海洋生物技術(shù)

1、第一章 緒論1.1 課程介紹海洋生物技術(shù)是世紀(jì)年代發(fā)展起來(lái)的高技術(shù)群，是現(xiàn)代生物技術(shù)與海洋生物學(xué)相交叉的產(chǎn)物。海洋資源豐富，通過(guò)海洋生物技術(shù)手段可以從海洋中開發(fā)利用海洋資源。我國(guó)是海洋大國(guó)，海洋生物技術(shù)專利在我國(guó)海洋科技和海洋經(jīng)濟(jì)發(fā)展中占有重要地位。是生物技術(shù)專業(yè)的必修課。教學(xué)重點(diǎn)：海洋生物技術(shù)主要包括海洋微生物生物技術(shù)、海洋動(dòng)物生物技術(shù)、海洋大型藻類生物技術(shù)、海洋生物資源遺傳多樣性檢測(cè)技術(shù)、海洋生物資源種質(zhì)保存技術(shù)、海洋環(huán)境檢測(cè)與保護(hù)生物技術(shù)、病害的檢測(cè)與防治等生物技術(shù)。不同的生物技術(shù)側(cè)重點(diǎn)各有不同，重點(diǎn)要清楚原理和技術(shù)方法及相關(guān)應(yīng)用。教學(xué)難點(diǎn)：生物技術(shù)是一個(gè)綜合學(xué)科，海洋生物技術(shù)是海洋生物

2、學(xué)和生物技術(shù)的交叉學(xué)科。涉及的知識(shí)點(diǎn)較多，需要的背景知識(shí)較多，并且生物技術(shù)發(fā)展較快，因此教學(xué)難點(diǎn)是一些較新技術(shù)方法及原理的講解，技術(shù)及原理較繁瑣，難以理解。 1.2 課程安排2 課程基礎(chǔ)2.1 海洋生物2.2 生物技術(shù)2.3 海洋生物技術(shù)2.4 海洋生物技術(shù)的發(fā)展2.5 海洋生物技術(shù)主要研究?jī)?nèi)容2.1 海洋生物2.1.1 海洋動(dòng)物海洋動(dòng)物現(xiàn)知有1620萬(wàn)種，它們形態(tài)多樣，包括微觀的單細(xì)胞原生動(dòng)物，和長(zhǎng)達(dá)30余米、重 190噸的高等哺乳動(dòng)物藍(lán)鯨等；分布廣泛，從赤道到兩極海域，從海面到海底深處，從海岸到超深淵的海溝底，都有其代表；按生活方式劃分，海洋動(dòng)物主要有海洋浮游動(dòng)物zooplankton 、

3、海洋游泳動(dòng)物Nekton和海洋底棲動(dòng)物Benthos三個(gè)生態(tài)類型；按分類系統(tǒng)劃分，動(dòng)物界共有33個(gè)門，海洋中特有15個(gè)門。海洋生態(tài)系和非海洋生態(tài)系中的動(dòng)物界門類比較 浮游動(dòng)物（zooplankton）浮游生物：是指在水流運(yùn)動(dòng)的作用下，被動(dòng)地漂浮在水層中的生物群。原生動(dòng)物（protists）浮游甲殼動(dòng)物（crustacean plankton） 橈足類、磷蝦類、端足類、櫻蝦類、枝角類、介形類、糠蝦類、漣蟲類、等足類等水母類和櫛水母類毛顎類 ：又稱箭蟲被囊動(dòng)物有尾類也稱幼形類 原生動(dòng)物（protists）：游泳動(dòng)物 Nekton包括海洋魚類、哺乳類(鯨、海豚、海豹、海牛)、爬行類(海蛇、海龜)、海

4、鳥以及某些軟體動(dòng)物(烏賊)和一些蝦類等。 底棲動(dòng)物 Benthos底棲生物是由生活在海洋基地表面或沉積物中的各種動(dòng)物所組成。固著生物：海綿動(dòng)物、苔蘚動(dòng)物 附著生物：貽貝、扇貝、珠母貝 匍匐動(dòng)物：大部分腹足類軟體動(dòng)物、海星類、海膽類 污損生物（fouling organisms）過(guò)去也稱周叢生物、固著生物或附著生物。藤壺、牡蠣、貽貝等 。2.1.2 海洋植物海洋植物比陸地植物少，主要包括海藻和海洋種子植物；海洋種子植物種類不多，有130種左右，都屬于被子植物，可分為紅樹植物和海草兩類。海草屬于沼生目，現(xiàn)知12屬49種，隸屬于眼子菜科和水鱉科 ；全世界已知的紅樹植物共有18科23屬80種，分別隸屬

5、于雙子葉植物綱和單子葉植物綱。 海藻包括微藻和大型藻；藍(lán)藻門、甲藻門、金藻門、硅藻門、裸藻門、黃藻門、綠藻門、紅藻門、褐藻門。2.1.3 海洋微生物海洋病毒海洋細(xì)菌海洋真菌海洋古菌海洋真核微藻海洋微生物的種類2.2 生物技術(shù)2.2.1 概念2.2.2 分類2.2.3 研究領(lǐng)域2.2.4 重要性2.2.1 概念“生物技術(shù)”一詞首先由匈牙利的 Karl Ereky 與1917年提出。生物技術(shù)（Biotechnology）：操縱生物（微生物、植物、動(dòng)物）的細(xì)胞、組織或酶，進(jìn)行生物合成、生物轉(zhuǎn)化或生物降解，大規(guī)模地生產(chǎn)預(yù)期產(chǎn)品或達(dá)到特殊目的的一門技術(shù)”。2.2.2 分類依歷史發(fā)展或所用方法的不同，可分

6、成以下兩大類：傳統(tǒng)生物技術(shù)：應(yīng)用釀造發(fā)酵、培育新種等傳統(tǒng)的方法生產(chǎn)有用物質(zhì)。 現(xiàn)代生物技術(shù)：以生物化學(xué)或分子生物方法改變細(xì)胞或分子的遺傳性質(zhì)。這是在根本上控制了生物的代謝或生理，以達(dá)到生產(chǎn)有用物質(zhì)之目的。 2.2.3 研究領(lǐng)域 基 因 工 程 細(xì) 胞 工 程 酶 工 程 發(fā) 酵 工 程 蛋白質(zhì)工程 基 因 工 程基因工程是指在微觀領(lǐng)域（分子水平）中，根據(jù)分子生物學(xué)和遺傳學(xué)原理，設(shè)計(jì)并實(shí)施一項(xiàng)把一個(gè)生物體中有用的目的DNA(遺傳信息)轉(zhuǎn)入另一個(gè)生物體中，使后者獲得新的需要的遺傳性狀或表達(dá)所需要的產(chǎn)物，最終實(shí)現(xiàn)該技術(shù)的商業(yè)價(jià)值。細(xì)胞工程概念：應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)方法，借助工程學(xué)的試驗(yàn)方法或技

7、術(shù)，在細(xì)胞水平上研究改造生物遺傳特性和生物學(xué)特性，以獲得特定的細(xì)胞、細(xì)胞產(chǎn)品或新生物體的有關(guān)理論和技術(shù)方法的學(xué)科。研究范疇：廣義的細(xì)胞工程包括所有的生物組織、器官及細(xì)胞離體操作和培養(yǎng)技術(shù)，狹義的細(xì)胞工程則是指細(xì)胞融合和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。根據(jù)研究對(duì)象不同，細(xì)胞工程可分為動(dòng)物細(xì)胞工程、植物細(xì)胞工程和微生物細(xì)胞工程。細(xì)胞工程的理論核心細(xì)胞全能性概念1902年，德國(guó)植物學(xué)家Haberlandt提出了細(xì)胞全能性的假想。1934年，White首次定義為: 每個(gè)植物活細(xì)胞在合適的條件下，都有發(fā)育為胚的能力。70年代，擴(kuò)大了以上定義范圍，認(rèn)為：植物活細(xì)胞不但能形成胚狀體，而且能發(fā)育為完整植株。80年代初，認(rèn)為：任

