Thermo-Scientific-RevertAid-First-Strand-cDNA-Synthesis-Kit-K1621說(shuō)明書(shū)(第一鏈cDNA合成試劑盒)

1、Thermo SCIENTIFIC Page 11 RevertAid?第一鏈 cDNA Synthesis 試劑盒 #K1621, #K1622 分析證明書(shū) #K1621 Lot 質(zhì)量控制 采用100 fg對(duì)照GAPDH RNA和對(duì)照引物進(jìn)行 RT-PCR反應(yīng)，通過(guò)在1%瓊脂糖上進(jìn)行凝膠電泳和 溴 化乙錠染色顯示得到足夠量的 496 bp的產(chǎn)物 質(zhì)量認(rèn)證人：Jurgita Zili nskie ne 目錄 頁(yè)碼 .2 .2 .2 .3 6 .6 7實(shí) .8問(wèn) .10 試劑盒組成 存儲(chǔ)條件 產(chǎn)品說(shuō)明 注意事項(xiàng) 操作步驟 RT-PCR 合成cDNA用于克隆 驗(yàn)對(duì)照 題分析與解決 試劑盒成分 Re

2、vertAid ?第一鏈cDNA合成試劑盒 20次 #K1621 100次 #K1622 RevertAid? M-MuLV 反轉(zhuǎn)錄酶(200 u*/ Q1 25 pl 120 pl RiboLock? RNA 酶抑制劑(20 u*/ pl) 25 pl 120 pl 5 X反應(yīng)緩沖液 (250 mM Tris-HCl (pH 8.3), 250 mM KCl, 20 mM MgCl 2, 50 mM DTT ) 150 pl 500 pl 10mM dNTP混合物 50 pl 250 pl Oligo(dT)18 弓 1物 100 pM, 0.5 回 p(15 A260 u/ml) 25 p

3、l 120 pl 隨機(jī)六聚體引物100 pM, 0.2 4/ p(6 A260 u/ml) 25 pl 120 pl GAPDH正向引物,10 pM 5 -CAAGGTCATCCATGACAACTTTG -3 20 pl 20 pl GAPDH反向引物，10 pM 5 -GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG - 3 20 pl 20 pl 對(duì)照 GAPDH RNA 1.3 kb 3-poly(A) tailed RNA transcript, 0.05 p pl 20 pl 20 pl 無(wú)核酸酶高純度水 2x1.25 ml 2x1.25 ml * 一個(gè)單位的 RevertAid?M -

4、MLV逆轉(zhuǎn)錄酶在37 C 10分鐘將1 nmol的dTMP轉(zhuǎn)化為多核苷酸組分(吸附在 DE81上)。 * 一個(gè)單位的 RiboLock?RNas e酶抑制劑抑制 5ng RNA酶A 50%的活性。 存儲(chǔ)條件 試劑盒中所有組分應(yīng)存儲(chǔ)在-20 C。對(duì)照用RNA可存儲(chǔ)于-70 C以便長(zhǎng)期使用。 產(chǎn)品說(shuō)明 RevertAid?第一鏈cDNA合成試劑盒以 mRNA或者總RNA為模板，高效合成第一鏈cDNA。本 試劑 盒使用RevertAid? M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶，它的RNA酶H的活性與AMV反轉(zhuǎn)錄酶相比較低。該反 轉(zhuǎn)錄酶可 耐受42-50C溫度，合成的cDNA片段長(zhǎng)度達(dá)13kb。 試劑盒中含有Ribo

5、Lock? 重組RNA酶抑制劑，防止 RNA降解，可耐受55C高溫。 試劑盒同 時(shí)含有oligo(dT)18和隨機(jī)六聚體引物。隨機(jī)六聚體引物與模板非特異性地結(jié)合，以總RNA 中任何RNA為模板合成cDNA。oligo(dT)18選擇性和RNA 3 ply(A)配對(duì)結(jié)合，只以有 poly(A)尾巴的 mRNA為模板合成cDNA。使用本試劑盒也可采用序列特異性引物。合成的第一鏈cDNA能直接用作 cDNA的實(shí)驗(yàn)，比如將標(biāo)記好的第一鏈 cDNA PCR或熒光定量PCR的模板，第二鏈cDNA的合成或線性RNA擴(kuò)增， 也可用于需要用帶有放射性或非放射性核苷酸標(biāo)記第一鏈 作為雜交實(shí)驗(yàn)中的探針或者用于微陣列

