體外細(xì)胞培養(yǎng)

1、第一講體外細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)體外細(xì)胞培養(yǎng)條件和基本技術(shù)體外細(xì)胞培養(yǎng)體外培養(yǎng)物的生長(zhǎng)生物學(xué)細(xì)胞系和細(xì)胞株培養(yǎng)物的冷凍與復(fù)蘇培養(yǎng)物的污染、檢測(cè)和排除一、體外細(xì)胞培養(yǎng)條件和基本技術(shù)體外細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境，方便施加實(shí)驗(yàn)因素，便于觀測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，便于獲得均一細(xì)胞群，能夠進(jìn)行大規(guī)模生物制品的生產(chǎn)。體外細(xì)胞培養(yǎng)不足之處：培養(yǎng)對(duì)象脫離了機(jī)體的整體支配和調(diào)控，細(xì)胞間在一定程 度上失去組織聯(lián)系及相互作用。體外培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)發(fā)育情況與在體時(shí)的情況存 在一定差異，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)必須考慮這種差異。一、體外細(xì)胞培養(yǎng)條件（一）、體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室1. 準(zhǔn)備室2. 培養(yǎng)室：基本條件要求：清潔、無(wú)菌、干燥、不

2、通風(fēng)，并具有適宜的光線?？?氣調(diào)節(jié)用中央空調(diào)或分體式空調(diào)機(jī)。室頂安裝紫外燈等消毒裝置。3. 緩沖室4.其他實(shí)驗(yàn)室（二）、體外培養(yǎng)的設(shè)備和器具設(shè)備：1.超靜工作臺(tái)，生物安全柜，凈化室2.培養(yǎng)箱：溫度，濕度，pH值3. 倒置顯微鏡4.水凈化裝置：去離子水凈化裝置，石英玻璃蒸餾器，超純水裝置5.冰箱6.離心機(jī)7.冷凍保存裝置8.高壓蒸汽消毒裝置：電熱干燥箱，pH計(jì)，天平培養(yǎng)器具：1.過(guò)濾除菌裝置：Zeiss濾器，抽濾式玻璃簡(jiǎn)易型濾器，針頭式加壓塑料小濾器2. 培養(yǎng)器皿：（1）溶液瓶（2）培養(yǎng)瓶（3）培養(yǎng)皿（4）多孔培養(yǎng)板（5）離心管3. 移液器4篩網(wǎng)：金屬篩網(wǎng)（不銹鋼網(wǎng)、銅網(wǎng)），尼龍篩網(wǎng)（三）培養(yǎng)用

3、液?水和平衡鹽溶液（balaneed salt solution, BSS）水：離子交換水，蒸餾水 平衡鹽溶液：主要成分：無(wú)機(jī)鹽和葡萄糖常用 BSS:PBS ， Rin ger Earle ， D-Ha nks， Hanks? 培養(yǎng)液：1.天然培養(yǎng)液：1）血清： 小牛血清,胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）,馬血清，2）水解乳蛋白，3）胚胎滲出液2. 合成培養(yǎng)液：合成培養(yǎng)基的種類 MEM，RPMI 1640，McCoy 5A，HAM F12等3. 無(wú)血清培養(yǎng)基：干粉型培養(yǎng)基的配制：1）.制備高質(zhì)量的去離子水（玻璃三蒸餾水）或超純水2).加溫水至15-30E之間3).加干粉

4、入水中，攪拌令之溶解4).加NaHC035).加水至最終量6).必要時(shí)用1N HCl或1N NaOH調(diào)節(jié)pH，因?yàn)V過(guò)時(shí)pH 可能受影響7).用0.22um或小于此微孔濾膜濾過(guò)消毒?其他用液：消化液等1消化液：胰蛋白酶、EDTA溶液 2.pH調(diào)整液：NaHCO3溶液、HEPES溶液3.抗生素液：青鏈霉素常用的生長(zhǎng)培養(yǎng)液：基本培養(yǎng)基80-90%血清(多用小牛血清)10-20 %抗生素(多用青霉素100單位/毫升和鏈霉素100微克/毫升一、細(xì)胞體外培養(yǎng)的其它條件一) 、無(wú)污染的氣、液相環(huán)境：1、O2 ( 5%CO2 + 95%空氣，O2:21%)2、CO2- pH3、液相環(huán)境-滲透壓二) 、溫度三)

