藥物色譜分析-丁黎部分匯總

1、影響色譜柱展開的柱內(nèi)柱外因素液質(zhì)連用LS-MS離子源接I：流動(dòng)相及樣品的霧化，除去溶劑分子；完成對(duì)樣品的電離人氣壓離子化API：使樣品的離子化在處于人氣壓條件下的離子化室中完成。電噴霧離子化ESI濃度型檢測(cè)器強(qiáng)電場(chǎng)影響下，對(duì)高度帶電霧滴進(jìn)行精細(xì)霧化的過程A.霧滴形成過程：錐形-噴口模型電場(chǎng)下正負(fù)離子的移動(dòng)和表面張力制衡形成Taylor錐-電壓上升，帶電霧滴釋放B霧滴變小過程：霧滴一溶劑蒸發(fā)一小霧滴一達(dá)到Rayleigh穩(wěn)定限庫侖爆炸 霧滴蒸發(fā)過程與霧滴起始尺寸和電荷相關(guān)。決定霧滴半徑的重要參數(shù)是流速和溶液導(dǎo)電率。低流速和高導(dǎo)電率產(chǎn)生細(xì)霧滴。C.氣相離子形成過程1、分析物在溶液中的離子化対電噴霧

2、技術(shù)很重要，堿性化合物的LC-ESI-MS分析，可選用 酸性的流動(dòng)相：相反堿性的流動(dòng)相適用于一些酸性的化合物。使樣品成離子狀態(tài)。2、表面張力過人，難以形成錐形；而電壓過大，容易放電形成簇離子。因此選用表面張力 小的溶劑，如甲醇，乙睛。三低：表面張力低，黏度低，流速低3、去溶劑的程度：提高干燥器的溫度，流速4、“競爭機(jī)制”：一般而言，樣品信號(hào)強(qiáng)度隨著其它電解質(zhì)濃度的增高而降低.表面競爭，電荷競爭大氣壓化學(xué)離子化APCI軟電離方式與ESI比較，增加電暈放電針：發(fā)射自由電子啟動(dòng)后續(xù)離子化過程增加APCI蒸發(fā)器：對(duì)噴霧氣體進(jìn)行加熱APCI是軟的電離方式，由于溶劑蒸汽的保護(hù)，樣品分子較少受熱裂解的影響，

3、大量的熱量 用于溶劑的蒸發(fā)，電離過程屬于離子分子反應(yīng)。大氣壓光離子化APPI要求待測(cè)物的第一電離能小于10eV,而大部分氣體和溶劑的電離能大于10eV,因而背景干 擾低高PA的待測(cè)物通常是通過與質(zhì)子化的溶劑發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)來達(dá)到離子化，低PA的待測(cè) 物是通過與添加劑發(fā)生電荷交換反應(yīng)來離子化。添加劑：甲苯，丙酮，苯甲醯ESI 電噴霧離子化 樣品溶液通過具有高靜電 梯度（約3kV/cm）的噴霧 毛細(xì)管時(shí)，發(fā)生靜電噴霧， 并在干燥氣中形成帶電霧 滴，隨著溶劑的蒸發(fā)，生成 氣態(tài)離子，氣態(tài)離子沿著電 壓和壓力梯度進(jìn)入錐孔到 達(dá)質(zhì)量分析器進(jìn)行分析。通過噴I I弓毛細(xì)管間的高 電壓離子化產(chǎn)生多電荷離子基于質(zhì)

4、子親和力大小適于中、強(qiáng)極性化合物 蛋白質(zhì)、肽類、低聚核甘酸 等生物分子；胺類、季技鹽 等；含雜原子化合物如氨基 甲酸酯等不適合非極性化合物，如烷 炷、苯等/抑制作用較強(qiáng)，因此対 汽動(dòng)相組成有要求，避免表 面活性高的試劑。PH影響人基質(zhì)效應(yīng)人低流速范圍響應(yīng)更好。W1 ml/mim線性范圉較APCI窄。軟電離方式APCI大氣壓化學(xué)離子化 在大氣壓條件卞采用電暈 放電的方式使流動(dòng)相離子 化，然后流動(dòng)相作為化學(xué)離 子反應(yīng)氣（氣相試劑）使樣 品離子化的技術(shù)。樣品分子 的離子化通過質(zhì)子化或電 荷轉(zhuǎn)移來完成。電暈放電啟動(dòng)化學(xué)離子化 單電荷離予?；谫|(zhì)子親和力人小適于非極性、中等極性小分 子。不適于熱不穩(wěn)定（

5、可能發(fā)生 熱裂解）、難于氣化的極性和 大分子化合物離子化過程刈組成 依賴小，離子抑制較小。水的比例不限。PH有一定影響基質(zhì)效應(yīng)小高流速范圍響應(yīng)更好。W2 ml/mim正相色譜易于連接軟電離方式增加電暈放電針：發(fā)射自由 電子啟動(dòng)后續(xù)離子化過程。增加APCI蒸發(fā)器：對(duì)噴霧 氣體進(jìn)行加熱APPI人氣壓光離子化 待測(cè)物在氣相中吸收由真 空-紫外燈（UVlamp）發(fā)出 的光（10 eV）后放出電子 而離子化。吸收光子而離子化基于第一電離能人小分析弱極性和極端非極性 化合物離子抑制小基質(zhì)效應(yīng)極小低流速相應(yīng)好增加真空紫外燈（氮?dú)鉃?多）質(zhì)量分析器按照核質(zhì)比的不同分離四級(jí)桿質(zhì)量分析器掃描方式：全打描SCAN：

