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1、Useful Documents 博士研究生科研計(jì)劃書 （） 姓名： 報考專業(yè)： 計(jì)劃書題目： 細(xì)胞角蛋白 CA20 對胃癌微轉(zhuǎn)移 的預(yù)測價值及臨床意義 20XX 年 2 月 、立題依據(jù) Useful Documents Useful Documents 重點(diǎn)介紹本項(xiàng)目的科學(xué)意義、國內(nèi)外現(xiàn)狀，并附主要參考文獻(xiàn) 胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，居消化道腫瘤發(fā)病率之首，多見于男性，男女發(fā)病率之比 為 2:1 ，死亡率居惡性腫瘤首位，平均死亡年齡為 61.6 歲。臨床上診斷的多為進(jìn)展期胃癌 患者，即使經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)的根治性手術(shù)治療， 其 5 年生存率仍在 40% 左右，其中最重要的原因是 胃癌患者術(shù)后了腹膜轉(zhuǎn)移

2、。 近年來在臨床開展的術(shù)前輔助化療，也即新輔助化療 (neoadjuvantchemotherapy,NACT) 是指在惡性腫瘤局部治療、手術(shù)或放療前給予的全 身或局部化療，也稱術(shù)前化療 (preoperativechemotherapy) 。新輔助化療是對腫瘤外科 醫(yī)生及內(nèi)科醫(yī)生觀念上的一個挑戰(zhàn)， 其理論依據(jù)是 :手術(shù)切除原發(fā)腫瘤可能會刺激剩余腫瘤 細(xì)胞的生長 ;腫瘤周圍組織在術(shù)后血供改變影響化療藥物濃度及放療效果 ;新輔助化療、放 療的組織病理學(xué)反應(yīng)與預(yù)后呈正相關(guān) :可以達(dá)到預(yù)期的目的以提高手術(shù)切除率， 減少術(shù)中播 散可能性，降低腫瘤細(xì)胞活性 ;消除潛在的微轉(zhuǎn)移灶，降低術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的可能

3、;術(shù)前通過 可測量病灶及術(shù)后標(biāo)本準(zhǔn)確判定臨 床緩解率和病理學(xué)有效率 ;新輔助治療可剔除不宜手術(shù)治療的患者。 新輔助化療使進(jìn)展期胃 癌治療的效果得到顯著改善， WilAe 等1和 PluAAer2 的 II 期臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， NACT 能 夠使原剖腹探查無法切除的胃癌獲得 30%-50% 的再切除率，這些再切除患者的中位生存 期為 24 個月，遠(yuǎn)高于原無法切除患者小于 6 個月的生存期。胃癌的腹膜轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)占所 有胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)的半數(shù)以上， 而腹膜轉(zhuǎn)移者的 5 年生存率低于 20% 。臨床所遇腹膜轉(zhuǎn)移患 者多數(shù)在已出現(xiàn)腹水、盆腔腫塊或腸梗阻時才得以確診，已失去治療最好時機(jī)，故胃癌腹 膜轉(zhuǎn)移的早期診

4、斷和治療具有重要意義。腹膜轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素是腹腔內(nèi)脫落的癌細(xì)胞和腹 膜微轉(zhuǎn)移灶的存在。微轉(zhuǎn)移是指在手術(shù)治療時已經(jīng)存在的各種機(jī)體組織、及細(xì)胞移植物中 的腫瘤殘留，是用常規(guī)形態(tài)學(xué)診斷技術(shù)不能檢測出的、隱匿在原發(fā)灶以外的轉(zhuǎn)移。胃癌腹 膜微轉(zhuǎn)移指術(shù)前或術(shù)中常規(guī)檢查難以發(fā)現(xiàn)的，單個癌細(xì)胞或一小簇癌細(xì)胞構(gòu)成的種植于腹 膜的微小轉(zhuǎn)移。 Useful Documents Useful Documents 胃癌腹膜轉(zhuǎn)移發(fā)生的途徑和步驟可能為 :1.原發(fā)灶的腫瘤細(xì)胞穿透漿膜，脫落到腹腔內(nèi)，形 成高度生物活性的游離腫瘤細(xì)胞。 2.在一些因子的介導(dǎo)下粘附在腹膜上。 3.在基質(zhì)消化酶 和相關(guān)因子的作用下， 腫瘤細(xì)胞向腹膜