5、 、生長(zhǎng)基質(zhì)1、多聚賴氨酸：0.05mg/ml2、纖維連接蛋白：1mg/ml3、膠原：13mg/ml4、層粘連蛋白： 510g/ml一、清洗和消毒1.1玻璃器皿的清洗：浸泡一刷洗一酸浸一沖洗浸酸液：強(qiáng)液：63克重鉻酸鉀，1000毫升濃硫酸，200毫升蒸餾水。次強(qiáng)液：120克重鉻酸鉀，200毫升濃硫酸，1000毫升蒸餾水。 弱液：100克重鉻酸鉀，100毫升濃硫酸，1000毫升蒸餾水。膠塞清洗：膠塞入水中浸泡一 2 % Na0H煮沸10-20分鐘一自來(lái)水沖洗一1 %稀鹽酸浸泡30分鐘一自來(lái)水沖洗和蒸餾水漂洗 2-3次，晾干備用1.2塑料器皿的清洗：2. 包裝：局部包裝；全包裝3. 消毒：紫外線，

6、干熱消毒，濕熱消毒，濾過(guò)消毒，射線消毒，消毒劑的使用二、體外細(xì)胞培養(yǎng)體外細(xì)胞培養(yǎng)類型：原代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)一) 、基本流程：1 mm3的植塊植塊培養(yǎng)原代培養(yǎng)：/動(dòng)物器官或大組織塊一洗去血污一剔除多余成分/組織剪碎蛋白酶消化機(jī)械吹打銅網(wǎng)過(guò)濾離心一細(xì)胞懸液一調(diào)整細(xì)胞數(shù)一分離細(xì)胞培養(yǎng)二) 、實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)：1、 常用實(shí)驗(yàn)材料的取材：胚胎、組織、人體手術(shù)或活檢材料2、分散細(xì)胞的方法：1).機(jī)械解離細(xì)胞法：吸管吹打法，過(guò)篩法,單細(xì)胞分離器2 ).蛋白酶學(xué)處理法：胰蛋白酶，膠原酶3 ).螯合劑解離細(xì)胞法：EDTA ,檸檬酸鈉3、接種和培養(yǎng)過(guò)程:1).植塊培養(yǎng)：接種與培養(yǎng)：優(yōu)點(diǎn)：比較簡(jiǎn)單，保留了在體時(shí)細(xì)胞間的相互作

7、用，因而在體外培養(yǎng)時(shí)，植塊內(nèi)細(xì)胞容易存活和生長(zhǎng)。2）.分散細(xì)胞培養(yǎng)：操作過(guò)程：優(yōu)點(diǎn)：解除了植塊內(nèi)部細(xì)胞間的組織關(guān)系，從而可以反映出單個(gè)細(xì)胞的生物學(xué)特征?？蓪?shí)現(xiàn)對(duì)單一細(xì)胞類型進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)研究。4、討論和注意事項(xiàng)相對(duì)于植塊內(nèi)的細(xì)胞，分離散細(xì)胞在體外更難以存活和生長(zhǎng)。對(duì)于大多數(shù)貼壁依賴型細(xì)胞來(lái)說(shuō)，如何盡快讓接種的細(xì)胞貼壁，是 決定培養(yǎng)物生長(zhǎng)快慢的關(guān)鍵步驟。可選用生長(zhǎng)基質(zhì)表面；降低浮力。細(xì)胞密度：105個(gè)/ml左右，對(duì)大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞是比較適中的。三）、原代細(xì)胞培養(yǎng)的注意事項(xiàng)1、 培養(yǎng)液：培養(yǎng)基的選擇，添加劑，培養(yǎng)液的酸堿度，換液。2、 培養(yǎng)的空間：通常培養(yǎng)液與液面上空間的體積比以 1:10為宜。一、

8、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標(biāo)：繼代培養(yǎng)1、植塊培養(yǎng);2、分離細(xì)胞培養(yǎng)物；3、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物二、傳代的過(guò)程1、主要材料：（1）蛋白酶消化液；（2）培養(yǎng)器皿；（3）培養(yǎng)液及平衡鹽溶液2、方法:（1）貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物的傳代：吸去舊培養(yǎng)液-PBS或D-Hanks洗一酶消化解離細(xì)胞一終止消化- 吹打培養(yǎng)器皿底部收集細(xì)胞、洗滌、調(diào)整細(xì)胞數(shù)接種（2）懸浮培養(yǎng)物的傳代：培養(yǎng)物移入離心管離心、去上清培養(yǎng)液重懸接種培養(yǎng)皿補(bǔ)加培養(yǎng)液三、傳代培養(yǎng)的注意事項(xiàng)1、傳代的時(shí)機(jī)與再培養(yǎng)的細(xì)胞密度2、傳代數(shù)與培養(yǎng)物的生長(zhǎng)三、體外培養(yǎng)物的生長(zhǎng)生物學(xué)一、培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖原代培養(yǎng)期：細(xì)胞性狀與體內(nèi)原組織相似性大，異質(zhì)性。傳代培養(yǎng)期