6、分析。 注意事項(xiàng) 避免核酸酶污染 很容易被 RNA酶A降解，而RNA酶 RNA酶的嚴(yán)格驗(yàn)證并保證不含有 RNA酶污染。 RNA的純度和完整性對(duì)于合成全長(zhǎng)cDNA至關(guān)重要。RNA A廣泛穩(wěn)定地存在于實(shí)驗(yàn)室中。試劑盒中的所有成分都經(jīng)過(guò)了無(wú) RNA酶。為防止污染，實(shí)驗(yàn)室和所有實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作都必須保證沒(méi)有 避免RNA酶污染的常規(guī)建議： 用DEPC處理實(shí)驗(yàn)用到的所有管子和槍頭，或者購(gòu)買已經(jīng)證明無(wú)核酸酶的實(shí)驗(yàn)用具。 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程戴手套，因?yàn)槠つw是RNA酶的一個(gè)常見(jiàn)來(lái)源。并經(jīng)常更換手套。 使用無(wú)RNA酶的試劑，即使是超純水也要確保無(wú)RNA酶（比如#R0581，無(wú)RNA酶的高純度水） 使用RNA酶抑制劑，比如試

7、劑盒中提供的 FermentasRibo Lock?RN A酶抑制劑來(lái)保護(hù) RNA。 試劑盒如不使用，要嚴(yán)格密封保存。在反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，所有管子要確?？蹏?yán)。 模板RNA 通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法得到的細(xì)胞總 RNA可用本試劑盒獲得第一鏈 cDNA。純化過(guò)的RNA要保證不含有鹽, 金屬離子，乙醇和苯酚，因?yàn)橐陨铣煞謺?huì)干擾第一鏈 cDNA的合成反應(yīng)?？刹捎靡掖汲恋?RNA的方法 去除掉痕量污染物（然后再用75%冷乙醇沖洗沉淀兩次）。如果要進(jìn)行RT-PCR，模板RNA要確保沒(méi)有 DNA污染。在進(jìn)行cDNA合成前，模板 RNA必須用無(wú)RNA酶的DNA酶I （#EN0521 ）處理去除掉痕 量DNA。實(shí)驗(yàn)過(guò)程要設(shè)置無(wú)

8、 RT對(duì)照反應(yīng)，即此對(duì)照反應(yīng)中含有除逆轉(zhuǎn)錄酶以外的其他所有RT-PCR 成分（RT-對(duì)照）。 去除RNA中基因組DNA的實(shí)驗(yàn)步驟： RNA mg 10X反應(yīng)緩沖液（含有 MgCl2） 1 口1 DNA 酶 1，無(wú) RNA 酶(#EN0521 ) * 1 口1( 1u) 無(wú)核酸酶的高純度水 加到10 口1 1.將以下成分加入到一個(gè)無(wú) RNA酶的管子中: *對(duì)于每1卩g RfA，不要使用超過(guò)1u的DNA酶I （不含RNA酶的）。 2. 37 C孵育30分鐘。 3. 加入 1 口 50 mM EDTA , 65C 孵育 10分鐘。 會(huì)水解?；蛘呖刹捎梅?氯仿試劑抽提的方法來(lái)替代加 4. 使用制備好的

9、RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。 在含有二價(jià)陽(yáng)離子（1）而缺乏螯合劑的環(huán)境中，RNA EDTA孵育這一步驟。 RNA的完整性。最經(jīng)常使用的方法是跑變性的瓊 RNA樣品品質(zhì) 在進(jìn)行cDNA合成前，要先評(píng)估 脂糖凝膠，然后用 溴化乙錠（簡(jiǎn)稱EB,以下同）染色。如果來(lái)源于真核細(xì)胞的總 RNA在跑完膠后可清晰看到18s和28s rRNA的條帶，可認(rèn)為 RNA是完整的。28s rRNA的條帶亮度約為 18s rRNA的兩倍。任何拖尾條帶都是 mRNA 降解的信號(hào)。如果這種拖尾條帶出現(xiàn)，需要重新提取總RNA樣品。 為了進(jìn)行 RT-PCR，需要評(píng)價(jià)純化的 RNA (人類，小鼠或大鼠)的適用性。常用方法是在RT-

10、 PCR 中設(shè)置對(duì)照，此對(duì)照含有試劑盒中提供的模板 RNA和對(duì)照用GAPDH引物。GAPDH特異性引物 與人， 小鼠，大鼠的GAPDH基因完全互補(bǔ)，RT-PCR擴(kuò)增后得到496bp的產(chǎn)物。 RNA樣品用量 0.1 ng - 5的總RNA或者1 ng - 500 ng的poly(A) mRNA 作為模板合成第一鏈 cDNA，此反應(yīng) 可作為兩步法RT-PCR中的起始步驟。 引物 合成第一鏈cDNA使用的引物可為oligo(dT)18引物，隨機(jī)六聚體引物或者基因特異性引物中 的任意 Oligo(dT)18引物針對(duì)具有3呦(A)尾巴的真核 mRNA。隨機(jī)六聚體引物適用于總RNA (rRNA 使用1 Q