5、組織浸潤。 4.腫瘤細(xì)胞不斷增值， 形成種植結(jié)節(jié) 3 。 前 3 個階段為微轉(zhuǎn)移階段，肉眼不可見，亦無法用影像學(xué)方法或常規(guī)HE 染色診斷，須通 過免疫組織化學(xué)或 PCR 等方法檢測腫瘤特異性標(biāo)志物。第 4 階段已經(jīng)形成肉眼或影像學(xué) 檢查可見的轉(zhuǎn)移。近年來，組織化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展使得微轉(zhuǎn)移領(lǐng)域也有了 較快的發(fā)展 ;隨著免疫組化和 (RT-PCR)方法的應(yīng)用越來越趨向于成熟化和規(guī)范化，微轉(zhuǎn)移 檢測領(lǐng)域日益受到重視，腫瘤微轉(zhuǎn)移的檢測可望成為腫瘤患者的常規(guī)檢查。 目前對于胃癌腹膜微轉(zhuǎn)移診斷的研究多集中在對腹腔內(nèi)脫落癌細(xì)胞 (ECC)的研究，其中 最簡便、常用的是腹腔灌洗液細(xì)胞學(xué)檢查印，但是

6、 PLC的陽性率低。 隨著免疫細(xì)胞化學(xué)和 逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng) (reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR) 方法 的發(fā)展和應(yīng)用， ECC 的檢出率大大提高。但腹腔內(nèi)脫落的癌細(xì)胞必須粘附于腹膜、著床并 增殖方可形成微轉(zhuǎn)移灶和轉(zhuǎn)移灶。所以腹膜組織內(nèi)種植癌細(xì)胞的檢測，可以更直觀地證實(shí) 胃癌腹膜微轉(zhuǎn)移的存在。 目前對于胃癌腹膜微轉(zhuǎn)移的研究已經(jīng)越來越多，但大多數(shù)都是針對腹腔沖洗液、腹腔 脫落細(xì)胞進(jìn)行研究 ;術(shù)中取腹膜組織進(jìn)行檢測的，較少報道，而像本試驗(yàn)一樣，術(shù)中多處取 材，取橫結(jié)腸系膜前葉、網(wǎng)膜囊后壁近胰腺上緣處、胰腺被膜、盆底腹膜組織，檢

7、測胃癌 腹膜微轉(zhuǎn)移者，尚無報道。本試驗(yàn)證實(shí)免疫組化法檢測細(xì)胞角蛋白 CA20 能夠檢測胃癌腹 膜微轉(zhuǎn)移，并為胃癌根治術(shù)術(shù)式的胃癌細(xì)胞比較容易通過脫落種植，淋巴轉(zhuǎn)移等途徑擴(kuò)散 到胃周系膜組織內(nèi)。 如果能在在胃癌根治術(shù)中對多處腹膜組織進(jìn)行活檢， 行免疫組化染色， 檢測 CA20 ，并與常規(guī) HE染色及 PLC檢查結(jié)果相比較。結(jié)果表明，雖然常規(guī) HE 染色檢 查并不能發(fā)現(xiàn)，實(shí)際上橫結(jié)腸系膜前葉、胰腺被膜和胰腺上方的網(wǎng)膜囊后壁等處組織內(nèi)確 實(shí)已存在微轉(zhuǎn)移灶 ,以保障手術(shù)的徹底性 .腹腔化療是一操作簡單而行之有效的治療方法， 能改善經(jīng)靜脈化療無法完成的腹腔內(nèi)游離癌細(xì)胞陽性和鏡下腹膜轉(zhuǎn)移患者的抗腫瘤果，可

8、 治療進(jìn)展期胃癌術(shù)后腹腔殘存微小癌灶，并防止腹腔復(fù)發(fā)?？梢酝ㄟ^術(shù)中腹腔內(nèi)置化療藥 Useful Documents Useful Documents 物緩釋劑或術(shù)后通過留置導(dǎo)管腹腔內(nèi)給藥。腹腔化療目前尚無統(tǒng)一的用藥標(biāo)準(zhǔn)，正逐步由 單一用藥向聯(lián)合用藥發(fā)展。腹腔化療一般很少發(fā)生嚴(yán)重并發(fā)癥，與靜脈化療相比，其全身 并發(fā)癥及副作用的發(fā)生率較低，但局部并發(fā)癥的發(fā)生率較高，應(yīng)注意預(yù)防(刑會軍 )及早診 斷胃癌腹膜微轉(zhuǎn)移，對于胃癌復(fù)發(fā)和預(yù)后的判斷及指導(dǎo)臨床治療有著極其重要的意義。 臨床所見的胃癌多為進(jìn)展期胃癌，約 50% 的患者術(shù)后可發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移 4 。發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移 的患者對靜脈輔助化療、放療等治療手段均不