6、|在給定的時(shí)間內(nèi)不間斷地對(duì)設(shè)定荷質(zhì)比（m/z）范圍內(nèi)所有離子進(jìn)行掃描。 用于測(cè)定未知化合物的或未知混合物中各組分的分子量和質(zhì)譜圖。用于未知化合物的定性分析進(jìn)行SIM前，用SCAN確定掃描的目標(biāo)離子及其最佳電離參數(shù)選擇離子檢測(cè)SIM：在給定的時(shí)間內(nèi)選擇性地掃描某一個(gè)或幾個(gè)選定荷質(zhì)比的離子，得到的 不是化合物全譜。主要用于定量分析，快速篩選目標(biāo)化合物。三級(jí)四級(jí)桿質(zhì)屋分析器掃描方式MSI （前體離子）碰撞室MS2 （產(chǎn)物離子）作用產(chǎn)物離子掃描固定惰性氣體掃描化合物結(jié)構(gòu)推斷某核質(zhì)比的前體離子的產(chǎn)物離子譜圖前體離子掃描全掃描惰性氣體固定藥物降解產(chǎn)物，代 謝物結(jié)構(gòu)鑒定，同 系物分析產(chǎn)生某核質(zhì)比產(chǎn)物離子的前

7、體離子譜圖質(zhì)荷比軸數(shù)據(jù)來自MSI,離子強(qiáng)度軸數(shù)據(jù)來自MS2中性丟失掃描掃描（一定范圍）惰性氣體掃描（范圍減?。┧幬锒未x產(chǎn)物 分析碰撞后丟失一定中性質(zhì)量的前體離子譜圖 質(zhì)荷比軸數(shù)據(jù)來自MSI,離子強(qiáng)度軸數(shù)據(jù)來自MS2選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)固定惰性氣體固定定量分析，混合組 分痕量分析產(chǎn)生特定產(chǎn)物離子的某特定前體離子的譜圖色譜條件選擇注意事項(xiàng)：1、流動(dòng)相：水相的選擇：優(yōu)先使用j氐水比例的溶液為流動(dòng)相，水含量高降低離子化效果。APCI對(duì)流動(dòng)相組成要求小，可接受高水比例流動(dòng)相有機(jī)相的選擇：提高有機(jī)相比例可提高離子化效率。一般正離子方式用甲醇，負(fù)離子方式用乙購緩沖鹽的選擇：非揮發(fā)性鹽和離子對(duì)試劑與LC/MS不匹

8、配（競爭抑制）選用揮發(fā)性酸、堿和鹽，如醋酸錢、甲酸鍍、甲酸、乙酸、氨水等。為了離 子化效果，以上電解質(zhì)濃度宜小。pH的選擇：pH值影響離子化狀態(tài)，影響生成氣相離子的效率和檢測(cè)靈敏度。測(cè)堿性物質(zhì)，pH值在（pKa-2）,正離子檢測(cè) 測(cè)酸性物質(zhì)，pH值在（pKa + 2）,負(fù)離子檢測(cè) Cis柱適合2-8常用：醇-水，乙睛-水，甲醇-乙睛-水2、流速和色譜柱內(nèi)徑：流動(dòng)相流速受柱子內(nèi)徑和流動(dòng)相組成影響。較小的流速可獲得較好離子化效率。因而盡量選內(nèi)徑小的色譜柱。但是要兼顧分析速度的因素，因此多采用內(nèi)徑2.1mm的色譜柱，0.2、0.4mLmm|的流速。 有些樣品很容易吸附在進(jìn)樣閥和管路中，因此實(shí)驗(yàn)后要對(duì)

9、柱子進(jìn)行沖洗（純水一純甲醇） ESI-MS為濃度型響應(yīng)，因此柱后分流不影響響應(yīng)信號(hào)3、柱后補(bǔ)償技術(shù)：在LC和MS要求的條件矛盾時(shí)用調(diào)整pH值，達(dá)到盡量高的離子化效率；加入異丙醇可加速含水多流動(dòng)相的脫溶劑過程；對(duì)無或若離子化能力分子，柱后加乙酸鈉（50moLI）,使高效率產(chǎn)生M+Na +離子; 利用柱后三通分流，降低進(jìn)入離子源的流動(dòng)相流量。柱后衍生化。應(yīng)用“TFA-fix”技術(shù)解決三氟乙酸（TFA）對(duì)蛋白質(zhì)信號(hào)的壓抑作用，改善靈敏度。（在生化色譜分析中，流動(dòng)相中常加入1%的三氟乙酸（TFA）,它能夠增加色譜分辨率, 但是TFA為較強(qiáng)離子對(duì)試劑，使蛋白質(zhì)不易產(chǎn)生M+H +,信號(hào)減弱?？芍筇?加沸

