釉原蛋白基因性別鑒定

1、以釉原蛋白基因進(jìn)行性別鑒定 人民衛(wèi)生出版社口腔生物學(xué)第四版 實(shí)驗(yàn)九 以釉原蛋白基因進(jìn)行性別鑒定 實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求：實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求： 通過此實(shí)驗(yàn)學(xué)會(huì)pcr檢測(cè)技術(shù)，包括dna提取、分光光度計(jì)的使用、引 物設(shè)計(jì)的原則、pcr擴(kuò)增的條件設(shè)定，以及電泳和測(cè)序結(jié)果分析等。 實(shí)驗(yàn)原理：實(shí)驗(yàn)原理： 針對(duì)amelogenin基因內(nèi)含子1區(qū)x染色體上6bp缺失的特性，采用一對(duì)x、 y同源引物擴(kuò)增，男性個(gè)體同時(shí)得到x染色體amelogenin等位基因特異 性段(簡稱am x，106 bp或212 bp)和y染色體amelogenin等位基因特異 性片段(簡稱am y，112bp或218 bp)，分型結(jié)果表現(xiàn)出兩條譜

2、帶；而女 性僅有am x(106 bp或212 bp)，分型表現(xiàn)為一條譜帶，因此鑒定性別。 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：實(shí)驗(yàn)內(nèi)容： 樣品 采集 dna提取和 含量檢測(cè) pcr 擴(kuò)增 凝膠 電泳 測(cè)序結(jié) 果分析 第三節(jié) 口腔疾病分子生物學(xué) 人民衛(wèi)生出版社口腔生物學(xué)第四版 實(shí)驗(yàn)設(shè)備及器材：實(shí)驗(yàn)設(shè)備及器材： 5ml無菌試管（含肝素抗凝劑）；powerplex m16 system dna提取試劑盒， am 基因上游引物和下游引物，2taq pcr mastermix；20bp dna ladder marker；dna片段快速純化試劑盒。 pcr儀，凝膠成像儀，微量紫外分光光度計(jì)，電泳儀 。 實(shí)驗(yàn)方法：實(shí)驗(yàn)方法： 樣

3、品采集 采集靜脈血5ml于無菌抗凝管中 dna 提取和含量檢測(cè)性別鑒定pcr 擴(kuò)增、凝膠電泳、純化測(cè)序 第三節(jié) 口腔疾病分子生物學(xué) 人民衛(wèi)生出版社口腔生物學(xué)第四版 人民衛(wèi)生出版社口腔生物學(xué)第四版 n4種dntp混合物 各200umol/l n引物 各10100pmol n模板dna 0. .12ug ntaq dna聚合酶 2. .5u nmg2+ 1. .5mmol/l 人民衛(wèi)生出版社口腔生物學(xué)第四版 人民衛(wèi)生出版社口腔生物學(xué)第四版 n1.變性：高溫使雙鏈變性：高溫使雙鏈dna解離形成單鏈解離形成單鏈 （94，30s）。）。 n2.退火：低溫下，引物與模板退火：低溫下，引物與模板dna互補(bǔ)區(qū)

4、互補(bǔ)區(qū) 結(jié)合（結(jié)合（55，30s）。）。 n3.延伸：中溫延伸。延伸：中溫延伸。dna聚合酶催化以引聚合酶催化以引 物為起始點(diǎn)的物為起始點(diǎn)的dna鏈延伸反應(yīng)（鏈延伸反應(yīng)（70 72，3060s） 人民衛(wèi)生出版社口腔生物學(xué)第四版 紫外分光光度計(jì)紫外分光光度計(jì) n紫外分光光度計(jì)，就是根據(jù)物質(zhì)的吸收光譜研究 物質(zhì)的成分、結(jié)構(gòu)和物質(zhì)間相互作用的有效手段 。由于各種物質(zhì)具有各自不同的分子 、原子和不 同的分子空間結(jié)構(gòu)，其吸收光能量的情況也就不 會(huì)相同，因此，每種物質(zhì)就有其特有的、固定的 吸收光譜曲線，可根據(jù)吸收光譜上的某些特征波 長處的吸光度的高低判別或測(cè)定該物質(zhì)的含量。 人民衛(wèi)生出版社口腔生物學(xué)第四版

5、 凝膠電泳 n凝膠電泳的原理比較簡單。當(dāng)一種分子被放置 在 電 場(chǎng)當(dāng) 中時(shí) , 它們 就會(huì) 以一定 的速 度移向適當(dāng) 的電極 。這種電泳分子在電場(chǎng)作用下的遷移速度 , 叫做電泳的遷移率。它同電場(chǎng)的強(qiáng)度和電泳分子 本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比。也就是說 ,電場(chǎng)強(qiáng) 度越大、電泳分子所攜帶的凈電荷數(shù)量越多 ,其遷 移的速度也就越快 , 反之則較慢。 遷移率不同， 其最終分布于不同條帶。 人民衛(wèi)生出版社口腔生物學(xué)第四版 實(shí)驗(yàn)方法：實(shí)驗(yàn)方法： dna 提取和含量檢測(cè)提取和含量檢測(cè)： 抗凝全血 2ml+ 8m冷l 蒸餾水混勻后 離心 棄上清 加等體積預(yù)冷 0.1% triton-x 100 離心， 棄上清

