分子生物學(xué)原理：第十章RNA的生物合成

1、目錄目錄 第十章第十章 RNA的生物合成的生物合成 RNA Biosynthesis ( Transcription ) 目錄目錄 潘東寧潘東寧 研究員研究員 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系 代謝與分子醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室代謝與分子醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 東安路東安路130號(hào)號(hào)7號(hào)樓號(hào)樓329 Tel：54237798 Email： 目錄目錄 How Cells Read the Genome: From DNA to Protein DNA encodes hereditary information (genotype) - decoded into RNA

2、 - protein (phenotype) DNA Protein RNA Transcription Translation 目錄目錄 TRANSCRIPTION TRANSLATION DNA Ribosome Polypeptide mRNA Prokaryotic cell 目錄目錄 DNA Pre-mRNA Nuclear envelope mRNA Ribosome Polypeptide TRANSLATION TRANSCRIPTION RNA PROCESSING Prokaryotic cell Eukaryotic cell TRANSCRIPTION TRANSLAT

3、ION DNA mRNA Ribosome Polypeptide 目錄目錄 第一節(jié)第一節(jié) RNARNA合成概述合成概述 轉(zhuǎn)錄模板轉(zhuǎn)錄模板 RNARNA聚合酶聚合酶 第二節(jié)第二節(jié) 原核生物的轉(zhuǎn)錄過程原核生物的轉(zhuǎn)錄過程 原核生物轉(zhuǎn)錄的起始原核生物轉(zhuǎn)錄的起始 原核生物轉(zhuǎn)錄的延長(zhǎng)原核生物轉(zhuǎn)錄的延長(zhǎng) 原核生物轉(zhuǎn)錄的終止原核生物轉(zhuǎn)錄的終止 第三節(jié)第三節(jié) 真核生物真核生物RNARNA的生物合成的生物合成 真核生物轉(zhuǎn)錄的起始真核生物轉(zhuǎn)錄的起始 真核生物轉(zhuǎn)錄的延長(zhǎng)真核生物轉(zhuǎn)錄的延長(zhǎng) 真核生物轉(zhuǎn)錄的終止真核生物轉(zhuǎn)錄的終止 第四節(jié)第四節(jié) 真核生物的轉(zhuǎn)錄后加工真核生物的轉(zhuǎn)錄后加工 第五節(jié)第五節(jié) 微微RNARNA的生

4、物合成的生物合成 目錄目錄 RNA的生物合成的生物合成是指將單核苷酸聚合成核是指將單核苷酸聚合成核 糖核酸鏈的過程，也稱為糖核酸鏈的過程，也稱為轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 (transcription) ， 轉(zhuǎn)錄將轉(zhuǎn)錄將DNA的堿基序列轉(zhuǎn)抄成的堿基序列轉(zhuǎn)抄成RNA序列序列。 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 錄錄 RNADNA 目錄目錄 基因表達(dá)基因表達(dá) (gene expression) 是新合成的是新合成的 RNA進(jìn)一步參與、指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的過程，使進(jìn)一步參與、指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的過程，使 生物體的遺傳信息從基因的儲(chǔ)存狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣ど矬w的遺傳信息從基因的儲(chǔ)存狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣?作狀態(tài)作狀態(tài), 基因表達(dá)也包含基因表達(dá)也包含RNA的生物合成的生物合

5、成。 目錄目錄 RNA合成概述合成概述 第一節(jié)第一節(jié) 目錄目錄 在生物界，在生物界，RNARNA合成有兩種方式：合成有兩種方式： 一是一是DNA指導(dǎo)的指導(dǎo)的RNA合成（合成（DNA-dependent RNA synthesis)，也叫，也叫轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄。此為生物體內(nèi)主要的合成方式。此為生物體內(nèi)主要的合成方式。 另一種是另一種是RNA指導(dǎo)的指導(dǎo)的RNA合成合成(RNA-dependent RNA synthesis)，也叫，也叫RNA復(fù)制復(fù)制(RNA replication)。常見于。常見于 RNA病毒。病毒。 一、一、RNARNA合成方式合成方式 目錄目錄 n參與轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)：參與轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)： 原

