與耐藥機(jī)制有關(guān)藥敏試驗(yàn)的規(guī)范化.精講

1、與耐藥機(jī)制有關(guān)藥敏試驗(yàn)的規(guī)范化與耐藥機(jī)制有關(guān)的藥敏試驗(yàn)的規(guī)范化操作。 前言，細(xì)菌耐藥已成為一個(gè)全球性的問題，已對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重的威脅。耐藥細(xì)菌 感染導(dǎo)致病人住院時(shí)間延長(zhǎng)、 費(fèi)用增加、 死亡率增高， 同時(shí)也給臨床醫(yī)生抗感染治療帶來困 難。因此， 檢測(cè)細(xì)菌耐藥機(jī)制是當(dāng)今細(xì)菌學(xué)的一個(gè)重要課題， 也是正確指導(dǎo)臨床醫(yī)生合理使 用抗生素的重要依據(jù)。在細(xì)菌耐藥機(jī)制檢測(cè)方面，包括分子生物學(xué)等許多實(shí)驗(yàn)方法被廣泛運(yùn)用。但這些方法 的技術(shù)要求普遍較高，大多數(shù)被用于基礎(chǔ)研究。真正應(yīng)用到臨床微生物實(shí)驗(yàn)室的試驗(yàn)方法， 要求操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，試驗(yàn)成本不能太高。我國(guó)衛(wèi)生部于 1998 年規(guī)定：我國(guó)藥敏試驗(yàn)

2、暫按 CLSI 歷年頒布的所有微生物藥敏試驗(yàn) 文件作為部頒標(biāo)準(zhǔn)，此決定至今未改變。本節(jié)所講內(nèi)容，主要是CLSI( M100-S22)文件推薦的臨床微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)方法。 也是我們從事臨床微生物檢驗(yàn)技術(shù)人員必須掌握的內(nèi) 容。包括兩個(gè)內(nèi)容，第一個(gè)就是革蘭陽(yáng)性球菌耐藥機(jī)制的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)項(xiàng)目。第二個(gè)內(nèi)容是 革蘭氏陰性發(fā)酵細(xì)菌以及其他細(xì)菌的耐藥機(jī)制。首先介紹青霉素酶的檢測(cè)。檢測(cè)青霉素酶的方法有碘量法、酸量法和顯色頭孢菌素法 等，臨床應(yīng)用較多的是顯色頭孢菌素法。其原理是將受菌株與頭孢硝噻吩作用一段時(shí)間后， 如受試菌株產(chǎn)生青霉素酶，則可水解頭孢硝噻吩的 - 內(nèi)酰胺環(huán)，產(chǎn)生由黃色向紅色轉(zhuǎn)變 的顏色反應(yīng)，即為

3、青霉素酶試驗(yàn)陽(yáng)性。頭孢硝噻吩法是目前檢測(cè)嗜血桿菌屬、淋病奈瑟菌、 卡他莫拉菌和葡萄球菌屬產(chǎn)生 - 內(nèi)酰胺酶的最好方法，具有快速、靈敏和簡(jiǎn)便的特點(diǎn)， 但價(jià)格相對(duì)較昂貴。方法，檢測(cè)時(shí)用 1 滴無菌水將 Nitrocefin 紙片濕潤(rùn)，將受試菌直接涂抹于濕潤(rùn)后的 Nitrocefin 紙片上，即可觀察顏色的反應(yīng)，產(chǎn)生紅色者為產(chǎn)酶陽(yáng)性。質(zhì)控菌株，陰性株為 金黃色葡萄球菌 ATCC25923；陽(yáng)性株為金黃色葡萄球菌 ATCC29213。注意事項(xiàng)，目前實(shí)驗(yàn)室 多采用 BD公司生產(chǎn)的非頭孢硝噻吩顯色頭孢菌素紙片，這個(gè)紙片進(jìn)行 - 內(nèi)酰胺酶測(cè)試，效果稍好于頭孢硝噻吩，可降低金黃色葡萄球菌陽(yáng)性結(jié)果的反應(yīng)時(shí)間。葡

4、萄球菌可誘導(dǎo) 內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)。這項(xiàng)內(nèi)容呢是 CLSIM100 S21 。方法，如 果青霉素對(duì)葡萄球菌的 MIC 值小于等于 0.12 每毫升微克的時(shí)候 或者抑菌環(huán)直徑大于等于 29 毫米 的時(shí)候，應(yīng)該對(duì)其進(jìn)行可誘導(dǎo) - 內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)。將待檢菌株傳代到血瓊脂平 板或者是 MHA瓊脂平板上， 用苯唑西林紙片或者是頭孢西丁紙片作為誘導(dǎo)劑， 具體方法可參 照紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)，大氣環(huán)境孵育16 到 18 小時(shí)后，檢測(cè)抑菌圈周邊細(xì)菌的產(chǎn)酶情況?？烧T導(dǎo) - 內(nèi)酰胺酶檢測(cè)陽(yáng)性的菌株，應(yīng)報(bào)告對(duì)不耐酶青霉素耐藥。質(zhì)控菌株，陰性株用 金黃色葡萄球菌 ATCC25923；陽(yáng)性株用金黃色葡萄球菌 ATCC29213