8、何植物的離體細(xì)胞在人工培養(yǎng)下都具有它們母體植株的那種合成藥用成分的能力，即培養(yǎng)細(xì)胞的藥物生物合成的能力。目前細(xì)胞全能性定義： 每個(gè)植物活細(xì)胞都具有該物種的新陳代謝、應(yīng)激性和自體復(fù)制等生命基本屬性，在合適的離體培養(yǎng)條件下，可以展現(xiàn)這些特征屬性。 植物活細(xì)胞具有生命特征屬性生命特征屬性細(xì)胞具有生命特征屬性離體培養(yǎng)細(xì)胞展現(xiàn)該物種的生命特性 生命特征屬性：新陳代謝：是指維持生命各種活動(dòng)過(guò)程中的化學(xué)變化的總稱。應(yīng)激性：是指生物體隨環(huán)境變化的刺激而發(fā)生相應(yīng)反應(yīng)的特征。自我復(fù)制：自我復(fù)制：是指生物體利用自身作模板，通過(guò)代謝作用，復(fù)制出完全相同的結(jié)構(gòu)，或產(chǎn)生也具有相同的自體繁殖能力的突變結(jié)構(gòu)。細(xì)胞具有生命特征

9、屬性生物體由細(xì)胞組成，所以細(xì)胞也具有生命特征屬性。 細(xì)胞是生物體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位。核酸是構(gòu)成細(xì)胞的重要物質(zhì)，攜帶著遺傳信息，并具有自我復(fù)制的能力，但當(dāng)單獨(dú)存在時(shí)，不能表現(xiàn)出生命特征屬性。只有組成細(xì)胞時(shí)，才能表現(xiàn)完整的生命活動(dòng)。離體培養(yǎng)細(xì)胞展現(xiàn)該物種的生命特性1.培養(yǎng)細(xì)胞的新陳代謝：在適宜條件下，離體細(xì)胞能夠存活，則具有新陳代謝特性。如：綠色細(xì)胞具有光自養(yǎng)能力；培養(yǎng)細(xì)胞具有該物種的藥物生物合成的能力。2.培養(yǎng)細(xì)胞的應(yīng)激性：在適宜培養(yǎng)條件下，離體細(xì)胞具有應(yīng)激性：植物組織切割損傷后，應(yīng)激于培養(yǎng)條件而出現(xiàn)脫分化，并在適宜的條件下再分化（芽和根）。3.培養(yǎng)細(xì)胞展現(xiàn)自體復(fù)制特性細(xì)胞工程的基本技術(shù)細(xì)胞工

10、程所涉及的主要技術(shù)有：細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、細(xì)胞融合技術(shù)、細(xì)胞器移植和細(xì)胞重建技術(shù)、染色體工程技術(shù)、體外授精和胚胎移植技術(shù)等;細(xì)胞工程的基本技術(shù)1細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是指動(dòng)物和植物細(xì)胞在體外無(wú)菌條件下的保存和生長(zhǎng)。即將機(jī)體內(nèi)某一組織取出，使其分散成單個(gè)細(xì)胞，在體外人工的生長(zhǎng)條件下培養(yǎng)，使細(xì)胞生長(zhǎng)和不斷增殖。細(xì)胞工程的基本技術(shù)2細(xì)胞融合技術(shù)指兩種不同親株經(jīng)酶法去除細(xì)胞壁得到兩個(gè)原生質(zhì)體，并在助融劑作用下互相凝集并發(fā)生細(xì)胞間的融合，進(jìn)而導(dǎo)致基因重組，獲得新菌株。其融合頻率明顯高于常規(guī)雜交數(shù)倍至幾十倍。對(duì)促進(jìn)基因重組、遺傳育種、選育優(yōu)良品系，以達(dá)到高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)具有重要實(shí)踐意義。 細(xì)胞工程的基本技術(shù)3細(xì)胞器移

11、植和細(xì)胞重建技術(shù)所謂核移植技術(shù)就是利用顯微操作技術(shù)將一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核移植到另一個(gè)細(xì)胞中，或者將兩個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核（或細(xì)胞質(zhì)）進(jìn)行交換，從而可能創(chuàng)造無(wú)性雜交生物新品種的一項(xiàng)技術(shù)。動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)植物細(xì)胞與組織培養(yǎng)細(xì) 胞 融 合是指不同的細(xì)胞在離體條件下接觸，用無(wú)性的方法使其成為一體而產(chǎn)生雜種細(xì)胞的技術(shù)。植物細(xì)胞和微生物細(xì)胞常因有細(xì)胞壁不能直接用于融合，須經(jīng)酶法除去細(xì)胞壁而得原生質(zhì)體而后再進(jìn)行融合，又稱原生質(zhì)體融合。細(xì)胞融合的過(guò)程：細(xì)胞在促融因子的作用下，出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，然后，細(xì)胞之間的質(zhì)膜發(fā)生粘連，細(xì)胞開始融合，然后在培養(yǎng)過(guò)程中，進(jìn)而發(fā)生核融合，形成雜種細(xì)胞。細(xì)胞融合細(xì)胞融合的方法1）生物學(xué)法：采

12、用病毒促進(jìn)細(xì)胞融合。如仙臺(tái)病毒、皰疹病毒、天花病毒等，能誘導(dǎo)細(xì)胞融合。2）化學(xué)融合法：采用化學(xué)融合劑使細(xì)胞融合。如PEG（聚乙二醇）、DMSO（二甲亞砜）、甘油酸酯等；鈣離子參與。3）電融合法：電場(chǎng)脈沖刺激，使細(xì)胞膜透性增加，促進(jìn)融合。胚胎工程蛋白質(zhì)工程“后基因組時(shí)代”將是“蛋白質(zhì)組學(xué)時(shí)代”，即從對(duì)基因信息的研究轉(zhuǎn)向?qū)Φ鞍踪|(zhì)信息的研究，包括研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能與應(yīng)用及蛋白質(zhì)相互關(guān)系和作用。蛋白質(zhì)工程就是在對(duì)蛋白質(zhì)的化學(xué)、晶體學(xué)、動(dòng)力學(xué)等結(jié)構(gòu)與功能認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上，對(duì)蛋白質(zhì)人工改造與合成，最終獲得商業(yè)化的產(chǎn)品。蛋白質(zhì)工程的主要步驟通常包括：從生物體中分離純化目的蛋白；測(cè)定其氨基酸序列；借助核磁共振和

13、X射線晶體衍射等手段，盡可能地了解蛋白質(zhì)的二維重組和三維晶體結(jié)構(gòu);設(shè)計(jì)各種處理?xiàng)l件，了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化，包括折疊與去折疊等對(duì)其活性與功能的影響；設(shè)計(jì)編碼該蛋白的基因改造方案，如點(diǎn)突變；分離、純化新蛋白，功能檢測(cè)后投入實(shí)際使用。發(fā)酵工程現(xiàn)代發(fā)酵工程主要指利用微生物、包括利用DNA重組技術(shù)改造的微生物在全自動(dòng)發(fā)酵罐或生物反應(yīng)器中生產(chǎn)某種商品的技術(shù)?，F(xiàn)代發(fā)酵工程是生物代謝、微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)、大型發(fā)酵罐或生物反應(yīng)器研制、化工原理等密切結(jié)合和應(yīng)用的結(jié)果。酶工程應(yīng)用目的出發(fā)研究酶，在一定的生物反應(yīng)裝置中利用酶的催化性質(zhì)，將相應(yīng)原料轉(zhuǎn)化成有用的物質(zhì)。是酶學(xué)和工程學(xué)相互滲透結(jié)合形成的一門新的技術(shù)科學(xué)，是酶學(xué)