6、料原料: : NTP (ATP, GTP, CTP, UTP) 模板模板: : DNA 酶酶 : : RNA聚合酶聚合酶(RNA polymerase, RNA pol) 其他蛋白質(zhì)因子其他蛋白質(zhì)因子 合成方向合成方向: : 5 35 3 目錄目錄 二、轉(zhuǎn)錄模板與聚合酶二、轉(zhuǎn)錄模板與聚合酶 （一）、轉(zhuǎn)錄模板（一）、轉(zhuǎn)錄模板 DNA雙鏈中按堿基配對(duì)規(guī)律能指引轉(zhuǎn)錄生成雙鏈中按堿基配對(duì)規(guī)律能指引轉(zhuǎn)錄生成RNA 的一股單鏈，稱為的一股單鏈，稱為模板鏈模板鏈(template strand)，也稱，也稱 作作Watson鏈鏈。相對(duì)的另一股單鏈?zhǔn)恰Ｏ鄬?duì)的另一股單鏈?zhǔn)欠悄０彐湻悄０彐?(nontemplat

7、e strand)，也稱為，也稱為編碼鏈編碼鏈(coding strand) 、或或Crick鏈鏈。 目錄目錄 目錄目錄 / 轉(zhuǎn)錄模板及其轉(zhuǎn)錄過程轉(zhuǎn)錄模板及其轉(zhuǎn)錄過程 目錄目錄 DNA分子上能轉(zhuǎn)錄出分子上能轉(zhuǎn)錄出RNA的區(qū)段，稱為的區(qū)段，稱為結(jié)構(gòu)基結(jié)構(gòu)基 因因(structural gene)。 轉(zhuǎn)錄是以轉(zhuǎn)錄是以不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄(asymmetric transcription) 的方式完成的，它有兩方面含義：一是某個(gè)基因的方式完成的，它有兩方面含義：一是某個(gè)基因 的的DNA雙鏈中，只有一股鏈可作為模板指引轉(zhuǎn)雙鏈中，只有一股鏈可作為模板指

8、引轉(zhuǎn) 錄；二是基因組錄；二是基因組DNA雙鏈均可作為模板，并不雙鏈均可作為模板，并不 只限于某一條鏈。只限于某一條鏈。 目錄目錄 （二）（二）RNA pol DNA依賴的依賴的RNA聚合酶聚合酶(DNA-dependent RNA polymerase)催化合成催化合成RNA； RNA合成的化學(xué)機(jī)制與合成的化學(xué)機(jī)制與DNA依賴的依賴的DNA聚合酶聚合酶 催化催化DNA合成相似。合成相似。 RNA pol的催化機(jī)制的催化機(jī)制 ( NMP )n + NTP ( NMP ) n+1 + PPi 目錄目錄 1. 原核生物原核生物RNA pol 目錄目錄 核心酶核心酶 (core enzyme) 全酶全

9、酶 (holoenzyme) 轉(zhuǎn)錄起始階段轉(zhuǎn)錄起始階段轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)階段轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)階段 w w 目錄目錄 RNARNA聚合酶聚合酶核心酶核心酶(core enzymes)(core enzymes)：大腸埃希：大腸埃希 菌的菌的RNA RNA polpol是由是由5 5種亞基種亞基2, , 2, , , w , w 和和 組組 成的六聚體蛋白，其中成的六聚體蛋白，其中2 2 (w)w)亞基組成亞基組成 的五聚體稱為核心酶。核心酶可以催化轉(zhuǎn)錄的五聚體稱為核心酶。核心酶可以催化轉(zhuǎn)錄 中中RNARNA鏈的延長(zhǎng)。鏈的延長(zhǎng)。 全酶全酶( (holoenzymeholoenzyme): ):核心酶加上核心酶加上