9、：細(xì)胞增殖旺盛（潛伏期、指數(shù)生長(zhǎng)期、停滯期），逐漸趨向同質(zhì)化，正常細(xì)胞約可傳30-50代，應(yīng)及早凍存。衰退期：細(xì)胞增殖減慢，直至死亡。二、體外細(xì)胞培養(yǎng)物的生長(zhǎng)類型:（黏附型細(xì)胞；懸浮型細(xì)胞）1、黏附型細(xì)胞1）多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長(zhǎng)，屬貼壁依賴性細(xì)胞。2）體內(nèi)：粘附全方位，外形具有復(fù)雜的立體特征。體外：多數(shù)情況，細(xì)胞只有一個(gè)附著平面，外形一般與體內(nèi)時(shí)明顯不同。成纖維細(xì)胞型：梭形、長(zhǎng)條形或不規(guī)則多角形，胞體一般鋪展很開，成群細(xì)胞呈現(xiàn) 放射狀、旋渦狀等走行形式。起源于中胚層的細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)一般表現(xiàn)為此型，如成纖維細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、骨與軟骨細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞等。上皮細(xì)胞型： 扁平、多角形，細(xì)胞間相互銜

10、接或呈鑲嵌狀緊密排列， 呈“鋪路石樣 ”， 形成單層膜。起源于內(nèi)、外胚層的細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)可能呈現(xiàn)此型， 如皮膚表皮及其 衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等。游走細(xì)胞型： 細(xì)胞相互分散， 一般不形成集落； 在器皿壁上生長(zhǎng)位置不固定， 經(jīng) 常處于較活躍的變形和游走狀態(tài)，因此外形不規(guī)則且不斷變化。主要是具有吞噬作用的單核巨噬細(xì)胞細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞， 如顆粒性白細(xì) 胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及某些腫瘤細(xì)胞。多形細(xì)胞型： 形態(tài)不規(guī)則， 一般分為胞體和胞突兩部分。 胞突為細(xì)長(zhǎng)形， 似絲狀 偽足。胞體雖略呈多角形。主要是神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞2、 懸浮型細(xì)胞 細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)不粘附于支持物上， 而是呈懸浮生

11、長(zhǎng)狀態(tài)， 如某些癌細(xì)胞和 血液白細(xì)胞。細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)時(shí)胞體為圓形。適于大量繁殖。三、培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況觀察一) 常規(guī)觀察1 培養(yǎng)液：顏色、透明度等；2 細(xì)胞生長(zhǎng)概況及形態(tài)變化：細(xì)胞輪廓、折光性、胞內(nèi)顆粒等； 3 微生物污染狀況：二) 細(xì)胞生長(zhǎng)狀況觀察1. 細(xì)胞計(jì)數(shù)： 細(xì)胞計(jì)數(shù)儀；細(xì)胞計(jì)數(shù)板 制備細(xì)胞懸液，稀釋成合適的濃度； 加至細(xì)胞計(jì)數(shù)板中央凹槽處，顯微鏡下計(jì)算四角大方格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)； 按照公式計(jì)算懸液中細(xì)胞密度。2. 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線是衡量細(xì)胞增殖快慢的重要指標(biāo)。細(xì)胞計(jì)數(shù)法：MTT (CCK-8 )法潛伏期： 細(xì)胞有生長(zhǎng)話動(dòng)而無(wú)細(xì)胞分裂。潛伏期一般為 624小時(shí)。 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期： 細(xì)胞數(shù)