5、。CXIM100 S22 文件中增加了用 10 單位青霉素紙片作為誘導(dǎo)劑檢測(cè)葡萄球菌可誘導(dǎo) 內(nèi)酰胺酶的方法，具體方法同苯唑西林和頭孢西丁紙片法。第二個(gè)內(nèi)容介紹甲氧西林耐藥葡萄球菌，也就是MRS檢測(cè)。 檢測(cè) mecA基因和其表達(dá)的青霉素結(jié)合蛋白 2a ，是預(yù)報(bào)葡萄球菌對(duì)甲氧西林耐藥最準(zhǔn)確的方法， 它也被用于證實(shí)從嚴(yán)重感染病人分離的葡萄球菌紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)結(jié)果。攜帶 mecA 基因或者是產(chǎn) PBP 2a 的 葡萄球菌分離株，應(yīng)報(bào)告對(duì)苯唑西林耐藥。不攜帶mecA或不產(chǎn) PBP 2a 菌株應(yīng)報(bào)告對(duì)苯唑西林敏感。由于罕見的非 mecA基因介導(dǎo)的苯唑西林耐藥機(jī)制，在紙片擴(kuò)散法確定為苯唑西 林耐藥時(shí)， 應(yīng)

6、加測(cè)苯唑西林 MIC，若 MIC值大于等于 4 個(gè)每毫升微克， 即使 mecA基因和 PBP 2a 檢測(cè)為陰性，也應(yīng)報(bào)告苯唑西林耐藥。可用紙片擴(kuò)散法檢測(cè)這些菌株對(duì)頭孢西丁的敏感 性。苯唑西林紙片擴(kuò)散法篩選試驗(yàn)，方法，使用含 1 個(gè)微克的苯唑西林紙片，而不是甲氧 西林或萘夫西林來檢測(cè)金黃色葡萄球菌對(duì)甲氧西林的耐藥性。用直接菌落懸液法制備接種 物，配成 0.5 麥?zhǔn)媳葷釢舛染?，接種 MH瓊脂平板，待瓊脂表面的水份干后，貼苯唑西林 紙片，于 33 至 35度，大氣環(huán)境孵育 24小時(shí)，檢測(cè)抑菌圈直徑。結(jié)果判斷，按CLSI 解釋標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果。 金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑小于等于10個(gè)毫米為耐藥， 大于

7、13 毫米 為敏感。質(zhì)控菌株用金黃色葡萄球菌 ATCC25923。注意事項(xiàng)， 試驗(yàn)溫度超過 35 度不能檢測(cè)出 MRS；孵育時(shí)間不能少于 24 小時(shí)； 在透射光 下仔細(xì)觀察苯唑西林紙片周圍抑菌圈內(nèi)有沒有細(xì)小菌落或者輕微彌漫生長(zhǎng)， 如果有生長(zhǎng)提示 苯唑西林耐藥；如果金黃色葡萄球菌紙片擴(kuò)散法結(jié)果中，結(jié)果為中介時(shí)也就是直徑在11 到12 毫米 時(shí)，或者 MIC 為 0.5 到 2 個(gè)每毫升微克的表皮葡萄球菌以外的其他凝固酶陰性葡 萄球菌引起嚴(yán)重感染時(shí)，必須進(jìn)行 mecA基因或者是 PBP 2a 測(cè)定，或者是頭孢西丁紙片試 驗(yàn)、苯唑西林 MIC試驗(yàn)或者是苯唑西林鹽瓊脂篩選試驗(yàn)， 來確定是否為 MRS菌

8、株， 選擇其中 一種試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行報(bào)告。苯唑西林鹽瓊脂篩選試驗(yàn)，試驗(yàn)用的MH瓊脂中含苯唑西林每毫升 6 個(gè)微克， 并添加有4%的氯化鈉，或者是每毫升 0.68 摩爾。方法，直接菌落懸浮液獲得 0.5 麥?zhǔn)蠁挝粷舛?。進(jìn) 行試驗(yàn)時(shí)， 使用 1微升接種環(huán)蘸取菌液， 在平板上涂成直徑 10到 15 毫米 斑點(diǎn)。替代方法， 用棉拭子蘸菌液涂成類似大小斑點(diǎn)或劃滿四分之一區(qū)域。 將瓊脂平板置 33到 35 度，大氣環(huán) 境孵育 24 小時(shí)后用透射光檢查有無細(xì)菌生長(zhǎng)， 任何生長(zhǎng)都表示對(duì)苯唑西林耐藥。 注意事項(xiàng)， 試驗(yàn)溫度超過 35 度不能檢測(cè)出 MRS；為從凝固酶陰性葡萄球菌中檢測(cè)出甲氧西林耐藥菌株， 需將瓊脂平