9、敏感，生存率較低。故及早現(xiàn)腹膜微轉(zhuǎn)移， 早期治療，預(yù)防和阻斷腹膜轉(zhuǎn)移的發(fā)生顯得尤為重要，而對于已發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移的患者，可 通過減瘤手術(shù)配合腹腔化療，以期延長患者的生存時間。 1 WilAeH,PreusserP ,FinAU,etal.Preoperativechemotherapyinlocallyadvancedandn onresectablegastriccancer:aphaseIIstudywithetoposide,doGorubicin,andcisplatin J.JClinOncol,1989,7:1318-1326. 2 PluAAerJT,MulderNH,Sleijfe

10、rDT,etal,Chemotherapyandsurgeryforlocallyadvanc edcancerofthecardiaandfundus:phaseIIstudywithmethotreGateand5-fluorouracill J.BrJSurg,1991,78:955-958. 3 吳晴，程海霞，李兆申 .疾病分冊 .20XX,25(3): 胃癌腹膜微轉(zhuǎn)移的基因研究進(jìn)展 J.國外 醫(yī)學(xué).消化 139-143. 4 TanaAT,AumagaiA,ShimizuA,etal.Peritonealmetastasisingastriccancerwithpartic ular

11、referencetolymphaticadvancement;eGtranodalinvasionisagnificantrisAfactorf orperitonealmetastasis.JSurgOnco1,20XX,75:165-171. Useful Documents Useful Documents 、研究內(nèi)容 研究目標(biāo)、研究內(nèi)容、創(chuàng)新之處和擬解決的關(guān)鍵問題 本研究在胃癌根治術(shù)中對多處腹膜組織進(jìn)行活檢，行免疫組化染色，檢測CA20 ，并 與常規(guī) HE 染色及 PLC檢查結(jié)果相比較。雖然常規(guī) HE 染色檢查并不能發(fā)現(xiàn)，胰腺被膜、 橫結(jié)腸系膜前葉、和胰腺上方的網(wǎng)膜囊后壁等處組織內(nèi)確

12、實(shí)已存在微轉(zhuǎn)移灶，并且微轉(zhuǎn)移 發(fā)生概率與腫瘤大小、侵透漿膜等因素相關(guān)。因此對于進(jìn)展期胃癌，尤其是腫瘤較大、侵 透漿膜者， 應(yīng)該剝離橫結(jié)腸系膜前葉、 胰腺被膜的網(wǎng)膜囊后壁， 爭取做到網(wǎng)膜囊完整切除， 以保證手術(shù)的根治性。 胃癌腹膜轉(zhuǎn)移發(fā)生的途徑和步驟可能為 :1.原發(fā)灶的腫瘤細(xì)胞穿透漿膜，脫落到腹腔 內(nèi)，形成高度生物活性的游離腫瘤細(xì)胞。 2.在一些相關(guān)因子的介導(dǎo)下粘附在腹膜上。 3.在 基質(zhì)消化酶和相關(guān)因子的作用下，腫瘤細(xì)胞向腹膜組織浸潤。 4.腫瘤細(xì)胞不斷增值，形成 種植結(jié)節(jié)。第 4 階段已經(jīng)形成肉眼或影像學(xué)檢查可見的轉(zhuǎn)移，并可由常規(guī)病理檢查確定。 前 3 個階段為微轉(zhuǎn)移階段，肉眼不可見，亦無

