構等，它們的結構 與堿基相似，進入細胞能代替正常的與堿基相似，進入細胞能代替正常的 堿基參入到堿基參入到DNADNA連中而干擾連中而干擾DNADNA的復制。的復制。 5-BU5-BU與與T T結結 構相似，在酮構相似，在酮 式時，與式時，與A A配配 對；它呈烯醇對；它呈烯醇 式結構，與式結

7、構，與G G 配對。在復制配對。在復制 時導致時導致A-TA-T轉轉 換為換為G-CG-C 酮式 嵌入試劑可以導致一個甚至幾個堿基對的插入或缺失 The Ames test（艾姆斯氏試驗） (檢查化學物質潛在的致癌作用，可以從其誘變能力方便 的估計) 堿基自發(fā)改變造成的損傷堿基自發(fā)改變造成的損傷 堿基的互構異變堿基的互構異變，會使堿基間發(fā)生錯配，使，會使堿基間發(fā)生錯配，使 A-C,G-TA-C,G-T。 DNADNA的水解或脫的水解或脫-NH2-NH2：堿基環(huán)外的堿基環(huán)外的-NH2-NH2有時有時 會發(fā)生自行脫落，使會發(fā)生自行脫落，使CU,AI (CU,AI (次黃嘌次黃嘌 呤），呤）， GX

8、 (GX (黃嘌呤）；復制時黃嘌呤）；復制時U-AU-A， I- CI- C， I -X I -X 配對，導致子代配對，導致子代DNADNA序列錯序列錯 誤誤. . 最常見和最重要的水解損傷是胞嘧啶的脫氨 基。（P54,圖2-30) 脫氨基作用使腺嘌呤轉變?yōu)榇吸S嘌呤 （ hypoxanthine，I）, which hydrogen bonds to cytosine rather than to thymine; 鳥嘌呤轉變?yōu)辄S嘌呤 (xanthine), which continues to pair with cytosine, though with only two hydrogen

9、 bonds. DNA 也會自發(fā)水解C-N糖苷鍵而發(fā)生脫嘌呤 作用 （depurination）, 在 DNA分子中產 生無堿基位點。 DNA 復制錯誤和DNA損傷會導致以 下兩種結果： Some kinds of damage, such as thymine dimers or nicks and breaks in the DNA backbone, prevent its use as a template for replication and transcription. Other kinds of damage create altered bases that have no

10、 immediate structural consequence on replication but cause mispairing; these can result in a permanent alteration to the DNA sequence after replication. The two challenge for the cell: First, it must scan the genome to detect errors in synthesis and damage to the DNA. Second, it must repair the lesi

11、ons and do so in a way that, if possible, restores the original DNA sequence. 2.5.22.5.2 復制錯誤及損傷修復復制錯誤及損傷修復 細胞有一套用來檢驗錯配并對之進行修復的機制。細胞有一套用來檢驗錯配并對之進行修復的機制。 DNA修復系統(tǒng)修復系統(tǒng)功能功能 錯配修復恢復錯配 切除修復（堿基、核苷酸）切除突變的堿基和核苷酸片段 重組修復復制后的修復，重新啟動停滯的復制叉 DNA直接修復修復嘧啶二體或甲基化DNA SOS系統(tǒng)DNA的修復，導致變異 存在于E.Coli中的DNA修復系統(tǒng) The mismatch repa

12、ir system faces two challenges： First, it must scan the genome for mismatches. Because mismatches are transient (they are eliminated following a second round of replication when they result in mutations), the mismatch repair system must rapidly find and repair mismatches. Second, the system must cor

13、rect the mismatch accurately; that is. it must replace the misincorporated nucleotide in the newly synthesized strand and not the correct nucleotide in the parental strand. 保證DNA復制高保真的最后責任由錯配修復系統(tǒng)承擔。 2.5.2.12.5.2.1 錯配修復錯配修復 錯配由錯配修復蛋白MutS 的二聚體來檢測，從錯 配引起骨架的扭 曲變形上識別。 錯配修復更正新引入的錯 配堿基。 helicase UvrD. 錯配修復