9、板孵育 48 小時(shí)。質(zhì)控菌株，敏感株 ATCC29213；耐藥株 ATCC43300。頭孢西丁紙片法。 方法， 應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的紙片擴(kuò)散法試驗(yàn)條件接種MH瓊脂平板， 使用含 30微克頭孢西丁紙片， 33 到 35度大氣環(huán)境孵育。金黃色葡萄球菌和路鄧葡萄球菌孵育16 到18 小時(shí)報(bào)告結(jié)果，凝固酶陰性葡萄球菌除路鄧葡萄球菌以外要孵育24 小時(shí)，如耐藥則在孵育 18 小時(shí)后可報(bào)告結(jié)果。使用反射光閱讀頭孢西丁紙片試驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果判讀，頭孢西丁對(duì) 金黃色葡萄球菌和路鄧葡萄球菌抑菌圈直徑小于等于 21 毫米 時(shí)，應(yīng)報(bào)告對(duì)苯唑西林耐藥， 大于等于 22 毫米 應(yīng)報(bào)告對(duì)苯唑西林敏感。除路鄧葡萄球菌外其他凝固酶陰性葡萄

10、球菌抑 菌圈直徑小于等于 24 毫米 時(shí)，應(yīng)報(bào)告對(duì)苯唑西林耐藥，大于等于 25 毫米 應(yīng)報(bào)告對(duì)苯唑 西林敏感。注意事項(xiàng)，試驗(yàn)溫度超過 35 度不能檢測(cè)出 MRS；檢測(cè)凝固酶陰性葡萄球菌對(duì)苯 唑西林的耐藥性，頭孢西丁紙片試驗(yàn)是首選方法，因?yàn)轭^孢西丁較苯唑西林的敏感性高。mecA基因及 PBP 2a 檢測(cè)，方法，可采用乳膠凝集或分子生物學(xué)等方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié) 果判斷， mecA基因或 PBP2 a 檢測(cè)陽(yáng)性的葡萄球菌分離株，應(yīng)報(bào)告對(duì)苯唑西林和甲氧西林耐 藥。不攜帶 mecA基因或不產(chǎn) PBP 2a 菌株應(yīng)報(bào)告對(duì)苯唑西林和甲氧西林敏感。質(zhì)控菌株， mecA陰性用 ATCC29213； mecA陽(yáng)性用

11、ATCC43300。苯唑西林 MIC 試驗(yàn)方法，可采用瓊脂稀釋法、肉湯稀釋法或Etest 等方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果判讀，若苯唑西林 MIC值大于等于每毫升 4個(gè)微克，即使 mecA基因和 PBP 2a 檢測(cè)為 陰性， 也應(yīng)報(bào)苯唑西林耐藥。 可同時(shí)用紙片擴(kuò)散法檢測(cè)這些菌株對(duì)頭孢西丁的敏感性。 注意 事項(xiàng)，一，試驗(yàn)溫度超過 35 度不能檢測(cè)出 MRS；二，孵育時(shí)間不能少于 24 小時(shí)；三，在透 射光下觀察瓊脂上有無細(xì)小菌落或輕微彌漫生長(zhǎng)， 如果有生長(zhǎng)提示苯唑西林耐藥。 質(zhì)控菌株， 敏感株 ATCC29213；耐藥株 A TCC43300 。MRS的臨床報(bào)告， 對(duì)于甲氧西林耐藥的葡萄球菌即M RS，應(yīng)報(bào)

12、告對(duì)所有 - 內(nèi)酰胺類藥物耐藥， 而不考慮這些藥物的體外試驗(yàn)結(jié)果是否敏感。 因?yàn)榇蠖鄶?shù)文獻(xiàn)報(bào)告了 MRS感染對(duì) - 內(nèi)酰胺類治療反應(yīng)差或者沒有令人信服的臨床數(shù)據(jù)證實(shí)這些藥的臨床效果。萬古霉素耐藥葡萄球菌的篩選試驗(yàn)，一，紙片篩選法；方法，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的紙片擴(kuò)散法 試驗(yàn)條件接種 MH瓊脂平板，使用含 30 微克萬古霉素紙片， 35 度加減 2 度，大氣環(huán)境孵育 24 小時(shí)。結(jié)果判斷， CLSI M100-S19 中已經(jīng)取消了萬古霉素對(duì)葡萄球菌的紙片擴(kuò)散法判斷折 點(diǎn)。紙片擴(kuò)散法只能檢測(cè) VanA 基因型的萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌， 這種菌株無抑菌圈， 應(yīng)確認(rèn)該菌株的鑒定結(jié)果。 對(duì)未測(cè)定萬古霉素 MIC

