(完整word版)高效液相色譜法操作規(guī)程

1、XXXXX藥股份有限公司標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程標(biāo)題：LC-10AVP高效液相色譜標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程生效日期年 月 日頁(yè)次：1/6編號(hào)：SOP-QC-238-01頒發(fā)部門(mén)：質(zhì)量管理部新訂口修訂口原文件號(hào)：編制：部門(mén)審核：QA審核：批準(zhǔn)：分發(fā)部門(mén)：QC。目的：建立高效液相色譜法的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，保證正確操作。范圍：本標(biāo)準(zhǔn)適用于高效液相色譜法的操作。責(zé)任者：QC主任，設(shè)備使用人員。規(guī)程：依據(jù)：中華人民共和國(guó)藥典2000年版二部。1 定義及概述：1.1高效液相色譜法是一種現(xiàn)代液體色譜法,其基本方法是將具一定極性 的單一溶劑或不同比例的混合溶液作為流動(dòng)相，用高壓輸液泵將流動(dòng)相注入 裝有填充劑的色譜柱，注入的供試品被流動(dòng)相

2、帶入柱內(nèi)進(jìn)行分離后，各成分 先后進(jìn)入檢測(cè)器，用記錄儀或數(shù)據(jù)處理裝置記錄色譜留或進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，得 到測(cè)定結(jié)果。由于應(yīng)用各種性質(zhì)的微粒填料和加壓的液體流動(dòng)相，本法具有 分離性能高，分析速度快的特點(diǎn)。1.2高效液相色譜法適用于能在特定填充劑的色譜柱上進(jìn)行分離的藥品 的分析測(cè)定，特別是多組分藥品的測(cè)定、雜質(zhì)檢查和大分子物質(zhì)的測(cè)定。有 的藥品需要在色譜分離前或后經(jīng)過(guò)衍生化反應(yīng)，方能進(jìn)行分離或檢測(cè)。常用 的色譜柱填充劑有：硅膠用于正相色譜；化學(xué)鍵合固定相，根據(jù)鍵合的基團(tuán) 不同可用于反相或正相色譜，其中最常用的是十八烷基硅烷（又稱(chēng)ODS）鍵 合硅膠，可用于反相色譜或離子對(duì)色譜離子交換填料，用于離子交換色譜，

3、 是有一定孔徑的大孔填料，用于排阻色譜。1.3高效液相色譜儀基本由泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器和色譜數(shù)據(jù)處理 機(jī)組成。檢測(cè)器最常用的為可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器或紫外一可見(jiàn)檢測(cè)器。色譜 信息的收集和處理常用積分儀或數(shù)據(jù)工作站進(jìn)行。梯度洗脫，可用兩臺(tái)泵或 單臺(tái)泵加比例閥進(jìn)行程控實(shí)現(xiàn)。2. 高效液相色譜儀的使用要求：標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程標(biāo)題LC-10AVP高效液相色譜標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程頒發(fā)部門(mén)質(zhì)量管理部編號(hào)SOP-QC-238-01頁(yè)次：2/62.1按國(guó)家技術(shù)監(jiān)督局國(guó)家計(jì)量檢定規(guī)程匯編中“實(shí)驗(yàn)室液相色譜儀檢定 規(guī)程 （JJG705-90）”的規(guī)定作定期檢定，應(yīng)符合規(guī)定。2.2,儀器各部件應(yīng)能正常工作，管路為無(wú)死體積連結(jié)，

4、流路中無(wú)堵塞或 漏液，在設(shè)定的檢測(cè)器靈敏度條件下，色譜基線噪音和漂移應(yīng)能滿(mǎn)足分析要 求。2.3具體儀器在使用前應(yīng)詳細(xì)參閱各操作說(shuō)明書(shū)。3. 操作前的準(zhǔn)備：3.1流動(dòng)相的制備：用高純度的試劑配制流動(dòng)相，必要時(shí)照紫外分光光度 法進(jìn)行溶劑檢查，應(yīng)符合要求；水應(yīng)為新鮮制備的高純水。對(duì)規(guī)定PH值的 流動(dòng)相，應(yīng)使用精密PH計(jì)進(jìn)行調(diào)節(jié)。配制好的流動(dòng)相應(yīng)通過(guò)0.45am。適 宜的濾膜濾過(guò)，用前脫氣。應(yīng)配制足量的流動(dòng)相及時(shí)待用。3.2供試溶液的配制：供試品用規(guī)定溶劑配制成供試溶液。定量測(cè)定時(shí), 對(duì)照品溶液和樣品供試溶液均應(yīng)分別配制2份。供試溶液在注入色譜儀前， 一般應(yīng)經(jīng)0.45am適宜的濾膜濾過(guò)。必要時(shí)，在配制