14、能將逃脫校正閱覽的錯誤去除錯配修復能將逃脫校正閱覽的錯誤去除 系統(tǒng)識別母鏈的依 據來自Dam甲基化 酶，它能使位于5- GATC序列中A的N6 位甲基化。 A的甲基化是錯配修 復系統(tǒng)的識別標志。 eukaryotes have multiple MutS-like proteins(MSH) with different specificities. For example, one is specific for simple mismatches, whereas another recognizes small insertions or deletions resulting slip

15、page during DNA replication. 最近研究表明，最近研究表明， MutS MutS 類似物類似物(MSH) (MSH) 與復與復 制體上的滑動夾元件（制體上的滑動夾元件（PCNA PCNA ）相互作用，）相互作用， 因此可被引到后滯鏈因此可被引到后滯鏈DNADNA不連續(xù)合成的部不連續(xù)合成的部 位上。與滑動夾的相互作用也可能將錯配位上。與滑動夾的相互作用也可能將錯配 修復蛋白引到前導鏈的修復蛋白引到前導鏈的3 3( (生長中生長中) )端。端。 2.5.2.2 DNA損傷的直接逆轉損傷的直接逆轉 An example of repair by simple reversa

16、l of damage is photoreactivation光復活作用. In photoreactivation, the enzyme DNA photolyase光裂解酶 captures energy from light and uses it to break the covalent bonds linking adjacent pyrimidines. Another example of direct reversal is the removal of the methyl group from the methylated base O6-methylguanine

17、a methyltransferase (甲基化轉移酶)removes the methyl group from the guanine residue by transferring it to one of its own cysteine residues(半胱氨酸殘基)。 This repair process is expensive, the enzyme seems to be irreversible inactivated, so we call it a “suicide enzyme” to denote the fact that it “dies” in perfo

18、rming its function. 2.5.2.3 Excision repair system 切除修 復系統(tǒng) 堿基切除修復系統(tǒng) 核苷酸切除修復系統(tǒng) 堿基切除修復系統(tǒng) 識別受損核酸位點的糖苷水解酶，能特異性切 除受損核苷酸上的N-糖苷鍵，在DNA鏈上 形成AP位點； AP核酸內切酶切開受損核苷酸的糖苷-磷酸鍵， 移去包括AP位點核苷酸在內的小片段DNA； 一類DNA糖苷水解酶只對應于某一特定類型 的損傷。 核苷酸切除修復系統(tǒng) 當DNA鏈上相應位置的核 苷酸發(fā)生損傷，導致雙鏈之間無法形成氫鍵，則由此系統(tǒng) 負責修復。 Unlike base excision repair, the nucl

19、eotide excision repair enzymes do not recognize any particular lesion. Rather, this system works by recognizing distortions（扭曲，變形） to the shape of the double helix, such as those caused by a thymine dimer or by the presence of a bulky chemical adduct on a base. Nucleotide Excision Repair Enzymes Cle

20、ave Damaged DNA on Either Side of the Lesion Four protein UvrA,UvrB,UvrC and UvrD are required in this process. UvrA is responsible for detecting the distortion of the double helix. 2.5.2.4 Recombination Repairs system 重組修復系統(tǒng)重組修復系統(tǒng) 切除修復用未受損的DNA鏈作為模板，合成相應的 DNA以代替另一條鏈上已受損的DNA 片段。未受損 的DNA鏈為受損鏈的恢復提供了正確的

21、遺傳信息。 如果DNA雙螺旋的兩條鏈都受損， DNA如何恢復正 常? 由雙鏈斷裂修復途徑（Double-strand break （DSB） repair pathway）進行。從姐妹染色體中 取回正確的遺傳信息,又稱同源重組修復。 2.5.2.5 SOS2.5.2.5 SOS反應反應 SOS修復是指DNA受到嚴重損傷、細胞處于危急狀態(tài)時所誘導的一種DNA修復方式，修復結果只是能維持 基因組的完整性，提高細胞的生成率，但留下的錯誤較多，故又稱為錯誤傾向修復（error-prone repair），使細胞有較高的突變率。 SOS 反應是細胞DNA受到損傷或復制系統(tǒng) 受到抑制的緊急情況下，為求得生