6、加2ml裂 解液打碎 沉淀 加10% sds 100l 混勻 加10mg/ml 蛋白酶k 40l 混勻，55 3小時(shí) 加入6.0mol/l nacl 0.7ml震蕩 20秒 離心40 分鐘 取上清加2倍體 積的無水乙醇 混勻呈絮狀 dna沉淀 挑取沉淀加80% 乙醇洗滌沉淀2次 加50l te 溶解dna 加入200l 5% chelex- 100，2l( 10mg/ml)蛋 白酶k ，震蕩10秒 搖床150r/min， 56恒溫孵化12 小時(shí)，震蕩15秒 100水浴8分 鐘，震蕩15秒 12000r/min 離心5 分鐘，取上清液 紫外分光光度計(jì)檢測(cè) 樣品在260nm的od值 確定dna含量

7、 第三節(jié) 口腔疾病分子生物學(xué) 人民衛(wèi)生出版社口腔生物學(xué)第四版 實(shí)驗(yàn)方法：實(shí)驗(yàn)方法： 性別鑒定性別鑒定pcr 擴(kuò)增擴(kuò)增、凝膠電泳、純化測(cè)序、凝膠電泳、純化測(cè)序 u pcr 擴(kuò)增：擴(kuò)增：pcr反應(yīng)引物序列如下：上游引物( 5- ccctgg gct ctg taa aga ata gtg-3)，下游引物( 5-atc aga gct taa act ggg aag ctg3)；模板dna為上述血液所獲樣品的dna提取液。 pcr 反應(yīng)體系為25l，其中2taq pcrmastermix 12.5l，上下游引 物( 1mol /l)各1l，無菌雙蒸水9.5l，模板dna 1l。 u pcr 反應(yīng)參數(shù)

8、反應(yīng)參數(shù): 95預(yù)變性5分鐘；95變性30秒，60退火30秒， 72延伸30秒，35個(gè)循環(huán)；72延伸7分鐘。 u 凝膠電泳凝膠電泳：制備濃度為3g/l的瓊脂糖凝膠，置1tae電泳緩沖液中， 電泳條件為: 電壓100v，電泳時(shí)間120分鐘。電泳結(jié)果放入凝膠成像 儀中進(jìn)行觀察。 u 純化測(cè)序：純化測(cè)序：將瓊脂糖凝膠上的特異性條帶切下純化、回收、測(cè)序。 第三節(jié) 口腔疾病分子生物學(xué) 人民衛(wèi)生出版社口腔生物學(xué)第四版 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)： u引物引物 引物是pcr反應(yīng)的關(guān)鍵，其特異性取決于引物與模板dna的互補(bǔ)程 度。引物的長度最好為15bp30bp；引物擴(kuò)增跨度以200bp500bp為 宜，特定條件下可擴(kuò)

9、增長度至10kb的片段；其中g(shù)+c含量以40%60% 為宜，atgc最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排 列；避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)或兩條引物間互補(bǔ)，特別是3端的互補(bǔ)； 3端的堿基，尤其最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)；引物中有或 最好加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)；引 物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性；每條引物的濃度 0.1mol1mol或10pmol100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果 為好。 upcr 循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù) 循環(huán)次數(shù)決定pcr擴(kuò)增的程度。pcr循環(huán)次數(shù)主要取決于 模板dna的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在30次40次之間

10、，循環(huán)次數(shù)越多， 但非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。 u設(shè)立對(duì)照設(shè)立對(duì)照 pcr反應(yīng)應(yīng)設(shè)立陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，它是pcr反應(yīng)是否成功、 產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個(gè)重要參考指標(biāo)。 第三節(jié) 口腔疾病分子生物學(xué) 人民衛(wèi)生出版社口腔生物學(xué)第四版 結(jié)果分析：結(jié)果分析： m-marker； 1、2-陰性對(duì)照； 3、5-女性； 4-男性 第三節(jié) 口腔疾病分子生物學(xué) 人民衛(wèi)生出版社口腔生物學(xué)第四版 為什么要用冷蒸餾水，冰中放置5分鐘后，在 4下離心？ n提取過程中細(xì)胞壁破碎細(xì)胞質(zhì)流出，中間有酶會(huì) 降解流出的dna ，因此要低溫保存來抑制酶的活 性，防止dna被降解 。 triton x-100 n1