5、供試溶液前，樣品需經(jīng) 提取凈化，以免對(duì)色譜系統(tǒng)產(chǎn)生污染。3.3檢查上次使用記錄和儀器狀態(tài):檢查色譜柱是否適用于本次試驗(yàn)，色 譜柱進(jìn)出口位置是否與流動(dòng)相的流向一致，原保存溶劑與現(xiàn)用流動(dòng)相能否互 溶，流動(dòng)相的PH值與該色譜柱是否相適應(yīng)，儀器是否完好，儀器的各開(kāi)關(guān) 位置是否處于關(guān)斷的位置。4操作：4.1泵的操作；用流動(dòng)相沖洗濾器，再把濾器浸入流動(dòng)相中，啟動(dòng)泵。打開(kāi)泵的排放閥， 用專(zhuān)用注射器從閥口抽出流動(dòng)相約20ml,設(shè)置高流速（9ml/min）或用沖洗 鍵PURGE進(jìn)行充泵排氣，觀察出口處流動(dòng)相呈連續(xù)液流后，將流速逐步回 零或停止（STOP沖洗，關(guān)閉排放閥。4.1.3將流速調(diào)節(jié)至分析用流速，對(duì)色譜柱

6、進(jìn)行平衡，同時(shí)觀察壓力指示 應(yīng)穩(wěn)定，用干燥濾紙片的邊緣檢查柱管各連接處應(yīng)無(wú)滲漏。初始平衡時(shí)間一 般約需30分鐘，如為梯度洗脫，應(yīng)在程序器上設(shè)置梯度狀態(tài)，用初始化比例 的流動(dòng)相對(duì)色譜柱進(jìn)行平衡。4.2紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器和色譜數(shù)據(jù)處理機(jī)的操作。4.2.1開(kāi)啟檢測(cè)器電源開(kāi)關(guān)，選擇光源（氘燈或鎢燈），選定檢測(cè)波長(zhǎng)，標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程標(biāo)題LC-10AVP高效液相色譜標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程頒發(fā)部門(mén)質(zhì)量管理部編號(hào)SOP-QC-238-01頁(yè)次：3/6待穩(wěn)定后，測(cè)試參比和樣品光路的信號(hào)應(yīng)符合要求，設(shè)置吸收度方式和檢測(cè) 響應(yīng)時(shí)間（一般不大于1秒），設(shè)置滿(mǎn)刻度吸收值（適用于記錄儀）。422開(kāi)啟色譜處理機(jī)，設(shè)定處理方法，初步設(shè)定衰減

7、、紙速、記錄時(shí)間、 最小峰面積等參數(shù)，或設(shè)定記錄儀的紙速和衰減。423進(jìn)行檢測(cè)器回零操作，檢查處理機(jī)的電平（LEVEL），應(yīng)符合要求， 或檢查記錄儀的筆應(yīng)處在設(shè)定的起始位置，如有變動(dòng)，可繼續(xù)加零操作直至 符合要求。424記錄基線，待穩(wěn)定后，進(jìn)行處理機(jī)斜率測(cè)試符合要求方能進(jìn)行操作。 4.3進(jìn)樣操作（六通閥式進(jìn)樣器）4.3.1把進(jìn)樣器手柄放在載樣位置（LOAD ）。4.3.2用供試溶液清洗配套的注射器，再抽取適量，如用定量環(huán)（LOOP） 載樣，則注射器抽取量應(yīng)不少于定量環(huán)容積的5倍，用微量注射器定容進(jìn)樣 時(shí)，進(jìn)樣量不得多于環(huán)容積的50%。在排除氣泡后方能向進(jìn)樣器中注入供試 溶液。4.3.3把注射器

