醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)工作導(dǎo)則

1、附件醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作導(dǎo)則一、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)（一）臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室區(qū)域設(shè)計(jì)原則。 原則上臨床基 因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)設(shè)置以下區(qū)域： 試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)、 標(biāo)本制 備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。 這 4 個(gè)區(qū)域在物理空間上必須是 完全相互獨(dú)立的， 各區(qū)域無論是在空間上還是在使用中， 應(yīng)當(dāng)始終 處于完全的分隔狀態(tài)， 不能有空氣的直接相通。 根據(jù)使用儀器的功 能，區(qū)域可適當(dāng)合并。例如使用實(shí)時(shí)熒光 PCR 儀，擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增 產(chǎn)物分析區(qū)可合并； 采用樣本處理、 核酸提取及擴(kuò)增檢測為一體的 自動化分析儀，則標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可合并。 各區(qū)的功能是：1. 試

2、劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)：貯存試劑的制備、試劑的分裝和擴(kuò)增反 應(yīng)混合液的準(zhǔn)備，以及離心管、吸頭等消耗品的貯存和準(zhǔn)備。2. 標(biāo)本制備區(qū)：核酸（ RNA 、 DNA ）提取、貯存及其加入至 擴(kuò)增反應(yīng)管。 對于涉及臨床樣本的操作， 應(yīng)符合生物安全二級實(shí)驗(yàn) 室防護(hù)設(shè)備、個(gè)人防護(hù)和操作規(guī)范的要求。3. 擴(kuò)增區(qū)： cDNA 合成、 DNA 擴(kuò)增及檢測。4. 擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)：擴(kuò)增片段的進(jìn)一步分析測定，如雜交、酶 切電泳、變性高效液相分析、測序等。驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的空氣流向可按照試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)T標(biāo)本制備區(qū)T擴(kuò)增區(qū)T擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)進(jìn)行，防止擴(kuò)增產(chǎn)物順空氣氣流進(jìn)入擴(kuò)增前 的區(qū)域。可按照從試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)T標(biāo)本制備區(qū)T擴(kuò)增區(qū)T擴(kuò)增

3、 產(chǎn)物分析區(qū)方向空氣壓力遞減的方式進(jìn)行。 可通過安裝排風(fēng)扇、 負(fù) 壓排風(fēng)裝置或其他可行的方式實(shí)現(xiàn)。(三)工作區(qū)域儀器設(shè)備配置標(biāo)準(zhǔn)。1. 試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)。(1) 28 C和-20 C以下冰箱。( 2 )混勻器。(3)微量加樣器(覆蓋 0.2-1000訕)。( 4 )可移動紫外燈(近工作臺面)。( 5 )消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭。( 6)專用工作服和工作鞋 (套)。( 7 )專用辦公用品。2. 標(biāo)本制備區(qū)。(1) 2-8 C冰箱、-20 C或-80 C冰箱。( 2 )高速離心機(jī)。( 3 )混勻器。( 4 )水浴箱或加熱模塊。(5)微量加樣器(覆蓋 0.2-1000訕)。

4、( 6 )可移動紫外燈(近工作臺面)。（7）生物安全柜。（ 8 ）消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸 頭（帶濾芯）。（ 9）專用工作服和工作鞋 （套）。（10 ）專用辦公用品。（11 ）如需處理大分子 DNA ，應(yīng)當(dāng)具有超聲波水浴儀。3. 擴(kuò)增區(qū)。（ 1 ）核酸擴(kuò)增儀。（2）微量加樣器（覆蓋 0.2-1000訕），（視情況定）。（ 3 ）可移動紫外燈（近工作臺面）。（ 4 ）消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸 頭（帶濾芯）。（ 5 ）專用工作服和工作鞋。（ 6 ）專用辦公用品。4. 擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。 視檢驗(yàn)方法不同而定，基本配置如下：（1）微量加樣器（覆蓋 0.2-