13、，而萬古霉素抑菌圈直徑大于等于 7 毫米 的葡萄球菌，不能報(bào)告其對(duì)萬古霉素敏感。注意事項(xiàng)，紙片擴(kuò)散法檢測(cè)萬古霉素結(jié)果不可靠。 紙片擴(kuò)散法不能區(qū)分萬古霉素敏感， 也就是 MIC 范圍在 0.5 至 2 個(gè)微克每毫升和萬古霉素敏感性減低的菌株， 也就是 MIC值在 4 到 8 每毫升微克。萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌MIC 大于 16 每毫升微克，在萬古霉素紙片周圍僅見輕微生長(zhǎng)。因此，用含每毫升 6 個(gè)微克萬古霉素的 BHI 瓊脂平板篩選平板，可提 高檢測(cè)萬古霉素中介和萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌的敏感性。瓊脂篩選法，用含每毫升 6 個(gè)微克萬古霉素腦心浸液瓊脂對(duì)耐萬古霉素金黃色葡萄球 菌進(jìn)行篩選試驗(yàn)。

14、方法，直接菌落懸液獲得 0.5 麥?zhǔn)蠞岫?，使用微量吸管吸取菌?10 個(gè)微 升，點(diǎn)種瓊脂平板表面。替代方法，用棉拭子蘸菌液，擠去多余的菌液，在平板上涂成直徑 10 到 15 毫米 斑點(diǎn)或在部分區(qū)域劃線接種， 35加減 2 度，大氣環(huán)境孵育 24小時(shí)，觀察結(jié) 果。結(jié)果判斷， 在透射光下仔細(xì)觀察，如果點(diǎn)種位置出現(xiàn) 1 個(gè)以上菌落，推測(cè)菌株對(duì)萬古霉 素敏感性減低。 注意事項(xiàng)， 用含每毫升 6 個(gè)微克萬古霉素 BHI 瓊脂篩選平板， 可提高檢測(cè)萬 古霉素耐藥金黃色葡萄球菌的敏感性。 但瓊脂篩選法不能可靠檢測(cè) VISA，這是葡萄球菌對(duì) 萬古霉素中介的菌株， MIC值等于 4 個(gè)每毫升微克菌株不生長(zhǎng)。質(zhì)控

15、，敏感株ATCC29212；耐藥株 ATCC51299。萬古霉素 MIC 確認(rèn)試驗(yàn)。方法，可采用瓊脂或肉湯稀釋法或Etest 等方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果判斷，金黃色葡萄球菌 MIC值小于等于每毫升 2個(gè)微克為敏感， MIC值在 4到8每毫升 微克為敏感性降低， MIC 值大于 16 每毫升微克為耐藥；凝固酶陰性葡萄球菌MIC 值小于等于每毫升 4個(gè)微克為敏感， MIC值在 4到 16每毫升微克為敏感性降低， MIC值大于等于 32 每毫升微克為耐藥。 注意事項(xiàng)， 檢測(cè)到萬古霉素 MIC值大于等于每毫升 8 個(gè)微克的金黃色葡 萄球菌，或者是 MIC 值大于等于每毫升 32 微克的凝固酶陰性葡萄球菌，應(yīng)

16、送參考實(shí)驗(yàn)室進(jìn) 一步確認(rèn)。誘導(dǎo)性克林霉素耐藥試驗(yàn)檢測(cè)，耐藥機(jī)制， 對(duì)大環(huán)內(nèi)酯耐藥的葡萄球菌或者是- 溶血鏈球菌，可能存在有結(jié)構(gòu)性或者是誘導(dǎo)性對(duì)克林霉素的耐藥，或者只對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類耐藥。檢測(cè)方法，誘導(dǎo)克林霉素耐藥試驗(yàn)又稱“D”抑菌環(huán)試驗(yàn)。配養(yǎng)基，用 MH 瓊脂，加或不加 5%的綿羊血。接種物，直接菌懸液法，相當(dāng)于0.5 麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)濃度。孵育， 35 度加減 2度，大氣環(huán)境 16 到 18 小時(shí)。方法，貼紅霉素紙片和克林霉素紙片，紙片間距離 15 至 26 毫米。結(jié)果判斷，若靠近紅霉素紙片一側(cè)克林霉素的抑菌環(huán)出現(xiàn)“截平”現(xiàn)象，也就是稱為 “D”抑菌環(huán)，則菌株存在克林霉素誘導(dǎo)耐藥，應(yīng)報(bào)告對(duì)“克林霉素耐藥

