SDS-PAGE蛋白電泳方法

1、SDS-PAGE. 實驗原理SDS 是一種陰離子表面活性劑，在蛋白質(zhì)溶液里加入SDS 和巰基乙醇后，巰基乙醇能使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵還原， SDS 能使蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水鍵打 開并結合到蛋白質(zhì)分子上，形成蛋白質(zhì) -SDS 復合物。在一定條件下， SDS 與大 多數(shù)蛋白質(zhì)的結合比例為 1.4:1。由于十二烷基磺酸根帶負電，使各種蛋白質(zhì)的 SDS-復合物都帶上相同密度的負電荷，它的量大大超過了蛋白質(zhì)原有的電荷 量，因而掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差別。SDS與蛋白質(zhì)結合后，還引起了蛋白質(zhì)構象的改變。蛋白質(zhì)-SDS復合物的流體力學和光學性質(zhì)表明，它 們在水溶液中的形狀，近似于雪茄煙形的長橢圓棒，

2、不同蛋白質(zhì)的 SDS 復合物 的短軸長度都一樣，約為 1.8nm ，而長軸則隨蛋白質(zhì)的 Mr 成正比的變化?；?于上述原因，蛋白質(zhì) -SDS 復合物在凝膠電泳中的遷移率，不再受蛋白質(zhì)原有電 荷和形狀的影響，而只與橢圓棒的長度有關， 也就是蛋白質(zhì) Mr 的函數(shù)。二 . 試劑器材30%凝膠貯液(100mL):稱取試劑Acr 29.2g和Bis 0.8g置于100mL燒杯中，向燒杯 中加入約60mL雙蒸水，充分攪拌溶解后加雙蒸水定容至100mL，置于棕色瓶內(nèi) 4C貯存，每過1-2個月應重新配制；注意:丙稀酰胺具有很強的神經(jīng)毒性，并可通過皮膚吸收， 其作用有積累性，配制時應戴 手套和口罩等。分離膠緩沖

3、液(1.5 mol/L Tris-HCI，pH 8.8，100mL):稱取Tris 18.2g溶于約80mL 雙蒸水，用6mol/L的HCI調(diào)整pH值至8.8,加雙蒸水定容到100mL，4 C 貯存；堆積膠緩沖液(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8，100mL):稱取Tris 6.0g溶于約 80mL雙蒸 水，用1mol/L的HCI調(diào)整pH值至6.8,加雙蒸水定容到100mL，4 C 貯存； 電泳緩沖液(1L):稱取試劑Tris 3.03嗣甘氨酸14.4g置于500mL燒杯中，向燒杯 中加入約400mL雙蒸水充分溶解，再加入10%SDS溶液1.0mL，以雙蒸水定容至 1L伯然pH值為8

4、.3,無需再調(diào))，4 C貯存，可重復使用5-6次；2X加樣緩沖液(10mL):取下列試劑置于10mL塑料離心管中0.5mol/L Tris-HCI 緩沖液(pH6.8)2.0mL10%SDS溶 液4.0mL甘油2.0mL巰基乙醇2.0mL溴酚藍0.02g混勻后1mL分裝，-70 C可貯存6個月；10%AP:稱取(NH4)203 1.0 g,溶于10.0mL雙蒸水中，分裝成每份1mL, -20 C貯存；TEMED :分裝成每份1mL, 4C避光貯存；水飽和正丁醇(100mL):在玻璃瓶中加入50mL雙蒸水和50mL正丁醇，振搖。上層相即水飽和正丁醇，室溫下可長期保存。染色液(100mL):稱取考

5、馬斯亮藍R-250 0.25g加入雙蒸水40.0mL、甲醇50.0mL和乙酸10.0mL，攪拌溶解后濾紙過濾除去不溶顆粒；脫色液(1L):分別取甲醇50mL和乙酸75mL，加雙蒸水875mL稀釋。其他器材：容量瓶(1L、100ml、10ml)、燒杯、離心管(15ml、1.5ml)、移液器、移液器吸頭、干燥器、渦旋振蕩器和廢液缸等。分離膠配方(100mL，4塊膠)貯液分離膠中丙烯酰胺的終濃度(%)8.09.010.011.0 12.013.014.015.016.017.018.0凝膠貯液(mL)26.6730.0033.3336.67 40.0043.3346.6750.0053.3356.6