14、、微生物學(xué)的基本原理與化學(xué)工程有機(jī)結(jié)合而產(chǎn)生的邊緣科學(xué)。 生物技術(shù)是當(dāng)今六大高新技術(shù)之一。我國(guó)把它列為六大高新技術(shù)之首。生物技術(shù)是世界各國(guó)普遍關(guān)注和重視的熱點(diǎn)，如19731977年全世界約有400多家生物工程公司，到1992年單美國(guó)就創(chuàng)辦2000多家生物技術(shù)公司，每年投入近60億美元進(jìn)行研究開發(fā)利用。2.3 海洋生物技術(shù)海洋生物技術(shù)： 利用海洋生物或其組成部分開發(fā)和生產(chǎn)有用的生物產(chǎn)品以及定向改良海洋生物遺傳特性的綜合性科學(xué)技術(shù)。2.4 海洋生物技術(shù)的發(fā)展海洋生物技術(shù)興起于20世紀(jì)80年代，是海洋生物學(xué)的一門新興的研究領(lǐng)域；1988年，日本最早設(shè)立了海洋生物技術(shù)研究所，并投資10億日元，建立兩個(gè)

15、藥物實(shí)驗(yàn)室，上市產(chǎn)品“救多善”，1996年銷售額達(dá)百億元港幣。 隨著神經(jīng)生物學(xué)、海洋生態(tài)學(xué)、海洋工程學(xué)、深海探測(cè)技術(shù)、海洋化工、生物技術(shù)、分子生物學(xué)、基因工程的發(fā)展，海洋生物技術(shù)的研究領(lǐng)域日益拓寬。2.5 海洋生物技術(shù)主要研究?jī)?nèi)容海洋生物活性物質(zhì)的開發(fā)與利用 酶、抗生素、毒素、其它活性物質(zhì)海洋環(huán)境生物技術(shù) 海洋污染的治理與監(jiān)測(cè)海洋動(dòng)植物、微生物育種、養(yǎng)殖、病害檢測(cè)與防治、種質(zhì)保藏、加工, 海水養(yǎng)殖研究海洋生物分子過(guò)程 生命過(guò)程的研究小結(jié)掌握海洋生物技術(shù)的概念和主要研究?jī)?nèi)容；熟悉海洋中的生物類型；了解生物技術(shù)及其涵蓋內(nèi)容的概念及應(yīng)用。 第二章 海洋微生物生物技術(shù)主要內(nèi)容海洋微生物的特點(diǎn)海洋微生物

16、的分離與鑒定海洋未培養(yǎng)微生物資源的開發(fā)及應(yīng)用海洋微生物單細(xì)胞蛋白海洋微生物單細(xì)胞油脂海洋微生物酶海洋微生物活性物質(zhì)海洋微生物基因工程海洋微生物基因組學(xué)海洋微生物是什么?定義：分布在海洋中的個(gè)體微小、形態(tài)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的單細(xì)胞或多細(xì)胞生物。海洋微生物分類：海洋真菌、海洋細(xì)菌、海洋放線菌、海洋病毒、海洋藍(lán)細(xì)菌。海洋微生物的特定：嗜鹽性、嗜冷性、嗜壓性、低營(yíng)養(yǎng)性等。1 海洋微生物的特點(diǎn)嗜鹽性 嗜鹽菌能夠在鹽濃度為15-20%的環(huán)境中生長(zhǎng)，有的甚至能在32%的鹽水中生長(zhǎng)。是海洋微生物最普遍的特性。 嗜冷性 在 0生長(zhǎng)或其最適生長(zhǎng)溫度低于20的微生物稱為嗜冷微生物。嗜冷菌主要分布于極地、深?；蚋呔暥鹊暮Ｓ蛑?，

17、細(xì)胞膜構(gòu)造、酶活力等適應(yīng)低溫的特點(diǎn)。嗜壓性水深每增加10米,靜水壓力遞增1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓。海洋最深處的靜水壓力超過(guò)1000個(gè)大氣壓56%以上的還有環(huán)境處于100-1100大氣壓中嗜壓性-是深海微生物獨(dú)有的特性。多形性同一株細(xì)菌純培養(yǎng)中，可以同時(shí)觀察到多種形態(tài)，如：球形、橢圓形、大小長(zhǎng)短不一的桿狀或各種不規(guī)則圖形的細(xì)胞。這種多形現(xiàn)象在海洋革蘭氏陰性桿菌中尤為普遍。這種特性是微生物長(zhǎng)期適應(yīng)海洋復(fù)雜化境的產(chǎn)物寡營(yíng)養(yǎng)性深海中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較為稀少，海洋環(huán)境中溶解性有機(jī)碳(DOC)水平常年維持在50mol/l100 mol/l或0.6 mg/l1.2 mg/l。某些浮游型的海洋細(xì)菌適應(yīng)于低濃度營(yíng)養(yǎng)的海水。 發(fā)光

18、性海洋細(xì)菌中有少數(shù)幾個(gè)屬表現(xiàn)發(fā)光特性。發(fā)光細(xì)菌往往從海水或魚產(chǎn)品上分離到。細(xì)菌發(fā)光現(xiàn)象對(duì)理化因子反應(yīng)敏感，利用發(fā)光細(xì)菌作為檢驗(yàn)水域污染狀況的指示菌。多樣性迄今為止，人類發(fā)現(xiàn)的微生物大約有150多萬(wàn)種，除了72000種存在于陸地外，其余都存在于海洋之中。PANS上文章報(bào)道海洋中微生物的種類可能多達(dá)1000萬(wàn) 。平均每升海水中微生物的種類超過(guò)2萬(wàn)個(gè) 。在大海里游泳，如果不小心咽下了一口海水，那么就等于咽下了至少上千種種細(xì)菌。2 海洋微生物的分離與鑒定2.1海洋微生物樣品的分離2.2 海洋微生物的鑒定2.1海洋微生物樣品的分離2.1.1 微生物樣品的采集2.1.2 海洋微生物的分離與純化2.1.3

19、海洋微生物的純培養(yǎng)2.1.1微生物樣品的采集有的放矢，目標(biāo)明確: 根據(jù)篩選目標(biāo)，確定取樣種類和地點(diǎn);工欲善其事，必先利其器: 準(zhǔn)備好工具;物品要準(zhǔn)備充分: 其它的必須物品。2.1.2 海洋微生物的分離不同種類的海洋微生物絕大多數(shù)也是混雜在一起的，因此就必須從混雜的類群中進(jìn)行分離純化，以便得到只含有該種微生物的純培養(yǎng)株。這種獲得純培養(yǎng)株的方法稱為微生物的分離和純化。細(xì)菌、放線菌、真菌稀釋涂布平板法稀釋混合平板法平板劃線分離法藻類對(duì)于個(gè)體較大的絲狀藍(lán)藻，往往只需在解剖鏡或顯微鏡下就可用鑷子或解剖針等進(jìn)行分離。而對(duì)個(gè)體小的單細(xì)胞種類，常用的分離方法有四種：微吸管分離法微吸管（毛細(xì)管）分離 選直徑較細(xì)

20、（約5毫米）玻管，在火焰上加熱，待快熔時(shí)，快速拉成口徑極細(xì)的微吸管。將稀釋適度藻液水樣，置淺凹載玻片上，鏡檢。用微吸管挑選要分離的藻體，認(rèn)真仔細(xì)地吸出，放入另一淺凹載片上，鏡檢這一滴水中是否達(dá)到純分離的目的。如不成功，應(yīng)反復(fù)幾次，直至達(dá)到分離目的為止。然后移入經(jīng)滅菌的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，一般在每個(gè)培養(yǎng)皿中接2030個(gè)個(gè)體。從分離出少量細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)到200毫升的培養(yǎng)量，如硅藻一般需20天以上。為了較長(zhǎng)時(shí)期保存藻種，可將分離到的藻種用青霉素（10005000單位或鏈霉素（20ppm）處理后，獲得較純?cè)宸N 。水滴分離法水滴分離法 用微吸管吸取稀釋適度藻液，滴到消毒過(guò)載片上，水滴盡可能滴小些，要求在低倍鏡視