17、”。在報(bào)告單中可 注明“經(jīng)誘導(dǎo)克林霉素耐藥試驗(yàn)推測(cè)此菌株對(duì)克林霉素耐藥， 在某些病人中克林霉素可能仍 有效”。若無“截平”現(xiàn)象，則應(yīng)報(bào)告菌株對(duì)克林霉素敏感。質(zhì)控菌株，陰性對(duì)照，金黃色葡萄球菌 ATCC 25923 或者是金黃色葡萄球菌 ATCC BAA-976。陽(yáng)性對(duì)照，金黃色葡萄球菌 ATCC BAA-977 。金黃色葡萄球菌，高水平莫匹羅星耐藥性檢測(cè)。紙片擴(kuò)散法，方法，用標(biāo)準(zhǔn)的紙片擴(kuò) 散法試驗(yàn)條件接種 MH瓊脂平板，使用含 200 微克莫匹羅星紙片， 35度加減 2 度，大氣環(huán)境 孵育 24 小時(shí)。在透射光下仔細(xì)觀察紙片周圍抑菌圈內(nèi)有無細(xì)小菌落或輕微彌漫生長(zhǎng)，如果 有生長(zhǎng)提示莫匹羅星耐藥。

18、結(jié)果判讀，無抑菌圈等于高水平莫匹羅星耐藥； 有抑菌圈等于 非高水平莫匹羅星耐藥。質(zhì)控菌株， ATCC25923莫匹羅星抑菌圈直徑在 29 至 38 毫米； ATCC BAA1708無抑菌圈。肉湯微量稀釋法，用調(diào)節(jié)陽(yáng)離子 M-H 肉湯配成單一的莫匹羅星，也就是每毫升256 微克試驗(yàn)孔。方法，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的肉湯微量稀釋法試驗(yàn)條件進(jìn)行接種，在 35 加減 2度，大氣環(huán) 境孵育 24 小時(shí)。結(jié)果判讀，在透射光下進(jìn)行判讀。如果有生長(zhǎng)等于高水平莫匹羅星耐藥； 無生長(zhǎng)等于非高水平莫匹羅星耐藥。質(zhì)控菌株ATCC 29213， MIC 值應(yīng)該在 0.06 至 0.5 每毫升微克； ATCC 29212 MIC 值應(yīng)

19、該在 16 到 128 每毫升微克； ATCC BAA1708應(yīng)該在 256 每 毫升微克生長(zhǎng)。解釋，盡管 CLSI M100-S22 中未提供莫匹羅星的折點(diǎn)，但紙片擴(kuò)散法和 MIC 篩選試驗(yàn)?zāi)茏R(shí)別出莫匹羅星 MIC值大于 512 每毫升微克的菌株即高水平耐藥株。腸球菌對(duì)青霉素或者氨芐西林耐藥性檢測(cè)。腸球菌對(duì)青霉素和氨芐西林耐藥是因?yàn)楫a(chǎn) 生了低親和力的青霉素結(jié)合蛋白，個(gè)別菌株是產(chǎn)生 - 內(nèi)酰胺酶。紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)可準(zhǔn)確測(cè)定 PBP改變的菌株，但對(duì)產(chǎn) - 內(nèi)酰胺酶的菌株結(jié)果不可靠。此類菌株應(yīng)檢測(cè)-內(nèi)酰胺酶。高水平氨基糖苷類耐藥腸球菌的檢測(cè)。 方法，用高濃度慶大霉素也就是每片 120 微克， 或

20、者是鏈霉素每片 300 微克紙片可以篩選出此類耐藥性。 結(jié)果判斷， 無抑菌圈為耐藥， 抑菌 圈直徑大于等于 10 毫米 時(shí)表示為非高水平耐藥。 抑菌圈直徑在 7 到 9 毫米 的菌株應(yīng)使用 稀釋篩選試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。 對(duì)于慶大霉素， 稀釋法的 MIC值大于每毫升 500 微克即為耐藥。 對(duì) 于鏈霉素，微量肉湯稀釋法的 MIC值大于每毫升 1000 微克，瓊脂稀釋法的 MIC值大于每毫 升 2000 微克，即為耐藥。HLAR的臨床意義：對(duì)高濃度氨基糖苷類敏感，表示氨基糖苷類與作用于細(xì)胞壁的抗菌 藥物聯(lián)合用藥時(shí)對(duì)該腸球菌菌株將具有協(xié)同作用，也是敏感的。對(duì)氨基糖苷類高水平耐藥， 表示當(dāng)青霉素或糖肽類與一