13、法用影像學(xué)方法或常規(guī)HE 染色診斷，必須 通過免疫組織化學(xué)或 PCR 等方法檢測腫瘤特異性標(biāo)志物。近年來，組織化學(xué)和分子生物 學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展使得微轉(zhuǎn)移領(lǐng)域也有了較快的發(fā)展;隨著免疫組化和逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈 反應(yīng) (RT-PCR)方法的應(yīng)用越來越趨向于成熟化和規(guī)范化， 微轉(zhuǎn)移檢測領(lǐng)域日益受到重視， 腫瘤微轉(zhuǎn)移的檢測可望成為腫瘤患者的常規(guī)檢查。 雖然取腹腔沖洗液檢查具有操作簡便、花費(fèi)較少等優(yōu)點(diǎn)，但無論是細(xì)胞學(xué)檢查、化學(xué) 發(fā)光酶聯(lián)免疫法或 RT-PCR 技術(shù)，僅僅只是確定游離癌細(xì)胞的存在，這些檢測方法通胃癌 術(shù)中取腹膜組織檢測微轉(zhuǎn)移的研究國內(nèi)外較少報道，是近年來比較新的研究領(lǐng)域。術(shù)中取 材部位有直腸

14、膀膚陷凹 (直腸子宮陷凹 )、橫結(jié)腸系膜、大網(wǎng)膜等，檢測方法主要有免疫組 織化學(xué)方法和 RT-PCR。取腹膜組織檢測胃癌腹膜微轉(zhuǎn)移，其陽性率一般低于取腹腔灌洗 液用同種方法檢測的結(jié)果。這是因?yàn)楦鼓と〔木哂幸欢ǖ木窒扌裕?，但不能確診腹膜微轉(zhuǎn) 移游離的腫瘤細(xì)胞必須經(jīng)過粘附、降解腹膜細(xì)胞外基質(zhì)、著床于腹膜間皮組織并增殖才能 Useful Documents Useful Documents 形成腹膜微轉(zhuǎn)移 .另外脫落的腫瘤細(xì)胞必須經(jīng)過粘附、 浸潤、增值等階段才能形成腹膜微轉(zhuǎn) 移。因此，取腹膜組織檢測可以直觀地證實(shí)腹膜微轉(zhuǎn)移灶的存在。過確定游離癌細(xì)胞的存 在，對腹膜轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)有一定的預(yù)測價值 . 本

15、研究于胃癌根治術(shù)中自橫結(jié)腸系膜前葉、網(wǎng)膜囊后壁近胰腺上緣處、盆底腹膜處取 活，用免疫組化方法檢測細(xì)胞角蛋白 CA20 ，研究胃癌患者腹膜微轉(zhuǎn)移的情況，胃癌根治 手術(shù)經(jīng)過一個多世紀(jì)的發(fā)展已經(jīng)相當(dāng)成熟，近年來在進(jìn)展期胃癌根治術(shù)中，剝離橫結(jié)腸系 膜前葉和胰腺被膜己逐漸成為常規(guī)，并有學(xué)者提出了胃全系膜切除和胃癌根治術(shù)中網(wǎng)膜囊 完整切除的概念，以求達(dá)到根治。胃全系膜切除術(shù)是指完整切除胃腹側(cè)、背側(cè)系膜內(nèi)所有 的組織結(jié)構(gòu)，包括胃及其血管和淋巴脂肪組織。網(wǎng)膜囊完整切除是指將網(wǎng)膜囊的后壁與前 壁及胃 （包括周圍淋巴脂肪組織 ）。但胃周系膜內(nèi)是否存胃癌微轉(zhuǎn)移灶分析腹膜微轉(zhuǎn)移與胃 癌大小、侵透膜與否、腫瘤分期、淋巴

16、結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床因素的關(guān)系，探討胃癌腹膜微轉(zhuǎn)發(fā)生 的因素和微轉(zhuǎn)移的規(guī)律，為手術(shù)方式選擇、判斷預(yù)后及建立個體化的術(shù)后治療方案提供更 可靠的依據(jù)。 鑒于胃癌行淋巴結(jié)清掃一直缺乏較為可靠的理論依據(jù)，且剝離操作易進(jìn)入錯誤分離層 面，造成出血、系膜剝離不全、術(shù)后淋巴漏、胰漏等，故對于進(jìn)展期胃癌是否應(yīng)該行此術(shù) 式值得探討。胃周圍系膜表面上無關(guān)聯(lián)，但在胚胎解剖學(xué)上具有高度的組織同源性。在胚 胎時期，胃腹側(cè)系膜在前腸旋轉(zhuǎn)中形成小網(wǎng)膜， 胃背側(cè)系膜的前后兩層則廣泛覆蓋胃、 脾、 胰腺，衍化成為大網(wǎng)膜、胃脾韌帶、胰腺被膜等。在胚胎時期前腸旋轉(zhuǎn)中，胃周圍系膜與 系膜、系膜與臟器和后腹壁相互靠近并貼在一起發(fā)生融合，形成潛