11、分離純化的mRNA作為模板合成的第一鏈 cDNA，可用于第二鏈合成或者后續(xù)克隆反應(yīng)。 一種。 或 混合物，這 比如沒(méi)有 RNA或者 者mRNA)。因此，相對(duì) Oligo(dT)18，使用隨機(jī)六聚體引物會(huì)得到更復(fù)雜的第一鏈cDNA 樣會(huì)降低后續(xù) PCR實(shí)驗(yàn)的特異性和精確性。但是隨機(jī)引物在以下幾種情況中是有優(yōu)勢(shì)的： poly(A)尾巴的mRNA或者使用富含poly(A)結(jié)構(gòu)的RNA為模板?；蛱禺愋砸镉糜趶目?mRNA混合 物中合成特異性的某條或者幾條cDNA，這種特異引物需要使用者自己提供。 第一鏈cDNA合成過(guò)程第一鏈cDNA合成可進(jìn)行單樣本反應(yīng)，可以使用不同的模板平行進(jìn)行多樣 本反應(yīng)。因此

12、，準(zhǔn)備反應(yīng) 混合物可每種反應(yīng)組分單獨(dú)加入，也可使用master mix ( master mix含有除去模板 RNA的以外的其他反 應(yīng)組分)。取決于RNA模板結(jié)構(gòu)的情況，將變性和退火分開(kāi)操作可能會(huì)提高RT-PCR的特異性和精確度。 下面圖表描述的是第一鏈 cDNA合成的主要步驟。詳細(xì)步驟請(qǐng)見(jiàn)第六頁(yè)。圖表中描述了包括 RNA 變性步驟的單樣本反應(yīng)和使用不同模板的多樣本反應(yīng)流程。與單樣本反應(yīng)相比，多樣本反應(yīng)采用相同 的 反應(yīng)體系(20ul)和相同的試劑用量，但試劑的加入順序有所不同(見(jiàn)下圖)。 圖表1.合成cDNA的單樣本反應(yīng)和多樣本反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程概述 單樣本反應(yīng) 有RNA變 無(wú)RNA變性 性 （

13、簡(jiǎn)化的操作步驟） 多樣本反應(yīng) 有RNA變性 無(wú)RNA變性 （簡(jiǎn)化的操作步驟） 混合RNA和引物， f 混合RNA和引物， 準(zhǔn)備無(wú)RNA的反 f應(yīng)混合液 65 C變性處理5 嚴(yán)分鐘，置于冰純 上 65 C變性處理5 分鐘，置于冰0 上， 加入緩沖液，i 加入RNA,引物， RNA酶抑制劑， buffer, RNA 酶抑 dNTP, i 制劑，dNTP, RevertAid TM 酶 | 1 RevertAid TM 酶 J 1（共 20 口）J V（共 20 口）J 將上述反 r 應(yīng)液加 到管子中 廣準(zhǔn)備無(wú)RNA和 引物的反應(yīng)混 L合液 將上述反應(yīng)液、 RNA和引物加到 管子中（共20 口）1

14、加入模板RNA （共 20 口） 在42 C下孵育60分鐘 （對(duì)于oligo（dT）i8引物 或基因特異性引物） V 在25C下孵育5分鐘 在42 C下孵育60分鐘 （對(duì)于隨機(jī)引物） 在70 C下孵育5分鐘終止反 i”應(yīng) 操作步驟 開(kāi)始前請(qǐng)先閱讀第3-5頁(yè)的注意事項(xiàng)。 RT-PCR I. 第一鏈cDNA合成 融化后，將試劑盒中各組分混勻并稍微離心, 離心后置于冰上。 1.在置于冰上的無(wú)菌無(wú)核酸酶的 PCR管中，按照順序加入下面的反應(yīng)物。 模板RNA 總RNA 或者 poly(A) mRNA 或者特異性RNA 0.1 ng - 5 pg 10 pg - 0.5 4 0.01 pg - 0.5 p