12、隨時(shí)間成倍增長(zhǎng)， 活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。 停止期(平臺(tái)期)： 細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁后，雖有活力但基本不再分裂。3. 細(xì)胞分裂指數(shù)( mitotic index, MI ) 培養(yǎng)物中分裂相數(shù)量占全部細(xì)胞數(shù)量的百分比，統(tǒng)計(jì)時(shí)，每瓶至少需計(jì)數(shù) 1000個(gè)細(xì)胞。一般細(xì)胞的 MI 約為 0.10.5%。原代培養(yǎng)物的 MI 比繼代培養(yǎng)物低。連續(xù)細(xì)胞 系和腫瘤細(xì)胞高，可達(dá) 3% 5%。4. 細(xì)胞周期流式細(xì)胞儀測(cè)定；同位素標(biāo)記測(cè)定： 3H-TdR 摻入法細(xì)胞群體倍增時(shí)間：培養(yǎng)物中細(xì)胞數(shù)量翻倍的平均時(shí)間。群體倍增時(shí)間通常長(zhǎng)于單個(gè)細(xì)胞周期。四、細(xì)胞活力的檢測(cè)方法1、臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)臺(tái)盼藍(lán)（Trypan blue）染

13、色使死細(xì)胞呈藍(lán)色，活細(xì)胞不著色。計(jì)數(shù)法得到活細(xì)胞比 例。此法簡(jiǎn)單快速。注意及時(shí)檢測(cè)，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)部分活細(xì)胞亦被染色2、克?。洌┬纬稍囼?yàn)測(cè)定單個(gè)細(xì)胞增殖能力，克隆形成率高者獨(dú)立生存能力強(qiáng)。平板克隆形成試驗(yàn)軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)：多用于檢測(cè)腫瘤細(xì)胞或轉(zhuǎn)化細(xì)胞。利用腫瘤細(xì)胞的非 錨著生長(zhǎng)依賴性，將其懸浮培養(yǎng)于軟瓊脂內(nèi)?？筛鶕?jù)其克隆形成率判斷細(xì)胞的惡性 程度，亦可用此法進(jìn)行亞克隆分離3. 3H-TdR摻入法3H標(biāo)記的胸腺嘧啶脫氧核苷（TdR），在DNA復(fù)制時(shí)摻入至新合成的DNA鏈中, 從而使子細(xì)胞被3H標(biāo)記，測(cè)定3H的放射性脈沖數(shù)即可比較細(xì)胞增殖活性。4. 細(xì)胞活力測(cè)定的MTT比色法MTT （二甲基噻唑二

14、苯基四唑溴鹽）是線粒體琥珀酸脫氫酶的作用 底物，在活細(xì)胞中MTT能被其線粒體脫氫酶還原為formazan顆粒，溶于異 丙醇或DMSO之后，溶液顏色深淺與所含的 formazan量成正比，因此根據(jù) 呈現(xiàn)的0D值可反應(yīng)細(xì)胞的代謝水平。死細(xì)胞無(wú)此酶活性。MTT法簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細(xì)胞毒牲試驗(yàn)、 腫瘤放射敏感性實(shí)驗(yàn)等。亦常用于測(cè)定生長(zhǎng)曲線。四、細(xì)胞系和細(xì)胞株、基本概念細(xì)胞系（cell line）:從原代培養(yǎng)物經(jīng)傳代后得來(lái)的一群不均一的細(xì)胞。由原先組成原代培養(yǎng)物的所有細(xì)胞類型組成，但一般以某種細(xì)胞為主。細(xì)胞株（cell strain）：通過(guò)選擇或克隆化培養(yǎng)，從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的

15、具有特殊遺傳、生化性質(zhì)或特異標(biāo)記的細(xì)胞群。如一定標(biāo)記染色體、對(duì)某種病毒的敏感性或抗性、特殊的抗原性 等，這些特性在以后的培養(yǎng)中必須持續(xù)存在。有限細(xì)胞株（finite cell strain）連續(xù)纟田胞株（continuous cell strain二、建立細(xì)胞系（株）的檔案1、培養(yǎng)細(xì)胞的來(lái)源交代細(xì)胞供體所屬物種、年齡、性別、器官或組織來(lái)源。對(duì)腫瘤組 織，應(yīng)說(shuō)明臨床病理診斷結(jié)果、組織來(lái)源、病例號(hào)等。說(shuō)明培2、細(xì)胞生物學(xué)特性說(shuō)明細(xì)胞的一般形態(tài)、特征性結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)曲線與分裂指數(shù)、倍增時(shí)間、 集落形成率、染色體特性等。對(duì)腺細(xì)胞應(yīng)查明有無(wú)蛋白質(zhì)或激素等分泌產(chǎn)物；對(duì)腫 瘤細(xì)胞應(yīng)作瓊脂培養(yǎng)、異體動(dòng)物成瘤性、組