8、的平頭針直插至進(jìn)樣器的底部，注入供試溶液，除另有規(guī) 定外，注射器不應(yīng)取下。4.3.4把手柄轉(zhuǎn)至注樣位置（INJECT）,定量環(huán)內(nèi)供試溶液即被流動(dòng)相帶 人流路。4.4色譜數(shù)據(jù)的收集和處理：441注樣的同時(shí)啟動(dòng)數(shù)據(jù)處理機(jī)，開(kāi)始采集和處理色譜信息，如采用記 錄儀，則注樣同時(shí)按一下記號(hào)鍵，作起始記號(hào)。4. A.2最后一峰出完后，應(yīng)繼續(xù)走一段基線，確認(rèn)再無(wú)組分流出，方能結(jié) 束記錄。4.4.3根據(jù)第一張預(yù)試的色譜圖，適當(dāng)調(diào)整各有關(guān)參數(shù)，使色譜峰信號(hào)在 色譜圖上有一定強(qiáng)度。4.4.4含量測(cè)定的對(duì)照溶液和樣品供試液每份至少注樣2次，由全部注樣 結(jié)果（n4）求得平均值，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）應(yīng)不大于1.5%o4

9、.4色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn)應(yīng)符合中國(guó)藥典的要求，如按指定峰計(jì)算的理論 板數(shù)（n）和拖尾因子（T）,分高度（R）以及重復(fù)性。計(jì)算公式為：標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程標(biāo)題LC-10AVP高效液相色譜標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程頒發(fā)部門(mén)質(zhì)量管理部編號(hào)SOP-QC-238-01頁(yè)次：4/6tR(1) n=5.54 ( ) 2Wh/2其中：tR為保留時(shí)間;Wh/2為半高峰寬，取相同單位。Wo.O5(2) t=2di其中:W0.05為離基線5%峰高處的峰寬,di為峰上升邊離5%峰高處的距離。(3) R=(tR2_ tR1) /(W1 +W2)其中：tR1和tR2分別為相鄰前后二峰的保留時(shí)間；W1和W2則分別為其峰 的底寬，t和W取相同單位；

10、W為峰1, 2的半高峰寬。(4)重復(fù)性，取各品種項(xiàng)下對(duì)照溶液，連續(xù)進(jìn)行進(jìn)樣5次，除另有規(guī) 定外，其峰面積測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%。也可按各品種校正因 子項(xiàng)下，配制相當(dāng)于80%、100% 120%的對(duì)照品溶液，加入規(guī)定量的內(nèi)標(biāo) 準(zhǔn)溶液，配成三種不同濃度的溶液，分別進(jìn)樣3次，計(jì)算平均校正因子，其 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差也應(yīng)不大于2.0%。4.測(cè)定結(jié)果處理：4.1峰面積歸一法，按藥品標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)項(xiàng)下進(jìn)行峰面積歸一法求組分含量的 按下式計(jì)算：百分含量C% =刀Ai/刀AX 100%其中：EAi為被測(cè)含量組分峰面積，刀A為參與計(jì)算的全部峰面積之和。4.2內(nèi)標(biāo)法：用含對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的對(duì)照溶液所得色譜峰響應(yīng)

11、值，按下 式算出校正因子(f)：As/msAr/mr標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程標(biāo)題LC-10AVP高效液相色譜標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程頒發(fā)部門(mén)質(zhì)量管理部編號(hào)SOP-QC-238-01頁(yè)次：5/6其中：As和Ar分別為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)和對(duì)照品的峰面積或峰高；ms和mr分別為 加入內(nèi)標(biāo)物質(zhì)和對(duì)照品的量。再根據(jù)含內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液色譜峰響應(yīng)值， 計(jì)算含量(mi)AiMi=f x As/ms其中：Ai和AS分別為供試品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，ms為加入內(nèi)標(biāo)物 質(zhì)的量。4.3外標(biāo)法：用含對(duì)照品的對(duì)照溶液所得色譜峰響應(yīng)值，按下式計(jì)算比值 (r)：r=Cr/Ar其中：Cr和Ar分別為對(duì)照品的濃度和相應(yīng)的峰面積 或峰高。再根據(jù)供試品溶液的