21、野中能看到水滴全部或大部分。一個(gè)載片上滴24滴，間隔一定距離，作直線排列。如一滴水中只有幾個(gè)所需同種藻類個(gè)體，無(wú)其他生物混雜，即用吸管吸取培養(yǎng)液，把這滴水沖入裝有培養(yǎng)液并經(jīng)滅菌試管或小三角瓶中去。如未成功，需反復(fù)重做，直到達(dá)到目的。 稀釋分離法把水樣稀釋到每一滴含有一個(gè)左右的生物細(xì)胞（也可能一個(gè)都沒有，也可能有兩個(gè)），在稀釋過(guò)程中配合顯微鏡檢查，調(diào)節(jié)稀釋度;準(zhǔn)備裝有1/4容量培養(yǎng)液的試管20支，每一試管加入稀釋適宜水樣一滴，搖勻，進(jìn)行培養(yǎng)。待藻類生長(zhǎng)繁殖達(dá)一定濃度時(shí)，再檢查是否達(dá)到分離目的，若未達(dá)到，再重復(fù)做。平板分離法這個(gè)方法的培養(yǎng)基制備和分離方法，與菌類的平板分離法基本相同，只是培養(yǎng)基配方

22、不同。也可將稀釋藻液裝入消毒過(guò)的小型噴霧器中（可使用醫(yī)用喉頭噴霧器），打開培養(yǎng)皿蓋，把藻液噴射在培養(yǎng)基平面上，形成分布均勻的薄層水珠。接種后，蓋上蓋，放在適宜的光、溫條件下培養(yǎng)。一般經(jīng)過(guò)十余天，就可在培養(yǎng)基上發(fā)生互相隔離的藻類群落，通過(guò)顯微鏡檢查，尋找需要的純?cè)迦郝?，然后用消毒過(guò)的接種環(huán)移植到另一平板培養(yǎng)基培養(yǎng)，也可直接移植到裝有培養(yǎng)液并經(jīng)過(guò)滅菌的試管或小三角燒瓶中，加消毒棉花塞子，進(jìn)行培養(yǎng)。2.1.3 海洋微生物的純培養(yǎng)選擇合適的培養(yǎng)基接種后，針對(duì)不同微生物種類培養(yǎng)條件也有差異;生長(zhǎng)在深?；蚝錁O區(qū)的嗜冷菌，培養(yǎng)是需要低溫：而分布在溫?zé)釒Ш^(qū)嗜溫菌，培養(yǎng)的最適溫度一般為25-30;不同菌種的

23、培養(yǎng)時(shí)間也有不同，常見的弧菌在25下培養(yǎng)2-3d即可長(zhǎng)出明顯菌落：而有些嗜冷菌則往往需要培養(yǎng)幾周才能出現(xiàn)肉眼可見的菌落。2.2 海洋微生物的鑒定鑒定微生物的技術(shù)分成四個(gè)不同水平：細(xì)胞的形態(tài)和習(xí)性水平，例如用經(jīng)典的研究方法，觀察細(xì)胞的形態(tài)特征、運(yùn)動(dòng)性、酶反應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)要求和生長(zhǎng)條件等。細(xì)胞組分水平，包括細(xì)胞組成成分例如細(xì)胞壁成分，細(xì)胞氨基酸庫(kù)，脂類，醌類，光合色素等的分析，所用的技術(shù)除常規(guī)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)外，還使用紅外光譜、氣相色譜和質(zhì)譜分析等新技術(shù)。蛋白質(zhì)水平，包括氨基酸序列分析、凝膠電泳和血清學(xué)反應(yīng)等若干現(xiàn)代技術(shù)?；蚧駾NA水平，包括核酸分子雜交（DNA與DNA或DNA與RNA），GCmol%值的測(cè)

24、定，遺傳信息的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)，16S rRNA（核糖體RNA）寡核苷酸組分分析，以及DNA或RNA的核苷酸順序分析等。分子和遺傳的分類法(1)DNA中的堿基組成 同種的DNA一定有著相同的堿基組分。相反,表型相似而遺傳物質(zhì)不同的微生物一定有不同的堿基組分。親緣關(guān)系越遠(yuǎn)的種,其堿基對(duì)排列順序差別就越大。再者,DNA堿基組分的排列順序、數(shù)量和比例在細(xì)胞中很穩(wěn)定，一般不受菌齡和外界因素的影響。 因此，分析微生物細(xì)胞中的DNA堿基組成可以作為分類中的指標(biāo)，尤其是在屬種一級(jí)的分類。這種分類方法已在某些細(xì)菌和酵母菌的分類中成功地得到應(yīng)用。(2)核酸分子雜交從理論上講，如果兩條DNA單鏈中的核苷酸順序完全互補(bǔ)地

25、相對(duì)應(yīng)，則兩條單鏈可以100地發(fā)生雜合；如果兩條DNA單鏈中的核苷酸順序不是完全互補(bǔ)地相對(duì)應(yīng)，則兩條單鏈可以按相應(yīng)的百分比發(fā)生雜合，因此可以利用DNADNA體外雜合程度來(lái)測(cè)定不同的微生物的DNA核苷酸排列順序的相似程度，借以判斷各菌種間的親緣關(guān)系。 大致做法是：選一株菌株作為參考菌株，并用同位素標(biāo)記其DNA。提純參考菌株的DNA和測(cè)定菌株的DNA，用加熱法使DNA變性成為DNA單鏈。將參考菌株的DNA單鏈與測(cè)定菌株的單鏈相混，并給予雜合復(fù)性的條件。再用磷酸二酯酶處理，去掉未雜合的DNA鏈。根據(jù)放射性同位素的量可測(cè)算出雜合的DNA的百分比（以標(biāo)記的參考菌株DNA和未標(biāo)記的參考菌株的DNA的雜合結(jié)

26、果作為100）16S rRNA（核糖體RNA）寡核苷酸組分分析60年代末，Woese利用寡核苷酸編目法對(duì)生物進(jìn)行分類，他通過(guò)比較各類細(xì)胞的16S rRNA特征序列，認(rèn)為16S rRNA及其類似序列作為生物系統(tǒng)發(fā)育指標(biāo)最為合適。主要依據(jù)：其為細(xì)胞共有，既含有保守序列又有可變序列，分子大小適合操作，它的序列變化與進(jìn)化距離相適應(yīng)。保守性能反映物種的親緣關(guān)系，為系統(tǒng)發(fā)育重建提供基礎(chǔ)；可變性能揭示出生物物種的特征核酸序列，是種屬鑒定的分子基礎(chǔ)。3 海洋未培養(yǎng)微生物資源的開發(fā)及應(yīng)用海洋中存在0.1-2億種微生物，目前只對(duì)其中6000進(jìn)行了研究，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室人工培養(yǎng)已經(jīng)分離和描述的海洋微生物物種數(shù)量?jī)H僅占估計(jì)

27、數(shù)量的1%-5%，而其余95%-99%的微生物種群仍然未被分離和認(rèn)識(shí)。未培養(yǎng)微生物的概念Colwell 實(shí)驗(yàn)室在1982年提出活的但不可培養(yǎng)微生物的概念，他們發(fā)現(xiàn)將霍亂弧菌和大腸埃希菌（簡(jiǎn)稱大腸桿菌）轉(zhuǎn)到不含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的鹽水中，經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間的低溫保存，細(xì)菌會(huì)進(jìn)入一種數(shù)量不減、有代謝活力、但在正常試驗(yàn)室培養(yǎng)條件下不能生長(zhǎng)產(chǎn)生菌落的狀態(tài)，稱為活的但不能培養(yǎng)（viable but nonculturable, VBNC）狀態(tài)。其后對(duì)多種屬細(xì)菌進(jìn)行試驗(yàn)證明，這種不可培養(yǎng)狀態(tài)是普遍存在的。自然界中也廣泛存在著這種活的但不可培養(yǎng)微生物，在各種生境中僅有小部分的微生物可用實(shí)驗(yàn)室方法分離培養(yǎng)，而未被培養(yǎng)的種類卻代表