16、織浸潤(rùn)能力等檢測(cè)。五、培養(yǎng)物的冷凍與復(fù)蘇一、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理冷凍保存：將體外培養(yǎng)物懸浮在加有或不加冷凍保護(hù)劑的溶液中，以一定的冷凍 速率降至零下某一溫度（一般是低于-70C的超低溫條件），并在此溫度 下對(duì)其長(zhǎng)期保存的過(guò)程。復(fù)蘇：以一定的復(fù)溫速率將凍存的培養(yǎng)物恢復(fù)到常溫的過(guò)程。一）冷凍保護(hù)劑甘油、DMSO滲透到細(xì)胞內(nèi)，避免細(xì)胞過(guò)分脫水皺縮，減少水分子形成冰晶，保護(hù)酶和蛋白 質(zhì)等。添加濃度通常為10%。二）冷凍速率速度過(guò)慢：脫水嚴(yán)重，體積嚴(yán)重收縮，溶質(zhì)損傷；速度過(guò)快：胞內(nèi)冰晶損傷嚴(yán)重三）冷凍保存溫度1、液氮溫度（-196C ）是目前最佳的冷凍保存溫度。2、-70C-80C,短期保存一個(gè)月

17、內(nèi)3、冰點(diǎn)到-40C保存效果不佳四）復(fù)溫速率37-40 C水浴中，于12min內(nèi)快速完成復(fù)溫二、凍存方法（1）待凍存細(xì)胞懸液的準(zhǔn)備（2）分級(jí)冷凍（3）記錄三、凍存細(xì)胞的復(fù)蘇從液氮中取出后，立即投入到3740C溫水中，溶解后盡快離心棄除冷凍保護(hù) 液。六、培養(yǎng)物的污染、檢測(cè)和排除一、培養(yǎng)物的污染與檢測(cè)1. 污染的內(nèi)容： 1）微生物： 真菌、細(xì)菌和病毒2）化學(xué)物：影響細(xì)胞生存非細(xì)胞所需的細(xì)胞成分3）細(xì)胞：其他非同一種細(xì)胞2. 污染對(duì)細(xì)胞的影響：輕者：細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢、分裂相減少、細(xì)胞變得粗糙、輪廓增強(qiáng)重者：細(xì)胞增殖停止、分裂相消失、胞質(zhì)中出現(xiàn)大量堆積物、細(xì)胞變圓、脫落3. 污染的途徑：空氣、清洗消毒、操

18、作、血清、組織塊4. 細(xì)菌污染與檢測(cè)：懷疑有污染時(shí)，用無(wú)抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)檢測(cè)。如果有的話，幾小時(shí)內(nèi)培養(yǎng)液外觀 就渾濁，呈現(xiàn)黃綠色，在倒置相差顯微鏡下有點(diǎn)狀的細(xì)菌顆粒，培養(yǎng)背景變的模糊。5. 真菌污染與檢測(cè)：酵母菌污染：類似細(xì)菌污染，倒置相差顯微鏡下可以看到圓形或卵圓形的酵母菌；有酒或酸的發(fā)酵樣異味；液體呈現(xiàn)黃綠色。霉菌污染：絲狀或樹枝狀生長(zhǎng)的菌絲，成白色絲狀團(tuán)塊6. 支原體污染與檢測(cè)：支原體污染的培養(yǎng)細(xì)胞，在顯微鏡下無(wú)特殊的外觀表現(xiàn)， 培養(yǎng)液也不渾濁。因而 在污染早期相當(dāng)難以發(fā)現(xiàn)。如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖緩慢、破碎的細(xì)胞甚多、培養(yǎng)細(xì)胞需要頻繁改善營(yíng)養(yǎng)環(huán)境才能 支持長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)懷疑培養(yǎng)物可能受到支原體污染。檢測(cè)技術(shù)：DNA熒光染色法、PCR、免疫學(xué)方法以及支原體培養(yǎng)法。7. 病毒污染的檢?感染了病毒的宿主細(xì)胞形態(tài)上不一定有顯著的特異性改變，因此較難判斷。?判斷方法：電子顯微鏡觀察，免疫學(xué)方法，和 PCR方法二、污染的預(yù)防1、培養(yǎng)操作前的準(zhǔn)備:a.定期清洗或更換超凈工作臺(tái)