12、色譜峰響應(yīng)值，計(jì)算供試品中被測(cè)成分的濃度(Ci)： Ci=r XAi其中：Ai為供試品溶液中被測(cè)成分的峰面積或峰高。清洗和關(guān)機(jī)：5.1分析完畢后，先關(guān)檢測(cè)器和數(shù)據(jù)處理機(jī)，再用適當(dāng)經(jīng)濾過(guò)和脫氣的溶 劑清洗色譜系統(tǒng)，正相柱一般用正己烷，反相柱如使用過(guò)含鹽流動(dòng)相，則先 用水洗，然后用甲醇一水沖洗，沖洗前先按4.1.14.1.2操作，再用分析流 速?zèng)_洗，各沖洗溶劑一般沖洗15-30分鐘，特殊情況應(yīng)延長(zhǎng)沖洗時(shí)間。5.2沖洗完畢后，逐步降低流速至0,關(guān)泵，進(jìn)樣器也應(yīng)用相應(yīng)溶劑沖洗， 可使用進(jìn)樣閥所附專(zhuān)用沖洗接頭。5.3關(guān)斷電源，作好使用登記，內(nèi)容包括日期、檢品、色譜柱、流動(dòng)相、 柱壓、使用小時(shí)數(shù)、儀器完好

13、狀態(tài)等。6.注意事項(xiàng)：6.1色譜柱與進(jìn)樣器及其出品端與檢測(cè)器之間應(yīng)無(wú)死體積連接，以免試樣 擴(kuò)散影響分離。6.2新住或被污染柱用適當(dāng)溶劑沖洗時(shí)，應(yīng)將其出口端與檢測(cè)器脫開(kāi)，避 免污染。6.3使用的流動(dòng)相應(yīng)與儀器原保存溶劑互溶，如不互溶，則先取下上次的 色譜柱，照4.1.1-4.1.2的方法用異丙醇沖洗過(guò)渡，過(guò)渡完畢后，接上相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程標(biāo)題LC-10AVP高效液相色譜標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程頒發(fā)部門(mén)質(zhì)量管理部編號(hào)SOP-QC-238-01頁(yè)次：6/6的色譜柱，換上本次使用的流動(dòng)相，再按4.1.1順序操作。6.4壓力表無(wú)壓力顯示或壓力波動(dòng)時(shí)不能進(jìn)行分析,應(yīng)檢查泵中氣泡是否 已排除，各連接處有無(wú)漏液，排除故障后

14、方能進(jìn)行操作。如壓力升高，甚至 自動(dòng)停泵，應(yīng)檢查柱端有無(wú)污染堵塞，可小心卸開(kāi)柱的進(jìn)口端螺帽，挖出被 污染填沖劑后，補(bǔ)入同類(lèi)填充劑，仔細(xì)安裝好，再進(jìn)行操作。6.5發(fā)現(xiàn)記錄基線波動(dòng)，出現(xiàn)毛剌等現(xiàn)象，首先應(yīng)檢查檢測(cè)器流通池中是 否有氣泡或污染，如不是流通池引起，可等待氘燈穩(wěn)定，同時(shí)檢查儀器的接 地是否良好，必要時(shí)換上新的氘燈。儀器穩(wěn)定后方能進(jìn)行操作。6.6進(jìn)樣前，色譜柱應(yīng)用流動(dòng)相充分沖洗平衡，如系統(tǒng)適用性并不符合規(guī) 定，或填充劑已損壞，則應(yīng)更換新的同類(lèi)色譜柱進(jìn)行分析，由于同類(lèi)填充劑 的化學(xué)鍵合相的鍵合度及性能等存在一定差異，往往依法操作達(dá)不到預(yù)定的 分離時(shí)，可更換另一牌號(hào)的同類(lèi)色譜柱進(jìn)行試驗(yàn)。6.7以硅膠作載體的化學(xué)鍵合相填充劑的穩(wěn)定性受流動(dòng)相pH值的影響， 使用時(shí)，應(yīng)詳細(xì)參閱說(shuō)明書(shū)，在規(guī)定的pH值范圍內(nèi)選用流動(dòng)相，一般PH 范圍為（2.57.）。使用高PH值流動(dòng)相時(shí)，可在泵與進(jìn)樣器之間連接一硅膠 短柱，