28、了巨大的多樣性。 未培養(yǎng)微生物：指那些到目前為止人們還無(wú)法純培養(yǎng)的微生物。不可培養(yǎng)微生物：VBNC(viable but non-culture)指的是有些微生物可以在它們的棲息地被檢測(cè)到存在，但不能在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行人工培養(yǎng)。 B 微生物不可培養(yǎng)的原因微生物的生理類型(physiotypes)認(rèn)識(shí)不全面;采用高濃度的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)；實(shí)驗(yàn)室中無(wú)法完全模擬自然界的環(huán)境條件；環(huán)境微生物之間的相互關(guān)系被忽略；微生物與環(huán)境之間的相互關(guān)系被忽略;生長(zhǎng)緩慢的微生物被忽視。C 提高微生物可培養(yǎng)性的措施供應(yīng)新型的電子供體和受體；降低營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)濃度或添加過(guò)氧化物解除劑或抗氧化劑；維持微生物間的相互作用；分散微生物細(xì)胞；延長(zhǎng)培

29、養(yǎng)時(shí)間；利用瓊脂替代物。新生理型微生物 對(duì)于高濃度營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的影響，首先要降低營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的濃度，減少培養(yǎng)環(huán)境中的氧分壓可減弱毒性氧的影響，并可在培養(yǎng)過(guò)程中加入具有毒性氧降解能力的物質(zhì)如過(guò)氧化氫酶、丙酮酸鈉和-酮戊二酸等過(guò)氧化氫降解物和抗氧化劑二硫代二丙酸等 。D 提高微生物可培養(yǎng)性的方法a) 菌落轉(zhuǎn)移法(Removing newly formed colonies)微生物培養(yǎng)后，出現(xiàn)菌落后轉(zhuǎn)移到新的平板上，這樣可以延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，分離到更多種類的微生物。當(dāng)環(huán)境樣品轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基上時(shí), 一些菌的生長(zhǎng)可能會(huì)有一個(gè)延遲期, 在此期間, 這些菌可能會(huì)被其他快速生長(zhǎng)的菌落所掩蓋, 如一些可以在平板表面滑動(dòng)和

30、快速分散的細(xì)菌。菌落轉(zhuǎn)移法是將平板上新形成的菌落不斷地轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上, 通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)使那些生長(zhǎng)較緩慢的寡營(yíng)養(yǎng)菌得到生長(zhǎng)和分離的機(jī)會(huì)。b) 極限稀釋法極端稀釋培養(yǎng)是將環(huán)境微生物樣品不斷稀釋，使最后一個(gè)稀釋度中的細(xì)胞含量極低(1-10 個(gè)細(xì)胞),當(dāng)把海水中微生物群體稀釋至痕量時(shí),在海水中主要存在的寡營(yíng)養(yǎng)微生物可以不受少數(shù)幾種優(yōu)勢(shì)微生物的競(jìng)爭(zhēng)作用的干擾,因而主體寡營(yíng)養(yǎng)微生物被培養(yǎng)的可能性會(huì)大大提高。c) 高通量培養(yǎng)法 (High-throughput culturing , HTC)將樣品稀釋至痕量后，采用小體積48 孔細(xì)胞培養(yǎng)板分離培養(yǎng)微生物。該方法不僅有效提高微生物的可培養(yǎng)性，還可在短期

31、內(nèi)監(jiān)測(cè)大量的培養(yǎng)物,大大提高工作效率。d) 細(xì)胞包囊法 將海水和土壤樣品中的微生物先進(jìn)行類似稀釋培養(yǎng)法的稀釋過(guò)程,然后乳化,部分微生物形成了僅含單個(gè)細(xì)胞的膠狀微滴。然后將膠狀微滴裝入層析柱內(nèi),使培養(yǎng)液連續(xù)通過(guò)層析柱進(jìn)行流態(tài)培養(yǎng)。層析柱進(jìn)口端用0.11m 濾膜封住,防止細(xì)菌的進(jìn)入而污染層析柱;出口端用8m濾膜封住,允許培養(yǎng)產(chǎn)生的細(xì)胞隨培養(yǎng)液流出。該方法的特點(diǎn)是讓微生物在開放式培養(yǎng)液中生長(zhǎng),使培養(yǎng)環(huán)境接近于微生物的自然生長(zhǎng)環(huán)境,能夠很好地提高微生物可培養(yǎng)性,但成本較高,不利于普及使用。e) 擴(kuò)散盒培養(yǎng)法（Diffusiongrowth chamber） 擴(kuò)散盒由一個(gè)環(huán)狀的不銹鋼墊圈和兩側(cè)膠連的01

32、1m濾膜組成,濾膜只能允許培養(yǎng)環(huán)境中的化學(xué)物質(zhì)通過(guò)而不能讓細(xì)胞通過(guò)。將被分離的環(huán)境樣品放置于封閉的擴(kuò)散盒中,并在模擬采樣點(diǎn)環(huán)境條件的玻璃缸中進(jìn)行培養(yǎng)。擴(kuò)散盒的濾膜的孔徑大小可使盒內(nèi)與盒外互相有益的小分子代謝物質(zhì)自由出入,但是細(xì)胞卻不能自由移動(dòng)。培養(yǎng)時(shí),使天然海水循環(huán)流動(dòng),并不斷注入新鮮的海水。培養(yǎng)1 周后培養(yǎng)基上產(chǎn)生大量的微型菌落,數(shù)目高達(dá)接種微生物的40 %。f) 序列引導(dǎo)分離技術(shù) （Sequence-guiding isolation） ：是根據(jù)微生物基因組中特定基因的特異性序列，設(shè)計(jì)引物或雜交探針，以培養(yǎng)物中目標(biāo)序列存在和變化情況為標(biāo)準(zhǔn)，來(lái)指導(dǎo)對(duì)微生物最優(yōu)培養(yǎng)條件的選擇，培養(yǎng)出新的微生物

33、。 2.3.2 海洋微生物宏基因組研究概念宏基因組學(xué)的研究過(guò)程宏基因組學(xué)在海洋微生物研究的應(yīng)用A 概念宏基因組（Metagenome）是由handelsman 等1998 年提出的新名詞，其定義為：the genomes of the total microbiota found in nature；即生境中全部微小生物遺傳物質(zhì)的總和。宏基因組學(xué)（Metagenomics）就是一種以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對(duì)象，以功能基因篩選和測(cè)序分析為研究手段，以微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系為研究目的的新的微生物研究方法。宏基因組學(xué)宏基因組學(xué)是一種基于

34、無(wú)需預(yù)先培養(yǎng)來(lái)利用環(huán)境樣品基因組資源，獲得活性物質(zhì)和功能基因的新技術(shù)，因而繞過(guò)了菌種純培養(yǎng)障礙，可直接從自然界獲取遺傳信息，極大拓寬了微生物資源的利用空間，正成為國(guó)際生命科學(xué)研究最重要的熱點(diǎn)之一B 宏基因組學(xué)的研究過(guò)程宏基因組的提取宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建宏基因組文庫(kù)的篩選a 宏基因組的提取根據(jù)提取樣品總DNA前是否分離細(xì)胞將提取方法可以分為原位裂解法和異位裂解法。原位裂解法：通過(guò)去污劑處理、酶解法、機(jī)械破碎法、以及高溫或凍融法等直接破碎樣品中的微生物細(xì)胞而使DNA得以釋放。此法提取的DNA 能更好地代表樣品微生物的多樣性，而且此法操作容易、成本低、DNA 提取率高，但由于機(jī)械剪切作用較強(qiáng)，所提取的

35、DNA片段較?。?-50 kb），且腐殖酸類物質(zhì)也難以完全去除。多用于構(gòu)建小片段插入文庫(kù)。異位裂解法：采用物理方法如介質(zhì)密度梯度離心法將微生物細(xì)胞從樣品中分離出來(lái)，然后采用較溫和的方法抽提DNA如低熔點(diǎn)瓊脂糖包埋裂解，脈沖凝膠電泳回收DNA 。此法處理?xiàng)l件溫和，可獲得大片段DNA（20-500 kb），純度高、但操作繁瑣、成本高、得率也較低、有些微生物在分離過(guò)程中可能丟失、溫和條件下一些細(xì)胞壁較厚的微生物DNA 抽提不出來(lái)。多用于構(gòu)建大片段插入文庫(kù)、柯斯質(zhì)?；蛘呒?xì)菌人工載體為載體的DNA提取。載體選擇克隆中宿主菌株的選擇主要考慮到轉(zhuǎn)化效率、宏基因的表達(dá)、重組載體在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性以及目標(biāo)性狀