10、點(diǎn)高但離子對(duì)作用弱的丙酸或乙酸。由于沸點(diǎn)：丙酸乙酸三氟乙酸。溶劑蒸 發(fā)中，TFA被丙酸或乙酸取代，易于產(chǎn)生M+H +）質(zhì)譜條件選擇注意事項(xiàng)：1、離子化方式選擇：ESIAPCIAPPI2、離子極性的選擇：堿性物質(zhì)：流動(dòng)相加甲酸或乙酸，成正離子，正離子檢測(cè)方式。酸性物質(zhì)：負(fù)離子檢測(cè)方式。3、分子離子的判斷和碎片離子的選擇分子離子的判斷正離子檢測(cè)方式時(shí)，加入L1+,則產(chǎn)生M + Li+, m/z值比分子離子大6。偽分子離子均可幫助判斷，如M+H+, M+Li+和M+Na+,分別犬了 6, 22, 384、單級(jí)四極桿質(zhì)譜中檢測(cè)離子的選擇酸性化合物：M-H-或其碎片離子堿性化合物：M+H+或其碎片離子酸

11、堿兩性：流動(dòng)相加甲酸或乙酸成M + H+基質(zhì)效應(yīng)：是指由于樣品中存在的干擾物質(zhì)，對(duì)響應(yīng)造成的直接或間接的影響內(nèi)源性物質(zhì)使待測(cè)物的離子化效率降低或者增強(qiáng)。APCI基質(zhì)效應(yīng)小于ESI,而APPI的基質(zhì)效應(yīng)更小評(píng)價(jià)方法：絕對(duì)基質(zhì)效應(yīng)配制兩組不同的系列濃度待測(cè)組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線，每組5條。第一組用流動(dòng)相配制。第二組將五種不同來源的空白生物樣品提取后，加入藥物配成與第一組相同濃度。濃度水平法將兩組各濃度水平響應(yīng)值分別用A和B表示，計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)（ME） =B/A*100%ME在85 %115 %,基質(zhì)效應(yīng)可忽略標(biāo)準(zhǔn)曲線法將兩組曲線斜率的平均值分別用S1和S2表示，計(jì)算基質(zhì)效（ME） =|S1-S2|/S1 M

12、EW15%,基質(zhì)效應(yīng)可忽略。相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)通過對(duì)加入不同來源的某種生物基質(zhì)中的待測(cè)物的質(zhì)譜響應(yīng)值進(jìn)行比較獲得。變異系數(shù)CV%消除方法1、優(yōu)化改進(jìn)樣品提取制備方法與生物樣品處理不干凈有關(guān)，因而要選擇合適的樣品前處理方法可采用液-液萃?。↙LE）、固相萃?。⊿PE）、蛋白沉淀（PP）,并選擇基質(zhì)效應(yīng)最小 的。一般液-液萃?。↙LE）的離子抑制作用往往最小2、優(yōu)化色譜條件反相色譜中，極性成分往往是引起基質(zhì)效應(yīng)的主因。當(dāng)色譜保留時(shí)間較短（3mm）時(shí), 受基質(zhì)效應(yīng)影響較大。因而有效增加色譜保留時(shí)間有利于減少基質(zhì)效應(yīng)。3、減少進(jìn)樣體積一作用顯著4、選擇合適接口a. APCI的基質(zhì)效應(yīng)小于ESIb. 正離子檢

13、測(cè)模式和負(fù)離子檢測(cè)模式的比較，一般負(fù)離子的背景噪音要小5、選擇合適內(nèi)標(biāo)理想的內(nèi)標(biāo)化合物應(yīng)與待測(cè)組分在樣品制備、色譜分離和質(zhì)譜檢測(cè)的全過程中具有相似 的行為并且對(duì)待測(cè)組分的提取、測(cè)定無任何干擾，以校正待測(cè)在移液、吹干、復(fù)溶等過程中的損失，待測(cè)組分由于基質(zhì)效應(yīng)影響所引起的 響應(yīng)信號(hào)的改變。穩(wěn)定同位素標(biāo)記物FDA在生物樣品分析方法確證中對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的規(guī)定凡是使用液質(zhì)建立生物樣品分析方法時(shí)，必須考察基質(zhì)效應(yīng)對(duì)化合物測(cè)定的影響。 當(dāng)基質(zhì)的影響控制在LLOQ的20%以下，這個(gè)方法才能被接受。色譜分析方法驗(yàn)證：準(zhǔn)確度回收率 RE% 98-102%精密度：RSD2%檢測(cè)限LOD：信噪比為3:1時(shí)確定定量限LOQ：信噪比為10:1時(shí)確定分離度評(píng)價(jià)計(jì)算R _ 2（4（2）_ 1 18（4（2）一 一 （2）+%2對(duì)于兩個(gè)等面積峰R=：基本分離R= 1.5：基線分離中華人民共和國藥典要求“除另有規(guī)定，分離度應(yīng)人于1.5化影響因素：門4n ak