22、存而出現(xiàn)的 緊急效應。 SOS 反應誘導的修復系統(tǒng)包括避 免差錯的修復系統(tǒng)（如錯配修復、直接修復、 切除修復）和易產生差錯的修復系統(tǒng)酶，包括 修復酶， 對DNA的輻射或其它損傷反應; SOS 反應是由RecA 蛋白和LexA阻遏物相互 作用引起的。 有一種異常的重組類型，是一段DNA 序列 插入到另一段DNA 序列中，而不依賴于序 列同源性。 這種使某些元件從一個位置向其他位置的移 動方式是轉座(transposition)。轉座中涉及 的機制依賴于DNA 鏈的切割和重接，因此 與重組過程聯(lián)系起來。 轉座重組會破壞染色體上基因的排列順序。 2.6 DNA的轉座 一種可以由染色體的一個位置轉移到

23、另一位置的遺傳因子，也 就是一段可以發(fā)生轉座(transposition)的DNA，又稱為轉座子 (transposon)。 轉座子可反復插入到基因組中的許多位點,可以基因組的一個位 點轉移到另一個位點,從一個復制子轉移到另一個復制子。 2.6.1 2.6.1 轉座子概念轉座子概念 2.6.2 2.6.2 轉座子的發(fā)現(xiàn)轉座子的發(fā)現(xiàn) 20世紀40年代，美國遺傳學家McClintock B在研究 玉米的遺傳因子時發(fā)現(xiàn)，某些基因活性受到一些 能在不同染色體間轉移的控制因子 （controlling element）所決定。這一發(fā)現(xiàn)與 當時傳統(tǒng)的遺傳學觀點相抵觸，因而不被學術界 所普遍接受。 6060

24、年代后期，美國青年細菌學家年代后期，美國青年細菌學家Shapiro JShapiro J在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn) 一種由插入序列所引起的多效突變，之后又在不同實驗室發(fā)現(xiàn)一種由插入序列所引起的多效突變，之后又在不同實驗室發(fā)現(xiàn) 一系列可轉移的抗藥性轉座子，才重新引起人們重視。一系列可轉移的抗藥性轉座子，才重新引起人們重視。 19831983年年McClintockMcClintock被授予諾貝爾生理學與醫(yī)學獎，距離她公布被授予諾貝爾生理學與醫(yī)學獎，距離她公布 玉米控制因子的時間已有玉米控制因子的時間已有3232年之久。年之久。 所有生物的基因組中均有轉座子。所有生物的基因組中均有轉座子。

25、基因組序列的比較分析發(fā)現(xiàn)：基因組序列的比較分析發(fā)現(xiàn)： First, transposon-related sequences can make up huge fractions of the genome of an organism. For example, more than 50% of both the human and maize玉米 genomes are composed of transposonrelated DNA sequence. Second, the transposon content in different genomes is highly varia

26、ble 2.6.3 2.6.3 轉座子的特點轉座子的特點 1)1) 轉座子是不必借助同源序列就可以移動的片斷轉座子是不必借助同源序列就可以移動的片斷, ,即轉座作用與即轉座作用與 供體和受體的序列無關供體和受體的序列無關; ; 2)2) 原核生物和真核生物都有轉座子原核生物和真核生物都有轉座子; ; 3)3) 轉座序列可沿染色體移動轉座序列可沿染色體移動, ,甚至在不同染色體間跳躍甚至在不同染色體間跳躍( (跳躍基跳躍基 因因) ) 轉座的位置通?；蚨嗷蛏偈请S機的。轉座的位置通?；蚨嗷蛏偈请S機的。 當轉座子插入一個基因內時，該基因失活，如果是當轉座子插入一個基因內時，該基因失活，如果是 重要的

27、基因就可能導致細胞死亡。因此轉座必須重要的基因就可能導致細胞死亡。因此轉座必須 受到控制，并且頻率都很低。受到控制，并且頻率都很低。 轉座子對基因組而言是一個不穩(wěn)定因素，它可導致轉座子對基因組而言是一個不穩(wěn)定因素，它可導致 宿主序列刪除、倒位或易位，并且其在基因組宿主序列刪除、倒位或易位，并且其在基因組 中成為中成為“可移動的同源區(qū)可移動的同源區(qū)”。位于不同位點的兩。位于不同位點的兩 個拷貝轉座子之間可以發(fā)生交互重組，從而造成個拷貝轉座子之間可以發(fā)生交互重組，從而造成 基因組不同形式的重排。有些轉座子與基因組的基因組不同形式的重排。有些轉座子與基因組的 關系猶如寄生，它們的功能只是為了自身的擴