36、的篩選等大腸桿菌，鏈霉菌和假單胞菌大片段插入載體、表達(dá)載體、穿梭載體Comparison of different clone vectors宏基因組文庫(kù)的建立宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建策略取決于研究的整體目標(biāo)。偏重于低拷貝、低豐度基因還是高拷貝、高豐度基因要取決于研究的目的是單個(gè)基因或基因產(chǎn)物還是整個(gè)操縱子及編碼不同代謝途徑的基因簇。基因文庫(kù)的建立過(guò)程中需要選擇合適的克隆載體和宿主菌株。直接利用表達(dá)載體構(gòu)建宏基因文庫(kù)，但是表達(dá)載體可插入的宏基因片段一般小于10 kb。b 宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建c) 宏基因組文庫(kù)的篩選根據(jù)其研究目的，宏基因組文庫(kù)的篩選通常有兩種方法院功能篩選（functional scr

37、eening）和序列篩（sequence-basedscreening）。功能篩選法根據(jù)重組克隆產(chǎn)生的新活性進(jìn)行篩選。可用于檢測(cè)編碼新型酶的全部新基因或者獲取新的生物活性物質(zhì)，該法對(duì)全長(zhǎng)基因及功能基因的產(chǎn)物具有選擇性。不需要已知序列的信息，能較快地找到可用于工農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥的蛋白質(zhì)和天然產(chǎn)物一種是對(duì)具有特殊功能的克隆子進(jìn)行直接檢測(cè)，如利用其在選擇性培養(yǎng)基上的表型特征進(jìn)行篩選。這種方法具有較高的靈敏度，可檢測(cè)到較少的目的克隆。另一種方法是基于異源基因的宿主菌株與其突變體在選擇性條件下功能互補(bǔ)生長(zhǎng)的特性進(jìn)行 ?；诠δ艿暮Y選方法優(yōu)點(diǎn)是篩選過(guò)程比較簡(jiǎn)單、快速，只要基因能表達(dá)，就可以根據(jù)基因表達(dá)特性進(jìn)行篩

38、選，不需要復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)過(guò)程。缺點(diǎn)是這種篩選方法依賴于目的基因在新的宿主中表達(dá)，但使用模式微生物并不能把所有的宏基因組DNA表達(dá)出來(lái)，而且要求克隆到基因或基因簇的全長(zhǎng)，一旦克隆過(guò)程中破壞基因某個(gè)組件將使得基因沒法表達(dá)，也就不能根據(jù)功能進(jìn)行篩選，故檢出的概率很低，工作量大。序列篩選法根據(jù)已知相關(guān)功能基因的保守序列設(shè)計(jì)探針或PCR 引物，通過(guò)雜交或PCR 擴(kuò)增篩選陽(yáng)性克隆子。其優(yōu)點(diǎn)是不必依賴宿主菌株來(lái)表達(dá)克隆基因，已建立的雜交或PCR 擴(kuò)增技術(shù)可用于篩選工作中，且基于DNA 的操作有可能利用基因芯片技術(shù)而大大提高篩選效率。其缺點(diǎn)是必須對(duì)相關(guān)基因序列有一定的了解，較難發(fā)現(xiàn)全新的活性物質(zhì)，也很難獲得全序列

39、。C 宏基因組學(xué)在海洋微生物研究的應(yīng)用1、海洋生物活性產(chǎn)物的痕量存在；2、海洋生物活性物質(zhì)難于化學(xué)合成；3、產(chǎn)生活性物質(zhì)的海洋微生物難于人工培養(yǎng)宏基因組工程與海洋生物學(xué)進(jìn)行有機(jī)的結(jié)合，促使人類了解許多為培養(yǎng)海洋微生物的基因組序列及其功能產(chǎn)物，在海洋天然藥物研究、海洋極端環(huán)境微生物研究、海洋微生物多樣性探索中具有十分重要的應(yīng)用前景。C 宏基因組學(xué)在海洋微生物研究的應(yīng)用從海洋宏基因組中發(fā)現(xiàn)新的基因；開發(fā)新的微生物活性物質(zhì)，用于藥物開發(fā)；多種環(huán)境海洋微生物多樣性研究；研究海洋微生物群落和環(huán)境之間的關(guān)系。4 海洋微生物單細(xì)胞蛋白4.1 概念4.2 特點(diǎn)4.3 菌種要求4.4 生產(chǎn)工藝4.5 存在問題4

40、.6 SCP生產(chǎn)新技術(shù)4.7 應(yīng)用4.1 概念單細(xì)胞蛋白又叫微生物蛋白、菌體蛋白，是發(fā)酵所得的微生物細(xì)胞。1967年在第一次全世界單細(xì)胞蛋白會(huì)議上，將微生物菌體蛋白統(tǒng)稱為單細(xì)胞蛋白。按生產(chǎn)原料不同，可以分為石油蛋白、甲醇蛋白、甲烷蛋白等；按所得產(chǎn)品用途，可分為飼料蛋白、食用蛋白。 按產(chǎn)生菌的種類不同，又可以分為細(xì)菌蛋白、真菌蛋白、酵母蛋白、微藻蛋白等。功能：可用于飼料工業(yè)和食品工業(yè)，作為補(bǔ)充蛋白質(zhì)的配料。利用其功能性質(zhì)，還可用于制乳化劑、分散劑、起泡劑或作組織蛋白，用于仿肉制品等。 4.2 特點(diǎn)4.2.1單細(xì)胞蛋白質(zhì)可以不受氣候等外界條件的影響，工業(yè)化生產(chǎn)。4.2.2 原料豐富農(nóng)業(yè)廢物、廢水，

41、如秸稈、蔗渣、甜菜渣、木屑等含纖維素的廢料及農(nóng)林產(chǎn)品的加工廢水；工業(yè)廢物、廢水，如食品、發(fā)酵工業(yè)中排出的含糖有機(jī)廢水、亞硫酸紙漿廢液等；石油、天然氣及相關(guān)產(chǎn)品，如原油、柴油、甲烷、乙醇等；H2、CO2等廢氣。 4.2.3 生產(chǎn)周期快、效率高4.2.4 營(yíng)養(yǎng)豐富單細(xì)胞蛋白所含的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)極為豐富，其中，蛋白質(zhì)含量高達(dá)40%80%，比大豆高10%20%，比肉、魚、奶酪高20%以上；氨基酸的組成較為齊全，含有人體必需的8種氨基酸，尤其是谷物中含量較少的賴氨酸。單細(xì)胞蛋白中還含有多種維生素、碳水化合物、脂類、礦物質(zhì)，以及豐富的酶類和生物活性物質(zhì)，如輔酶A、輔酶Q、谷胱甘肽、麥角固醇等。 生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白質(zhì)

42、的微生物 生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白質(zhì)的微生物種類很多，有酵母菌、細(xì)菌、霉菌和擔(dān)子菌等。 糖質(zhì)原料：酵母屬和假絲酵母屬為主要生產(chǎn)菌。 正烷烴：假絲酵母為最主要利用菌。 甲烷：能利用甲烷作為唯一碳源的微生物，主要是細(xì)菌，如甲烷假單胞菌等。 甲醇：主要以細(xì)菌為主，放線菌、酵母菌和霉菌次之。甲烷利用菌也為甲醇利用菌，但反之不一定。甲醇利用菌多數(shù)為革蘭氏陰性細(xì)菌。 乙醇：以酵母占多數(shù)，其次為細(xì)菌和霉菌。酵母菌中有假絲酵母屬、酵母屬等。 醋酸：細(xì)菌中有短桿菌屬等，酵母中有假絲酵母屬等，霉菌中有曲霉屬等。 氫氣和碳酸氣：能以CO2為唯一碳源，氫氣為唯一能源的細(xì)菌稱為氫細(xì)菌。氫細(xì)菌在分類學(xué)上為氫單胞菌屬。4.3 菌種要