21、種氨基糖苷類抗生素聯(lián)合用藥時(shí)對(duì)該腸球菌菌株不會(huì)產(chǎn)生協(xié)同 效果。萬古霉素耐藥腸球菌的檢測(cè)。要想使用紙片擴(kuò)散法準(zhǔn)確檢測(cè)出耐萬古霉素腸球菌，需 要將平板孵育滿 24小時(shí)而不是 16到 18小時(shí), 借透射光仔細(xì)檢查抑菌圈內(nèi)有無細(xì)小菌落或彌漫生長(zhǎng)。紙片擴(kuò)散法結(jié)果為中介度也就是在8 到 16 毫米 時(shí)應(yīng)選 MIC 值?？刹捎铆傊♂尫?、肉湯稀釋法或 Etest 等方法進(jìn)行 MIC 值的檢測(cè)。篩選試驗(yàn)，用每毫升 6個(gè)微克萬古霉素的腦心浸液瓊脂篩選試驗(yàn)，35 加減 2度，大氣環(huán)境孵育 24 小時(shí)，點(diǎn)種位置出現(xiàn) 1 個(gè)以上菌落，推測(cè)菌株對(duì)萬古霉素敏感性減低。青霉素耐藥肺炎鏈球菌的檢測(cè)。一，肺炎鏈球菌的耐藥機(jī)制，

22、青霉素耐藥肺炎鏈球菌 的耐藥機(jī)制是肺炎鏈球菌有 6 種青霉素結(jié)合蛋白發(fā)生改變， 改變后使 PBP 與青霉素的結(jié)合力 下降，因而導(dǎo)致耐藥。二，紙片擴(kuò)散法檢測(cè)。方法，使用含 1 個(gè)微克的苯唑西林紙片而不是青霉素紙片，來 檢測(cè)肺炎鏈球菌對(duì)青霉素的耐藥性。培養(yǎng)基用 MH 瓊脂加 5%綿羊血。接種物，使用綿羊血 瓊脂平板上過夜生長(zhǎng)的菌落制備接種物， 采用直接菌落懸液法， 相當(dāng)于 0.5 麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)。 孵育， 35加減 2度，在 5%二氧化碳環(huán)境，孵育 20到 24小時(shí)。結(jié)果判讀，苯唑西林大于等于 20 毫米 對(duì)青霉素敏感，苯唑西林小于等于 19 毫米 時(shí)，應(yīng)測(cè)定青霉素、頭孢噻肟、頭孢曲松 和美羅培南的 M

23、IC值。質(zhì)控菌株用肺炎鏈球菌 ATCC 49619 。結(jié)果報(bào)告，當(dāng)苯唑西林抑菌圈大于等于 20 毫米 時(shí)可報(bào)告肺炎球菌對(duì)青霉素敏感，并 同時(shí)可報(bào)告氨芐西林、阿莫西林、阿莫西林加克拉維酸、頭孢克羅、頭孢地尼、頭孢吡肟、 頭孢他美、頭孢克肟、頭孢噻肟、頭孢丙烯、頭孢曲松、頭孢呋辛、頭孢泊肟、頭孢唑肟、 亞胺培南、 氯碳頭孢和美羅培南敏感， 而不需要再檢測(cè)這些藥物的敏感性。 當(dāng)苯唑西林的抑 菌圈直徑小于等于 19 毫米 的菌株應(yīng)當(dāng)檢測(cè)青霉素、 頭孢噻肟或頭孢曲松及美羅培南的 MIC 值，因?yàn)橐志h(huán)直徑小于等于 19 毫米 時(shí)，可以發(fā)生在青霉素耐藥、中介或敏感的某些菌 株中，不能僅僅根據(jù)苯唑西林的抑菌

24、環(huán)直徑小于等于 19 毫米 ，就報(bào)告對(duì)青霉素耐藥或中 介。肉湯稀釋法檢測(cè)。 方法， 用加 2%到 5%融血馬血的調(diào)節(jié)陽(yáng)離子 M-H肉湯做肺炎鏈球菌的 稀釋法藥敏試驗(yàn)， 35 加減 2 度，大氣環(huán)境孵育 20 到 24 小時(shí)，瓊脂稀釋法應(yīng)放在二氧化碳 環(huán)境下孵育。結(jié)果判讀，一，口服青霉素V，青霉素 MIC 值小于等于 0.06 每毫升微克時(shí)為敏感， MIC 值大于等于每毫升 2 個(gè)微克為耐藥。二，青霉素注射液，腦脊液分離株，青霉 素 MIC 值小于等于 0.06 每毫升微克為敏感， MIC 值大于等于 0.12 每毫升微克為耐藥。非 腦脊液分離株，青霉素 MIC 值小于等于每毫升 2 個(gè)微克為敏