28、增關系猶如寄生，它們的功能只是為了自身的擴增 與繁衍，因此被稱為是自私的與繁衍，因此被稱為是自私的DNADNA。 2.6.4 2.6.4 轉座子的分類和結構特征轉座子的分類和結構特征 1.插入序列（插入序列（insertional sequence, IS） 123456789轉座酶、調控蛋白987654321 是簡單的轉座子，除轉座所需基因外不攜帶任何標記 基因，它的存在只能借助插入位點有關基因的失活來 判斷，或者通過分子雜交和測序來檢測。 插入序列是最小的轉座因子。所有插入序列的兩端都 有反向重復(inverted repeats)。反向重復為轉座酶識別 所需，通常重復序列長度為15-25

29、bp。 重復序列有時只是相似，并非相同。 （1）含短的末端反向重復序列; （2）含編碼轉座酶的基因; （3）靶位點存在 5-9 bp 的短 正向重復序列。 轉座子除編碼轉座功能有關的基因外，還攜帶抗性 或其他標記基因。 轉座子按其結構又分為兩類：一類是 ,由個別模件組合而成， 通常包括兩個插入序列作為兩臂，中間為標記基因。 另一類為,含有轉 座酶基因、解離酶(resolvase)基因以及標記基因， 兩端為反向重復，無插入序列。 2. 復合型轉座子（復合型轉座子（composite transposon） 2.6.5 真核生物的轉座子真核生物的轉座子 原核與真核生物轉座因子的異同點： 相同點：轉

30、座依賴于轉座酶，轉座因子的兩端有被轉座酶識別的 反向重復序列，轉座的靶位點是隨機的，靶位點交錯切開，插 入轉座因子后經修復形成兩側正向重復序列。 不同點：原核生物的轉錄和翻譯幾乎是同時進行的， 真核生物由于核結構的存在而使此兩過程在空間上 和時間上都被分隔開了。因此，真核生物細胞內只 要存在轉座酶，任何序列片段具有該酶識別的反向 重復末端均可發(fā)生轉移，而無需由被轉移序列自身 編碼這些酶。 真核生物的轉座因子家族中只保留少數(shù)拷貝具有編 碼轉座酶基因的活性，而多數(shù)拷貝中發(fā)生程度不同 的刪除，失去轉座酶基因活性，但保留了兩端的反 向重復序列。原核生物的轉座酶主要作用于產生它 的轉座子，表現(xiàn)出順式顯性

31、（cis dominance）,真 核生物則無此特性，這也是二者最明顯的差別。 2.6.6 2.6.6 轉座作用的機制轉座作用的機制 復制型：復制粘貼 非復制型：剪切粘貼 2.6.72.6.7 轉座的遺傳效應和意義轉座的遺傳效應和意義 轉座的遺傳效應 轉座引起插入突變轉座引起插入突變 轉座插入基因后，使基因突變失活；轉座插入基因后，使基因突變失活； 當轉座因子自發(fā)插入細菌的操縱子時，可阻止它所在基因的轉錄和翻譯。當轉座因子自發(fā)插入細菌的操縱子時，可阻止它所在基因的轉錄和翻譯。 轉座產生新的基因轉座產生新的基因 轉座子帶有抗性基因，如抗藥性基因轉座子帶有抗性基因，如抗藥性基因ampc,ampc,

32、可產生兩方面的效應：插入突變，可產生兩方面的效應：插入突變， 出現(xiàn)抗藥基因。出現(xiàn)抗藥基因。 轉座引起染色體畸變轉座引起染色體畸變 在一個染色體或者不同的染色體上如果有同一個轉在一個染色體或者不同的染色體上如果有同一個轉 座子的座子的2 2個拷貝，通過某種方式的重組后造成染色體個拷貝，通過某種方式的重組后造成染色體 斷裂、缺失、倒位及易位等，使基因突變和重排的斷裂、缺失、倒位及易位等，使基因突變和重排的 重要原因。重要原因。 轉座引起生物進化轉座引起生物進化 使原來相距甚遠的基因組合在一起，構建使原來相距甚遠的基因組合在一起，構建 成一個操縱子或表達單元，可能產生新的生成一個操縱子或表達單元，可能產生新的生 物