5、1000訕）。（ 2）可移動紫外燈（近工作臺面） 。（ 3 ）消耗品：一次性手套、加樣器吸頭（帶濾芯）。（ 4 ）專用工作服和工作鞋。（ 5 ）專用辦公用品。上述各區(qū)域儀器設(shè)備配備為基本配備， 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)根據(jù)自己使 用的擴(kuò)增檢測技術(shù)或試劑的特點(diǎn)，對儀器設(shè)備進(jìn)行必要的增減。二、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作基本原則（一）進(jìn)入各工作區(qū)域應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格按照單一方向進(jìn)行，即試劑儲存 和準(zhǔn)備區(qū)T標(biāo)本制備區(qū)T擴(kuò)增區(qū)T擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。（二）各工作區(qū)域必須有明確的標(biāo)記，不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、 物品不得混用。（三）不同的工作區(qū)域使用不同的工作服（例如不同的顏色）。 工作人員離開各工作區(qū)域時(shí)，不得將工作服帶出。（四）實(shí)驗(yàn)室

6、的清潔應(yīng)當(dāng)按試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)T標(biāo)本制備區(qū)T擴(kuò)增區(qū)T擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)的方向進(jìn)行。不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)域應(yīng)當(dāng)有其各自的清潔用具以防止交叉污染。（五）工作結(jié)束后，必須立即對工作區(qū)進(jìn)行清潔。工作區(qū)的實(shí)驗(yàn)臺表面應(yīng)當(dāng)可耐受諸如次氯酸鈉的化學(xué)物質(zhì)的消毒清潔作用。實(shí)驗(yàn)臺表面的紫外照射應(yīng)當(dāng)方便有效。 由于紫外照射的距離和能量對去 污染的效果非常關(guān)鍵，因此可使用可移動紫外燈（ 254nm 波長）， 在工作完成后調(diào)至實(shí)驗(yàn)臺上6090cm內(nèi)照射。由于擴(kuò)增產(chǎn)物僅幾百或幾十堿基對（ bp ），對紫外線損傷不敏感，因此紫外照射 擴(kuò)增片段必須延長照射時(shí)間，最好是照射過夜。（六）實(shí)驗(yàn)室的安全工作制度或安全標(biāo)準(zhǔn)操作程序，所有操作符 合實(shí)驗(yàn)

7、室生物安全通用要求（ GB19489-2008 ）。三、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室各區(qū)域工作注意事項(xiàng)（一）試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)。貯存試劑和用于標(biāo)本制備的消耗品等 材料應(yīng)當(dāng)直接運(yùn)送至試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)， 不能經(jīng)過擴(kuò)增檢測區(qū)， 試 劑盒中的陽性對照品及質(zhì)控品不應(yīng)當(dāng)保存在該區(qū)， 應(yīng)當(dāng)保存在標(biāo)本 處理區(qū)。（二）標(biāo)本制備區(qū)。由于在樣本混合、核酸純化過程中可能會發(fā) 生氣溶膠所致的污染， 可通過在本區(qū)內(nèi)設(shè)立正壓條件， 避免從鄰近 區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。 為避免樣本間的交叉污染， 加入待測核 酸后， 必須蓋好含反應(yīng)混合液的反應(yīng)管。 對具有潛在傳染危險(xiǎn)性的 材料，必須在生物安全柜內(nèi)開蓋， 并有明確的樣本處理和滅活程序。

8、（三）擴(kuò)增區(qū)。為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)當(dāng)盡量減少在本區(qū) 內(nèi)的走動。 必須注意的是， 所有經(jīng)過檢測的反應(yīng)管不得在此區(qū)域打 開。（四）擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。核酸擴(kuò)增后產(chǎn)物的分析方法多種多樣， 如膜上或微孔板或芯片上探針雜交方法 （放射性核素標(biāo)記或非放射 性核素標(biāo)記）、直接或酶切后瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電 泳、 Southern 轉(zhuǎn)移、核酸測序方法、質(zhì)譜分析等。本區(qū)是最主要 的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源， 因此必須注意避免通過本區(qū)的物品及工作服 將擴(kuò)增產(chǎn)物帶出。在使用 PCR-ELISA 方法檢測擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，必須 使用洗板機(jī)洗板， 廢液必須收集至 1 mol/L HCl 中，并且不能在實(shí) 驗(yàn)室內(nèi)傾倒，而應(yīng)