15、g 引物 oligo (dT)18 引物 隨機(jī)六聚體引物 基因特異性引物 1 pl 1 pl 15-20 p mol 無(wú)核酸酶的高純水 到 12 pl 總體積 12 pl 2. 可選優(yōu)化步驟。如果RNA模板GC含量高或者含有二級(jí)結(jié)構(gòu)，將模板和引物的混合液輕輕混勻, 短暫離心，65C孵育5分鐘，冰上冷卻，離心，再置于冰上冷卻。 3. 將下列組分按照順序加入 5X Reaction Buffer 4 pl RiboLock? RNA 酶抑制劑(20 u/ p l) 1 pl 10 mM dNTP Mix 2 pl RevertAid? M-MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(200 u/ p l) 1 pl 總體

16、積 20 pl 4.輕輕混勻，離心。 45C。 5. 如果使用oligo(dT)18或者基因特異型引物，42C孵育60分鐘。女口 果使用隨機(jī)六聚體引物，25C.先孵育5分鐘，隨后42C孵育60分鐘。 注意：高GC含量的模板反應(yīng)溫度可升高至 6. 70 C加熱5 min終止反應(yīng)。 反應(yīng)產(chǎn)物可直接用于 PCR反應(yīng)或者在-20 C保存少于一周的時(shí)間。如想延長(zhǎng)保存時(shí)間，建議使用 -70 保存。 II.第一鏈cDNA的PCR擴(kuò)增 合成的第一鏈cDNA可直接用于 PCR或qPCR。第一鏈cDNA反 應(yīng)液體積不能超過(guò) PCR反應(yīng)體系的 1/10。通常50 口啲PCR反應(yīng)體系中，第一鏈 cDNA反應(yīng)液加入2口

17、。1 Taq DNA聚合酶，PCR Master Mix (2X)或者 PyroStart? Fast PCR Master Mix (2X)可用于擴(kuò)增小于 3kb 的片段。DreamTaq? DNA 聚合 酶擴(kuò)增至6kb長(zhǎng)的片段。對(duì)于 20 kb的長(zhǎng)片段，建議使用 Long PCR Enzyme Mix和High Fidelity PCR Enzyme Mix。 合成cDNA用于克隆 I.第一鏈cDNA合成 融化后，將試劑盒中各組分混勻并短暫離心, 離心后置于冰上。 1.在置于冰上的無(wú)菌無(wú)核酸酶的 PCR管中，按照順序加入下面的反應(yīng)物。 模板RNA P oly(A) mRNA 或特異性RNA

18、 1 口g 0.5-1 jig 引物 oligo (dT)18 引物 或隨機(jī)六聚體引物 或基因特異性引物 1 jil 1 jil 100 pmol 無(wú)核酸酶的高純水 至12 l 總體積 12 il 2.可選優(yōu)化步驟。如果RNA模板GC含量高或者含有二級(jí)結(jié)構(gòu)，輕輕混勻，短暫離心，65孵育5 分鐘，冰上冷卻，離心，再置于冰上冷卻。 3.將下列成分按照順序加入 5X Reaction Buffer 4 il RiboLock? RNA 酶抑制劑(20 u/ i l) 1 jil 10 mM dNTP Mix 2 jil RevertAid? M-MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(200 u/ i l) 1 jil

19、 總體積 20 i 4.輕輕混合，離心。 5. 如果使用oligo(dT)18或者基因特異型引物，42C孵育60分鐘。女口 果使用隨機(jī)六聚體引物，25C.先孵育5分鐘，隨后42C孵育60分鐘。 注意：高GC含量的模板反應(yīng)溫度可升高至45C。 6. 70 C加熱5 min終止反應(yīng)。 反應(yīng)產(chǎn)物可直接用于 PCR反應(yīng)或者在-20 C保存少于一周。如想延長(zhǎng)保存時(shí)間，建議使用-70 C保 存。 II.第二鏈cDNA合成 1.在冰上將下表的組分加入到 20 口第一鏈cDNA反應(yīng)混合液中: 10X Reaction Buffer (適用于 DNA 聚合酶 1) 8 口1 RNA 酶 H, E.coli (#

20、EN0201) 1u DNA 聚合酶 I, E.coli (#EP0041) 30u 無(wú)核酸酶的高純水 至 100 口1 總體積 100 口1 2. 輕輕混勻，短暫離心。 3. 15 C孵育2小時(shí)。溫度不要咼于15C。 4. 力口入 12.5 u T4 DNA 聚合酶(#EP0061), 15C孵育 5 min。 5. 加入 5 口 of 0.5 M EDTA, pH 8.0 (#R1021)終止反應(yīng)。 片段 6. 通過(guò)酚/氯仿抽提純化平端的cDNA，以用于的克隆相關(guān)實(shí)驗(yàn)，比如：接頭連接，磷酸化, 大小分離，連接和轉(zhuǎn)化。 實(shí)驗(yàn)對(duì)照 應(yīng)該采用陰性和陽(yáng)性對(duì)照來(lái)驗(yàn)證第一鏈cDNA合成的結(jié)果。 DNA