43、求4.4 生產(chǎn)工藝4.5 存在問題營(yíng)養(yǎng)素不平衡：營(yíng)養(yǎng)素缺乏或不平衡，如藻類的飽和和不飽和脂肪酸變化，類固醇、維生素、礦物質(zhì)、多糖等成分變化；過(guò)高的核酸含量，特別是酵母達(dá)到8%-16%，對(duì)生物生長(zhǎng)抑制，嘌呤后形成尿酸，可引起尿結(jié)石和其它代謝疾病。因此要提取核酸；石油衍生物培養(yǎng)基上的單細(xì)胞蛋白，可能含有有害物質(zhì)；低消化率，單細(xì)胞蛋白中存在類似胞壁質(zhì)和二氨基庚二酸等真菌肽，與食物中的蛋白成分結(jié)合，延緩了飼料的消化。二是單細(xì)胞蛋白中存在著葡聚糖、甘露聚糖等一些不可消化的成分，影響日糧干物質(zhì)的可消化性。細(xì)胞破碎、酶解等；適口性較差，并且酵母有苦味，要進(jìn)行蛋白的組織化。4.6 single-cell pr

44、otein （SCP）生產(chǎn)新技術(shù)DNA重組單細(xì)胞蛋白 含有魚類生長(zhǎng)激素的重組酵母等的生產(chǎn)。富硒或富鉻 富硒：補(bǔ)充血硒水平，優(yōu)于亞硒酸鈉； 富鉻：加速脂肪分解代謝，較少體脂。4.7 應(yīng)用用作食品有些單細(xì)胞蛋白質(zhì)，特別是用農(nóng)產(chǎn)品培養(yǎng)生長(zhǎng)的酵母菌菌體可用作食品（必要時(shí)要先經(jīng)過(guò)處理）。 用作飼料用單細(xì)胞蛋白質(zhì)作為飼料，可以節(jié)約糧食，促進(jìn)畜牧業(yè)發(fā)展。 用作其他，從單細(xì)胞蛋 白質(zhì)中可提取許多有用之物，如輔酶A，細(xì)胞色素C和輔酶I等醫(yī)藥產(chǎn)品，如酵母浸出汁等生物試劑。 5 海洋微生物單細(xì)胞油脂5.1 概念5.2 優(yōu)點(diǎn)5.3 產(chǎn)油微生物種類5.4 合成途徑5.5 基本生產(chǎn)工藝5.6 應(yīng)用5.1 概念1989年，

45、Ratldege提出:某些微生物在一定條件下能將碳水化合物、碳?xì)浠衔锖推胀ㄓ椭忍荚崔D(zhuǎn)化為菌體內(nèi)大量貯存的油脂，如果油脂積累量能超過(guò)細(xì)胞總量的20%，即稱為產(chǎn)油微生物(oleginous micororganisms)。微生物油脂又稱為單細(xì)胞油脂(Snigle cell oil，SCO)，是指由霉菌、酵母菌、細(xì)菌和藻類及其他油脂微生物在一定的培養(yǎng)條件下，利用碳源在菌體內(nèi)大量合成并積累的三酰甘油、游離的脂肪酸類以及其他一些脂質(zhì)。其脂肪酸組成與一般的植物油脂相似，主要是C16、C18系脂肪酸，如棕?cái)R酸、硬脂酸、油酸和亞麻酸等。微生物油脂研究歷史悠久，最早可追溯到十九世紀(jì)70年代中期。第一次世界大

46、戰(zhàn)期間，當(dāng)時(shí)德國(guó)科學(xué)家準(zhǔn)備利用內(nèi)抱霉屬和鐮刀菌屬的某些菌種作為油脂生產(chǎn)菌，以緩解當(dāng)時(shí)食用油脂的供應(yīng)不足的狀況。大約在1920年到1945年之間，德國(guó)科學(xué)家篩選出了適合生產(chǎn)用的菌種。二十世紀(jì)五十年代左右，美國(guó)、英國(guó)等一些國(guó)家也開始發(fā)展微生物油脂的研究。5.2 優(yōu)點(diǎn)微生物適應(yīng)性強(qiáng)，生長(zhǎng)繁殖迅速，生長(zhǎng)周期短，代謝活力強(qiáng)，易于培養(yǎng)和進(jìn)行品種改良。微生物生產(chǎn)油脂所需勞動(dòng)力低，占地面小，且不受場(chǎng)地、氣候和季節(jié)變化等的限制，能連續(xù)大規(guī)模生產(chǎn)。微生物生長(zhǎng)所需原材料的來(lái)源十分豐富而且價(jià)格便宜，可利用農(nóng)副產(chǎn)品、食品加工以及造紙業(yè)的廢棄物(如乳清、糖蜜、木材糖化液等)為培養(yǎng)基原料，十分有利于廢物再利用和環(huán)境保護(hù)。微

47、生物油脂的生物安全性好，毒副作用少?？梢杂脕?lái)開發(fā)功能性油脂，如富含油酸、-亞麻酸、AA, EPA, DHA、角鱉烯、二元羧酸等的油脂以及代可可脂。5.3 產(chǎn)油微生物種類5.3.1 細(xì)菌5.3.2 酵母菌5.3.3 霉菌5.3.4 藻類5.3.1 細(xì)菌細(xì)菌在高葡萄糖時(shí)產(chǎn)生不飽和的甘油酸三酯，但大多細(xì)菌不生產(chǎn)而是積累復(fù)雜的類脂，加之產(chǎn)生于細(xì)胞外膜上，提取困難，故產(chǎn)油細(xì)菌在工業(yè)應(yīng)用上沒有實(shí)際意義。5.3.2 酵母菌酵母在脂肪酸的分布模式上相當(dāng)單一，絕大多數(shù)酵母僅有C16和C18脂肪酸，其中基本的飽和脂肪酸是軟脂酸，基本的不飽和脂肪酸是油酸，少數(shù)酵母中最多的單不飽和脂肪酸是棕櫚油酸，多不飽和脂肪酸在酵

48、母中也存在，油酸含量一般較豐富，但亞油酸含量很少。大多數(shù)酵母中總的油脂含量一般低于20%。酵母轉(zhuǎn)化碳水化合物為油脂的理論轉(zhuǎn)化率為33%，但實(shí)際轉(zhuǎn)化率很少超過(guò)20%。5.3.3 霉菌霉菌中脂肪酸類型要比酵母豐富很多。油脂含量超過(guò)25%的霉菌約有64種，很多霉菌油脂含量在20%一25%之間。霉菌主要用于生產(chǎn)高比例的不飽和脂肪酸。不同霉菌的脂肪酸組成有很大差別。5.3.4 藻類海藻中有少量的產(chǎn)油藻，他們生產(chǎn)的油脂中多不飽和脂肪酸含量較高，包括亞麻酸，其中尤以棕?cái)R酸、棕?cái)R油酸和二十碳五烯酸(EAP)為主。微藻中油脂含量有些超過(guò)70%，但在無(wú)菌、光照發(fā)酵罐中培養(yǎng)海藻成本較高。只有少數(shù)微藻可以在室外環(huán)境下

49、商業(yè)化生產(chǎn)。5.4 合成途徑乙酞一CoA的形成脂肪酸的合成脂肪酸碳鏈的延長(zhǎng)和去飽和甘油三酯合成5.5 基本生產(chǎn)工藝菌種篩選原料制備碳源(碳水化合物、碳?xì)浠衔锖陀椭?菌體(微藻、酵母、霉菌和細(xì)菌)下游加工(提取，精制等)生物油脂(供食用，營(yíng)養(yǎng)劑或非食用)。5.5.1 菌種油脂積蓄量大，含油量應(yīng)達(dá)50%左右；油脂生成率高，轉(zhuǎn)化率不低于15%；能適應(yīng)工業(yè)化深層培養(yǎng)，設(shè)備簡(jiǎn)單；生長(zhǎng)速度快，不易被雜菌污染；風(fēng)味良好，食用安全無(wú)毒，且易消化吸收。5.5.2 提取細(xì)胞破碎：菌株自溶法、超聲破碎法、高壓勻漿破碎法、化學(xué)破碎法、酶處理法、凍融法油脂提?。?有機(jī)溶劑法，有機(jī)溶劑法主要是利用油脂易溶于多種有機(jī)溶劑