11、00(聚乙二醇辛基苯基醚) 是一種非離 子型表面活性劑（或稱去污劑），它能 溶解脂質(zhì)，提高真核細(xì)胞細(xì)胞膜的通透 性。其中1%的triton x-100常用于漂洗 組織標(biāo)本和破壞細(xì)胞。 人民衛(wèi)生出版社口腔生物學(xué)第四版 sds n十二烷基硫酸鈉 nsds是一種能夠使蛋白質(zhì)變性的去污劑。它用于 確定蛋白分子量的聚丙烯酰胺凝膠電泳。它也可 以用于核酸抽提操作中破壞細(xì)胞壁及裂解核酸蛋 白復(fù)合物。在較高溫度下，破壞蛋白質(zhì)與dna的 結(jié)合，使dna釋放出來。 人民衛(wèi)生出版社口腔生物學(xué)第四版 蛋白酶k n是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶。 n在尿素或sds中，蛋白酶k顯示更高的酶活性。 蛋白酶k的最佳反應(yīng)溫度

12、為65，但在65或更 高的溫度蛋白酶k自身的也非常迅速地降解。很 多時(shí)候反應(yīng)溫度選擇50-55。 人民衛(wèi)生出版社口腔生物學(xué)第四版 6.0mol/nacl的作用的作用 ndna和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的nacl溶液 中溶解度不同（0.14mol/l溶解度最低），利用這 一特點(diǎn)，選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度就能使dna充分溶解 ，而使雜質(zhì)沉淀，或者相反，以達(dá)到分離目的。 為什么用無水乙醇沉淀為什么用無水乙醇沉淀dna？ n用無水乙醇沉淀dna，這是實(shí)驗(yàn)中最常 用的沉淀dna的方法。乙醇的優(yōu)點(diǎn)是可以 任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會(huì)起任 何化學(xué)反應(yīng)，對(duì)dna很安全，因此是理想 的沉淀劑。 ndna溶液是dn

13、a以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在， 當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇會(huì)奪去dna周圍的水 分子，使dna失水而易于聚合。一般實(shí)驗(yàn) 中，是加2倍體積的無水乙醇與dna相混 合，其乙醇的最終含量占67左右。 人民衛(wèi)生出版社口腔生物學(xué)第四版 te溶液溶液 nte是由tris（三羥甲基氨基甲烷）和edta配置而 成的，主要用于溶解dna，能穩(wěn)定儲(chǔ)存dna。 人民衛(wèi)生出版社口腔生物學(xué)第四版 chelex-100 nchelex-100 是一種由苯乙烯、二乙烯苯共聚體組 成的化學(xué)螯合樹脂，含有成對(duì)的亞氨基二乙酸鹽 離子，可螯合多價(jià)離子，特別是對(duì)高價(jià)金屬離子 有很高的親和力和螯合作用，能有效除去非核酸 有機(jī)物。在低離子強(qiáng)度、堿性及煮

14、沸的條件下， 可以使細(xì)胞膜破裂，并使蛋白質(zhì)變性，通過離心 除去chelex顆粒，使其結(jié)合的物質(zhì)與dna 分離。 人民衛(wèi)生出版社口腔生物學(xué)第四版 紫外分光光度計(jì)測(cè)試樣品在紫外分光光度計(jì)測(cè)試樣品在260nm的的od值值 n光通過被檢測(cè)物，前后的能量差異即是被檢測(cè)物吸收掉的 能量，特定波長下，同一種被檢測(cè)物的濃度與被吸收的能 量成定量關(guān)系。檢測(cè)單位用od值表示， od是optical delnsity（光密度）的縮寫，表示被檢測(cè)物吸收掉的光密 度. n通過dna的od260（260nm下的吸光值） 可以知道dna 的濃度 具體換算是dna濃度（ug/ml）=od260*50*稀釋 倍數(shù) nod 26

15、0 計(jì)量核酸 od 280 計(jì)量蛋白 od 230 計(jì)量鹽離子 od 320 計(jì)量背景 人民衛(wèi)生出版社口腔生物學(xué)第四版 2taq pcr mastermix n做pcr時(shí)的預(yù)混液，將除了模板、引物以外其他 的組分按照最佳配比混合在一起的混合液，使用 時(shí)直接加入模板和引物就可以，這樣做節(jié)省時(shí)間 ，也不用考慮反應(yīng)體系性能問題。一般包括緩沖 液、鎂離子、酶和dntp 。 人民衛(wèi)生出版社口腔生物學(xué)第四版 pcr的基本步驟的基本步驟 12345 22 55 72 94 時(shí)間（min） 溫度 （） 低溫退火 2 高溫變性 1 適溫延伸 3 重復(fù)13步 2530輪 目的dna片段 擴(kuò)增100萬倍以上 dna雙螺旋 dna變性 形成2條單鏈 dna單鏈 與引物復(fù)性 子鏈延伸 dna加倍 人民衛(wèi)生出版社口腔生物學(xué)第四版 凝膠電泳 n在生理?xiàng)l件下 ,核酸分子的糖- 磷 酸骨架中的磷酸基 因 呈 離子狀態(tài) ,從這種意義上講 ,d n a 和 r n a 多核苷酸鏈可 叫做 多聚 陰離 子 ( p ol yani o n s ) 。因 此 , 當(dāng)核 酸分 子 被放 置在 電場(chǎng)中時(shí) , 它們就