21、對(duì) 無(wú)逆轉(zhuǎn)錄酶的陰性對(duì)照(RT-)在PCR或者qPCR反應(yīng)中很重要，它可用于評(píng)估基因組 RNA 樣品的污染狀況。RT-對(duì)照組不含有逆轉(zhuǎn)錄酶，但含有實(shí)驗(yàn)所需的其他組分。 RNA模板, 無(wú)模板的陰性對(duì)照(NTC)對(duì)于檢測(cè)反應(yīng)試劑的污染情況很重要。NTC對(duì)照組不含有 但含有實(shí)驗(yàn)所需的其他組分。 陽(yáng)性對(duì)照試劑盒中已經(jīng)提供陽(yáng)性對(duì)照所需的RNA模板和基因特異性引物。人 GAPDH對(duì)照 RNA(1.3kb)是通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄方式得到的。GAPDH特異性引物與人，小鼠，大鼠的GAPDH基因完全 互 補(bǔ)，RT-PCR后的產(chǎn)物長(zhǎng)度大約 496bp。下面是陽(yáng)性對(duì)照的操作步驟。 I.陽(yáng)性對(duì)照第一鏈cDNA的合成反應(yīng)融化后

22、，將試劑盒中各組 分混勻并短暫離心，離心后置于冰上。 1.在置于冰上的無(wú)菌無(wú)核酸酶的 PCR管中，按照順序加入下面的反應(yīng)物。 對(duì)照 GAPDH RNA (50 ng/ 口 l) 2 (11 Oligo (dT) 18 引物 或隨機(jī)六聚體引物 或基因特異性引物 1 11 5X Reaction Buffer 4 11 RiboLock? RNA 酶抑制劑(20 u/ 口 l) 1 11 10 mM dNTP Mix 2 11 RevertAid? M-MuLV Reverse Transcriptase (200 u/ 卩 l) 1 11 無(wú)核酸酶的高純水 9 11 總體積 20 11 2. 輕

23、輕混勻離心。 3. 如果使用oligo(dT)18或者基因特異型引物， 果使用隨機(jī)六聚體引物，25C.先孵育5分鐘, 4. 70 C加熱5 min終止反應(yīng)。 5. 短暫離心，按照第九頁(yè)的操作步驟進(jìn)行對(duì)照 42 C孵育60分鐘。 如 隨后42C孵育60分鐘。 PCR擴(kuò)增。 對(duì)照PCR擴(kuò)增 將第一鏈cDNA合成反應(yīng)液(第8頁(yè))按照 其他組分融化后，輕微震蕩混勻并離心。 薄壁PCR管置于冰上，加入下列試劑： II. 1:1000的比例用無(wú)核酸酶的水高純水稀釋。 1. 2. 從對(duì)照RT反應(yīng)得到的cDNA (1:1000 dilution) 2 jil 10X PCR buffer 5 il 10 mM

24、 dNTP Mix 1 1(0.2 mM each) 25 mM MgCl 2 3 il 正向 GAPDH Primer 1.5 il 反向 GAPDH Primer 1.5 il Taq DNA polymerase (5 u/ 口 l) 0.5 il 無(wú)核酸酶的高純水 35.5 il 總體積 50 il 3. 4.進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR儀要有加熱的蓋子，或者在 PCR管中加入25 口的礦物油。 步驟 溫度,C 時(shí)間 循環(huán)數(shù) 初始變性 94 3分鐘 1 變性 94 30秒 退火 58 30秒 35 延伸 72 45秒 5.將5-10 口 IT-PCR產(chǎn)物上1%瓊脂糖電泳。EB染色后應(yīng)該清晰可見(jiàn) 496 bp PCR產(chǎn)物。 存在問(wèn)題 原因和解決辦法 問(wèn)題分析與解決 產(chǎn)物產(chǎn)量低或者 沒(méi)有RT-PCR 產(chǎn)物 RNA模板降解 RNA純化過(guò)程中使用的一些痕量成分可能會(huì)殘存在溶液中并抑制第 比如SDS , EDTA，胍鹽，磷酸鹽，焦磷酸鹽，聚胺，亞精胺。可采 方法去除掉痕量污染物（乙醇重新沉淀RNA，再用75%冷乙醇沖洗 RNA模板量不夠 模板