50、，在各有機(jī)溶劑中溶解性又不同的性質(zhì)，將油脂提取出來(lái)。氯仿-甲醇提取法是目前較為普遍的一種方法，有機(jī)溶劑法所需設(shè)備較簡(jiǎn)單，油脂得率也高，但提取溫度較高，油脂純度較低，還存在毒性和污染問題。 超臨界CO2萃取法，主要是利用超臨界流體的溶解能力與其密度的關(guān)系，即利用壓力和溫度對(duì)超臨界流體溶解能力的影響而進(jìn)行的。超臨界CO2萃取溫度低，油脂中的活性成分不易受熱、受氧化破壞而損失，且CO2極性低，提出的油脂中雜質(zhì)少，純度高。而且，超臨界CO2操作簡(jiǎn)便，不使用到有毒易燃的有機(jī)溶劑，可降低成本，提高安全性。所以，超臨界CO2法較為適合工業(yè)生產(chǎn)。5.5.3 精煉微生物油脂的精煉工藝主要包括水化脫膠、堿煉、脫色

51、、脫臭等工序。精煉后的油脂分析指標(biāo)包括:氣味和滋味、色澤、水分、比重、透明度、酸價(jià)、碘價(jià)、過(guò)氧化值、脂肪酸組成、甘油三酯組成等。5.6 應(yīng)用食品行業(yè)飼料醫(yī)藥生物柴油6 海洋微生物酶海洋細(xì)菌、真菌、古菌等都被報(bào)道可以產(chǎn)生多種酶類，有瓊脂糖酶（Agarase）、谷氨酰胺酶（Glutaminase）、脂肪酶（Lipase）、幾丁質(zhì)酶（Chitinase）、蛋白酶（Protease）、淀粉酶（Amylase）等常規(guī)酶以外，還產(chǎn)生多種極端酶。 極端酶（Extremozyme）是指那些在非常規(guī)條件下仍然發(fā)揮作用的酶，它主要來(lái)源于極端微生物，能在各種極端環(huán)境中起生物催化作用，是極端微生物在極其惡劣環(huán)境中生存

52、和繁衍的基礎(chǔ)。 5.1 嗜熱酶 最適溫度在5580之間的酶稱為嗜熱酶；最適溫度在80113之間的酶稱為超嗜熱酶(Hyperthermophilic enzyme)。也可以把這些最適溫度在55以上的酶泛稱為嗜熱酶。 嗜熱酶的優(yōu)點(diǎn)酶制劑的制備成本降低。因?yàn)槭葻崦傅姆€(wěn)定性高，因而可以在室溫下分離提純和包裝運(yùn)輸，并且能長(zhǎng)久地保持活性；加快了動(dòng)力學(xué)反應(yīng)。隨著反應(yīng)溫度的提高，分子運(yùn)動(dòng)速度加快，酶催化能力加強(qiáng)；對(duì)反應(yīng)器冷卻系統(tǒng)的要求標(biāo)準(zhǔn)降低，因而減少了能耗。由于嗜熱酶有耐高溫的特性，所以生產(chǎn)中不需要復(fù)雜的冷卻裝置。一方面節(jié)省了開支，另一方面也降低了冷卻過(guò)程對(duì)環(huán)境所造成的污染；提高了產(chǎn)物的純度。在嗜熱酶催化反

53、應(yīng)條件下，很少有雜菌生存，從而減少了細(xì)菌代謝物對(duì)產(chǎn)物的污染；嗜熱酶對(duì)有機(jī)溶劑、去污劑和變性劑有較強(qiáng)抗性。 應(yīng)用造紙工業(yè)：木聚糖酶 洗滌劑行業(yè) ：蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纖維素酶 食品工業(yè) ：蛋白酶、淀粉酶環(huán)境保護(hù)：脂肪酶、蛋白酶等制藥：有機(jī)相中的酶催化合成 蛋白酶、脂肪酶分子生物學(xué)方面 ：DNA聚合酶5.2 嗜冷酶 低溫酶，也稱嗜冷酶(psychrophilic enzyme)、冷活性酶(cold active enzyme)或適冷酶(cold-adapted-enzyme)，主要來(lái)源于低溫微生物。 5.3 耐有機(jī)溶劑酶 在有機(jī)溶劑中保持較高活性和穩(wěn)定性的酶統(tǒng)稱為耐有機(jī)溶劑酶活有機(jī)溶劑穩(wěn)定性酶

54、。優(yōu)點(diǎn)提高非極性底物和產(chǎn)物的溶解度；有利于某些反應(yīng)的熱力學(xué)平衡向合成方移動(dòng)；產(chǎn)物易于分離純化；特異性性增強(qiáng)；防止微生物污染；氨基酸側(cè)鏈一般不需要保護(hù)。應(yīng)用生物柴油：脂肪酶藥物：手性藥物拆分、脂肪酶、蛋白酶、羥基化酶、過(guò)氧化物酶、多酚氧化酶、 膽固醇氧化酶 、醇脫氫酶 5.4 嗜壓酶研究表明, 靜壓力能夠?qū)γ傅臒岱€(wěn)定性產(chǎn)生明顯的促進(jìn)作用, 高壓作用下酶通常具有良好的立體專一性; 但當(dāng)壓力超過(guò)一定的范圍時(shí), 酶的弱鍵容易被破壞, 導(dǎo)致酶的構(gòu)象解體而發(fā)生失活。因此, 從海洋微生物體內(nèi)篩選嗜壓酶,能夠彌補(bǔ)這一問題, 從而挖掘嗜壓酶在工業(yè)上的應(yīng)用潛力。深海嗜壓微生物是獲取嗜壓酶的重要來(lái)源。1979 年有

55、人第一次從 4500 m 以下的深海環(huán)境中分離到嗜壓菌。日本從海洋環(huán)境中分離到多株嗜壓菌, 發(fā)現(xiàn)深海嗜壓菌體內(nèi)的基因、蛋白質(zhì)和酶對(duì)高壓環(huán)境具有極高的適應(yīng)能力, 嗜壓菌的發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步開發(fā)和研究嗜壓酶提供了良好的基礎(chǔ)。 5.5 嗜酸酶、嗜堿酶海底環(huán)境中存在一些高酸、 高堿的區(qū)域, 這些區(qū)域中分離到的微生物往往具有很強(qiáng)的嗜酸性或嗜堿性,能夠在 pH5 甚至 pH 1 以下, 或 pH 9 以上的特殊環(huán)境中生存, 它們產(chǎn)生的胞外酶通常也是相應(yīng)的嗜酸酶( 最適 pH 9. 0) 。同中性酶相比,嗜酸酶在酸性環(huán)境中的穩(wěn)定性是由于酶分子所含的酸性氨基酸比率偏高, 嗜堿酶分子所含的堿性氨基酸的比率偏高。而它們

56、產(chǎn)生的耐酸極酶或耐堿極酶, 有可能應(yīng)用于催化酸性溶液或堿性溶液中化合物的形成。5.6 嗜鹽酶海水的平均含鹽量為 3%, 部分區(qū)域?yàn)楦吒畸}區(qū)域, 其中生活有大量的耐鹽或嗜鹽微生物。嗜鹽微生物體內(nèi)的很多酶類能夠在高鹽濃度下保持穩(wěn)定性,為開發(fā)這類工業(yè)酶提供良好的來(lái)源。 嗜酸酶、嗜堿酶、嗜壓酶、嗜鹽酶、耐抗代謝物酶及耐重金屬酶。 展望海洋生物酶的研究是海洋生物研究開發(fā)計(jì)劃的重要方面。海洋生物特別是海洋極端微生物的工業(yè)應(yīng)用酶已經(jīng)成為美國(guó)海洋生物技術(shù)的重要領(lǐng)域,由海洋基金資助的 1997 1999 年在研項(xiàng)目中, 海洋生物酶項(xiàng)目就有 4 個(gè)。日本在海洋生物酶的研究方面也在不斷加大投入, 1992 年提出了深海微生物中尋找具有特殊性質(zhì)的蛋白質(zhì)的基