17、在的，分布廣泛的，充 滿淋巴組織和疏松結(jié)締組織的間隙 l ，容許惡性病變沿其擴(kuò)散、蔓延。胃癌細(xì)胞比較容易 通過脫落種植，淋巴轉(zhuǎn)移等途徑擴(kuò)散到胃周系膜組織內(nèi)。如果能在在胃癌根治術(shù)中對多處 腹膜組織進(jìn)行活檢，行免疫組化染色，檢測 CA20 ，并與常規(guī) HE 染色及 PLC 檢查結(jié)果相 比較。結(jié)果表明，雖然常規(guī) HE 染色檢查并不能發(fā)現(xiàn)，實(shí)際上橫結(jié)腸系膜前葉、胰腺被膜 和胰腺上方的網(wǎng)膜囊后壁等處組織內(nèi)確實(shí)已存在微轉(zhuǎn)移灶，并且微轉(zhuǎn)移發(fā)生概率與腫瘤大 小、侵透漿膜等因素相關(guān)。因此對于進(jìn)展期胃癌，尤其是腫瘤較大、侵透漿膜者，應(yīng)該剝 Useful Documents Useful Documents 離橫結(jié)

18、腸系膜前葉、胰腺被膜和胰腺上方的網(wǎng)膜囊后壁，爭取做到網(wǎng)膜囊完整切除，以保 證手術(shù)的根治性。另外淋巴轉(zhuǎn)移途徑在腹膜微轉(zhuǎn)移中占有一定的地位，胃癌根治術(shù)中必須 嚴(yán)格行 D2 淋巴結(jié)清掃。 、擬采取的研究方法、技術(shù)路線 Useful Documents Useful Documents 選取術(shù)前影像學(xué)檢查及手術(shù)中探查未發(fā)現(xiàn)周圍臟器侵犯（如：肝臟、胰腺、橫結(jié)腸及 其系膜等）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者胃癌腫瘤標(biāo)本?；颊咝g(shù)中為減少腹腔游離癌細(xì)胞和脫落種植 轉(zhuǎn)移，均實(shí)行腹腔高溫灌洗， 術(shù)后進(jìn)行常規(guī)病理學(xué)檢查以及脫落細(xì)胞學(xué)和腹腔灌洗液檢查， 腹腔沖洗液細(xì)胞學(xué)檢查采用轉(zhuǎn)速控制在 1600 轉(zhuǎn)/分的低速離心機(jī)， 上清液去除，

19、沉渣圖片 行瑞氏染色，鏡下觀察。檢測到癌細(xì)胞即為陽性。并去腹膜組織做 HE 染色，標(biāo)本來自橫 結(jié)腸系膜、男性直腸膀胱陷凹（女性為直腸子宮陷凹）以及網(wǎng)膜囊后壁，采用免疫組化的 方法（免疫組化染色采用鏈霉菌抗生物素蛋白一過氧化酶連接 （sP）法）檢查 CA20 ，與腹 腔灌洗液體細(xì)胞學(xué)檢查做對比。 CA20 陽性者，視為轉(zhuǎn)移，所取不同部位的腹膜組織有一 處陽性者即認(rèn)為發(fā)生了腹膜微轉(zhuǎn)移。 CA20 存在于上皮來源的腫瘤之中，表達(dá)于細(xì)胞漿， 以胞漿染為淡黃色到深棕黃色，染色強(qiáng)度明顯高于背景者為陽性。凡無黃色染色且顯色強(qiáng) 度與背景無明顯差別者為陰性 （圖5） 。本試驗(yàn)中若 HE染色陰性，而CA20 陽性者，即視為 該處腹膜組織發(fā)生了微轉(zhuǎn)移。 同一病人所取的橫結(jié)腸系膜前葉、 網(wǎng)膜囊后壁近胰腺上緣處、 直腸膀膚陷凹 （直腸