6、760.00分離膠緩沖液(mL)2510%SDS (mL)1.010%AP (mL)0.75TEMED (mL)0.05 (抽氣后添加)堆積膠配方（40mL, 4塊膠）貯液堆積膠中丙烯酰胺的終濃度 （）3.04.05.0凝膠貯液（mL）4.005.366.66分離膠緩沖液（mL）10.0雙蒸水（mL）25.3624.0022.7010%SDS(mL)0.410%AP(mL)0.2TEMED(mL)0.04 （抽氣后添加）三.操作步驟樣品處理：在密封的螺蓋微量離心管中，用 2X加樣緩沖液按1:1稀釋蛋白質(zhì)樣品溶 液，于100C煮沸3-5min，分子質(zhì)量標準品也經(jīng)上述處理。凝膠制備：將玻璃板用蒸餾

7、水清洗干凈，再用 75%的酒精去脂，干燥后固定在灌膠支 架上；配制12%的分離膠，加入TEMED前抽真空10min以除去丙烯酰胺溶液中 的空氣；加入TEMED后輕輕振蕩混勻，迅速注入安裝好的玻璃板的間隙中， 給堆積膠留出約1cm的空間。在丙烯酰胺溶液上覆蓋一層水飽和的正丁醇，以 防止空氣擴散到凝膠中抑制聚合作用，并保證凝膠表面水平；在室溫條件下， 凝膠應在30min-50min內(nèi)聚合完成。凝膠聚合后凝膠和上層液相之間可見折射 率的變化；倒掉覆蓋層并用蒸餾水清洗凝膠頂部數(shù)次，并用濾紙條吸凈殘留的蒸餾 水，注意勿破壞凝膠表面；制備堆積膠并迅速注入分離膠上，立即插入干凈的 梳子，不要混入氣泡，以一定

8、的角度將梳子插入堆積膠能減少氣泡的產(chǎn)生。堆 積膠聚合后小心移去梳子，避免破壞加樣孔，用蒸餾水小心清洗加樣孔，以除 去未聚合的丙烯酰胺。加樣：將凝膠固定在電泳裝置上，電泳上槽內(nèi)加入電泳緩沖液沒過加樣孔，并檢 查有無滲漏。傾斜整個裝置以趕走凝膠下面可能留有的氣泡；按預定順序加 樣，每孔加入20兒，在對照孔中加入分子質(zhì)量標準品 6-7兒，如有空置的加樣 孔，加入等體積的1 4加樣緩沖液。電泳：將電泳裝置與電源相連，正極接下槽、負極接上槽進行電泳，樣品在堆積 膠階段電壓為80V，而在分離膠階段電壓調(diào)整為120V。直到溴酚藍到達分離膠 的底部后，關閉電源，斷開電極。從電泳裝置上卸下玻璃板，用小鏟子剝下凝

9、 膠后切除一角以標注凝膠方位。染色：將凝膠浸泡在染色液中，置于搖床上染色 4hr，染色液可回收重復利用。 脫色：染色結束后，將凝膠浸泡在脫色液中，置于搖床上脫色過夜，其間更換脫 色液3次.記錄：將顯示蛋白條帶的凝膠用凝膠成像儀拍照，記錄試驗結果，并根據(jù)分子質(zhì) 量標準品計算目標蛋白的分子量。四.注意事項：SDS與蛋白質(zhì)的結合按質(zhì)量成比例，蛋白質(zhì)含量不可以超標，否則SDS結合量不足。用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)相對分子量時，必須同時作標準曲線，并且SDS-PAGE測定分子量有10%誤差。有些蛋白質(zhì)由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（a-胰凝乳蛋白酶）組成的, 它們在巰基乙醇和SDS的作用下解離成亞基或多條單肽鏈。因此，對于這一類 蛋白質(zhì)，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定的只是它們的亞基或是單條肽