25、感， MIC值大于等于每毫升 8 個(gè) 微克為耐藥。質(zhì)控菌株，肺炎鏈球菌ATCC 49619。第二部分， - 內(nèi)酰胺酶介導(dǎo)的革蘭陰性發(fā)酵細(xì)菌的耐藥機(jī)制檢測(cè)。 革蘭陰性發(fā)酵細(xì) 菌對(duì) - 內(nèi)酰胺類抗生素的主要耐藥機(jī)制，一，產(chǎn)生- 內(nèi)酰胺酶水解滅活藥物； 二， 細(xì)菌外膜通透性下降； 三， 主動(dòng)泵出藥物。 其中產(chǎn)生 - 內(nèi)酰胺酶是革蘭陰性發(fā)酵細(xì)菌對(duì) - 內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的主要原因。臨床上重要的 - 內(nèi)酰胺酶有以下幾種：一，超廣譜- 內(nèi)酰胺酶，也就是 ESB L ；二，頭孢菌素酶，也就是 AmpC酶；三，碳青霉烯酶，主要包括 KPC酶。超廣譜 - 內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)。 CLSI 根據(jù) PK-PD性能評(píng)價(jià)和有

26、限的臨床資料，首次于 2010 年 1月也就是 CLSI M100-S20 文件修訂了頭孢菌素和氨曲南的解釋標(biāo)準(zhǔn)。因此，在使 用新修訂的解釋標(biāo)準(zhǔn)時(shí)不需要常規(guī)檢測(cè)ESBL，除非是在使用舊的解釋標(biāo)準(zhǔn)或者是為了流行病學(xué)調(diào)查以及感染控制的目的仍需要檢測(cè)ESBL。初篩試驗(yàn)，按常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)呢紙片擴(kuò)散法進(jìn)行操作對(duì)肺炎克雷伯菌、產(chǎn)酸克雷伯菌和大 腸埃希菌， 如果下列紙片抑菌圈直徑， 提示菌株可能產(chǎn)生 ESBL 。對(duì)奇異變形桿菌抑菌圈直 徑和上述菌有所不同。按常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)肉湯稀釋法進(jìn)行操作。大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和產(chǎn)酸克雷伯菌判斷 標(biāo)準(zhǔn)：頭孢他啶、氨曲南、頭孢曲松或頭孢噻肟任何一種藥物對(duì)的 MIC 值大于等于每毫

27、升 2 個(gè)微克，頭孢泊肟 MIC 值大于每毫升 8 個(gè)微克，提示菌株可能產(chǎn)生 ESBL 。奇異變形桿菌 判斷標(biāo)準(zhǔn)： 頭孢泊肟、 頭孢他啶或頭孢噻肟 MIC值大于每毫升 2個(gè)微克， 提示菌株可能產(chǎn)生 ESBL。雙紙片協(xié)同法。按照常規(guī)的紙片擴(kuò)散法在MH瓊脂上涂布好受試菌，先在瓊脂平板中心貼上阿莫西林加克拉維酸紙片， 然后在其上下左右貼上頭孢他啶、 頭孢曲松、 頭孢噻肟和氨 曲南紙片， 各紙片中心距復(fù)合紙片中心距離為 20 到 30 毫米 ，35 加減 2 度，大氣環(huán)境孵育 16 到 18 小時(shí)。結(jié)果解釋，如周圍 4 個(gè)藥物紙片，其中任何一個(gè)抑菌圈在靠近復(fù)合劑紙片一 側(cè)的邊緣出現(xiàn)擴(kuò)大或加強(qiáng)，說明該菌

28、株產(chǎn)ESBL。擴(kuò)散法質(zhì)控， ESBL陰性質(zhì)控用大腸埃希菌 ATCC 25922。ESBL陽(yáng)性質(zhì)控肺炎克雷伯菌 ATCC 700603。微量肉湯稀釋法初篩試驗(yàn)。方法用調(diào)節(jié)陽(yáng)離子M-H肉湯，大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和產(chǎn)酸克雷伯菌選用， 頭孢他啶每毫升 1 個(gè)微克， 氨曲南每毫升 1 個(gè)微克， 頭孢曲松每毫升 1 個(gè)微克或頭孢噻肟每毫升 1 個(gè)微克。 奇異變形桿菌選用頭孢泊肟每毫升1 個(gè)微克或頭孢他啶每毫升 1個(gè)微克或頭孢噻肟每毫升 1個(gè)微克。 35加減 2度，大氣環(huán)境孵育 16到20小時(shí)。 結(jié)果判斷如果生長(zhǎng)提示菌株產(chǎn) ESBL。注意事項(xiàng)，使用一種以上的藥物進(jìn)行檢測(cè)可提高檢測(cè) 的敏感性。質(zhì)控菌株，

29、ATCC 25922不太明顯；肺炎克雷伯菌 ATCC 700603的生長(zhǎng)平等。ESBL表型確證試驗(yàn)。 紙片擴(kuò)散法， 使用每片含 30 微克的頭孢他啶、 頭孢噻肟和頭孢他 啶加克拉維酸、 頭孢噻肟加克拉維酸的復(fù)合劑紙片進(jìn)行試驗(yàn)， 當(dāng)任何一種復(fù)合紙片抑菌圈直 徑大于或等于其單獨(dú)藥敏紙片抑菌圈直徑 5 毫米 ，可確認(rèn)該菌株產(chǎn) ESBL。質(zhì)控菌株大腸埃 希菌 ATCC 25922小于等于 2 個(gè)毫米，肺炎克雷伯菌 ATCC 700603，頭孢他啶加克拉維酸大 于等于 5 毫米 ，頭孢噻肟加克拉維酸大于等于 3 毫米 。表型確認(rèn)試驗(yàn)。瓊脂稀釋法：使用頭孢他啶 MIC 范圍在 0.25 到 128 每毫升

30、微克、頭 孢他啶加克拉維酸范圍在 0.25 到4，128到4每毫升微克、 頭孢噻肟和頭孢噻肟加克拉維酸 進(jìn)行 MIC測(cè)試，當(dāng)與克拉維酸聯(lián)合用藥， MIC小于或等于單獨(dú)用藥藥物 MIC 3 個(gè)倍比稀釋度， 也就是 8 倍濃度，可確認(rèn)該菌株產(chǎn) ESBL。稀釋法質(zhì)控， ESBL陰性質(zhì)控，大腸埃希菌 ATCC25922； ESBL陽(yáng)性質(zhì)控，肺炎克雷伯菌 ATCC700603。頭孢菌素酶檢測(cè)，對(duì)于頭孢菌素酶， CLSI 酶目前還沒有可供推薦的方法進(jìn)行檢測(cè)，也 沒有相應(yīng)的判斷標(biāo)準(zhǔn)。目前用于頭孢菌素酶定性的檢測(cè)方法很多， 主要有以下幾種。一，單 紙片擴(kuò)散法；二，雙紙片協(xié)同法；三，雙紙片增效試驗(yàn)；四，三維試驗(yàn)

31、法。碳青霉烯酶的測(cè)定。碳青霉烯酶定義，指所有能水解亞胺培南或美羅培南等碳青霉烯 類抗生素的一類 內(nèi)酰胺酶， 分別屬于 Ambler 分類 A 類、B 類、D類酶， 包括 KPC 內(nèi) 酰胺酶和金屬酶。 CL SI 目前還沒有可提供推薦用于臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)金屬酶的方法，但是2009年的 CLSI M100-S19文件中增加了對(duì) KPC 內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)方法， 即改良的三維方法， 即改良的測(cè)序試驗(yàn)。KPC酶檢測(cè)。 2001 年首次報(bào)道從肺炎克雷伯中分離到KPC-1，它屬于 Bush 分類法中的類 2f 組， Ambler 分子分類中的屬于 A類, 克拉維酸對(duì)其活性有抑制作用。 KPC 內(nèi)酰 胺酶目前已有

32、 10 種亞型，包括 KPC-1 至 KPC-10，他們之間只有個(gè)別氨基酸發(fā)生了突變。在 多個(gè)菌屬中都有報(bào)道。 主要為質(zhì)粒介導(dǎo)， 但在陰溝腸桿菌中可由染色體介導(dǎo)。 國(guó)外報(bào)道， 產(chǎn) KPC 內(nèi)酰胺酶菌株即可表現(xiàn)為對(duì)碳?xì)涿瓜╊惪股啬退帲部杀憩F(xiàn)為中介或敏感，并存 在接種效應(yīng)，這就增加了對(duì)其識(shí)別的難度。用于 KPC酶定性的檢測(cè)方法主要有以下幾種：一，3- 氨基苯硼酸雙紙片協(xié)同及增效試驗(yàn)；二，改良三維試驗(yàn)法；三，分子生物學(xué)方法。紙片篩選法，選用厄他培南、美羅培南，亞胺培南不作為碳青霉烯酶篩選用藥物。一，3- 氨基苯硼酸雙紙片協(xié)同及增效試驗(yàn)。方法，將 0.5 麥?zhǔn)蠁挝坏臐舛却龣z菌液涂 抹于 MH瓊脂平板上，瓊脂稍干后，把含每片600 微克的 3-氨基苯硼酸紙片貼于 MH平板中間，于紙片周圍分別貼上含厄他培南和美羅培南紙片，紙片中心距離為 20 毫米 ，置 35 加 減 2 度， 大氣環(huán)境孵育 16 到 18 小時(shí)，有協(xié)同現(xiàn)象出現(xiàn)為 MBL陽(yáng)性。改良的 Hodge 試驗(yàn)。改良 Hodge 試驗(yàn)是碳青霉烯酶表型檢測(cè)方法，用于檢測(cè)K