10、亞基稱為全酶亞基稱為全酶 ，全酶能與特定的起始位點(diǎn)結(jié)合并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，全酶能與特定的起始位點(diǎn)結(jié)合并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄 。 目錄目錄 n 真核生物具有真核生物具有3種不同的種不同的RNA聚合酶聚合酶: RNA聚合酶聚合酶（RNA Pol） RNA聚合酶聚合酶（RNA Pol） RNA聚合酶聚合酶（RNA Pol ） 2 2、真核生物、真核生物RNA RNA PolPol 目錄目錄 3種真核生物種真核生物RNA Pol都是超過都是超過500,000的大分子的大分子 蛋白質(zhì)，大約由蛋白質(zhì)，大約由12個(gè)亞基組成，其中有個(gè)亞基組成，其中有2個(gè)大亞個(gè)大亞 基和若干小亞基?；腿舾尚喕?。 酶分子中某些亞基與大腸埃希菌酶

11、分子中某些亞基與大腸埃希菌RNA pol核心酶核心酶 亞基的序列有同源性。亞基的序列有同源性。 目錄目錄 羧基末端結(jié)構(gòu)域羧基末端結(jié)構(gòu)域 (carboxyl-terminal domain, CTD) 真核生物真核生物RNA Pol RNA Pol 最大亞基的羧基末端有一最大亞基的羧基末端有一 段共有序列為段共有序列為Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser重復(fù)序列重復(fù)序列 片段。片段。 這一序列僅存在于這一序列僅存在于RNA Pol IIRNA Pol II中。中。 所有真核生物的所有真核生物的RNA Pol IIRNA Pol II都具有都具有CTDCTD，只是共有序列，只是共

12、有序列 的重復(fù)程度不同。的重復(fù)程度不同。 磷酸化和去磷酸化的磷酸化和去磷酸化的CTDCTD在轉(zhuǎn)錄不同階段發(fā)揮作用。在轉(zhuǎn)錄不同階段發(fā)揮作用。 目錄目錄 原核生物的轉(zhuǎn)錄過程原核生物的轉(zhuǎn)錄過程 The Process of Transcription in Prokaryote 第二節(jié)第二節(jié) 目錄目錄 （一）啟動(dòng)子（一）啟動(dòng)子 操縱子操縱子(operon)是原核生物中一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的轉(zhuǎn)是原核生物中一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的轉(zhuǎn) 錄區(qū)段，包括若干個(gè)基因的編碼區(qū)及其上游錄區(qū)段，包括若干個(gè)基因的編碼區(qū)及其上游 (upstream)的調(diào)控序列。的調(diào)控序列。 轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游的調(diào)控序列中有一段特定的序轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游的調(diào)控序列中

13、有一段特定的序 列可被列可被RNA pol識(shí)別并結(jié)合，稱為識(shí)別并結(jié)合，稱為啟動(dòng)子啟動(dòng)子 (promoter)。 5 3 3 5 結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因調(diào)控序列調(diào)控序列 RNA-pol 一、原核生物轉(zhuǎn)錄的起始一、原核生物轉(zhuǎn)錄的起始 目錄目錄 目錄目錄 調(diào)控序列中的啟動(dòng)子是調(diào)控序列中的啟動(dòng)子是RNA聚合酶結(jié)合模板聚合酶結(jié)合模板DNA 的部位，也是控制轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵部位。原核生物以的部位，也是控制轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵部位。原核生物以 RNA聚合酶全酶結(jié)合到聚合酶全酶結(jié)合到DNA的啟動(dòng)子上而起動(dòng)轉(zhuǎn)的啟動(dòng)子上而起動(dòng)轉(zhuǎn) 錄，其中由錄，其中由亞基辨認(rèn)啟動(dòng)子，其他亞基相互配合。亞基辨認(rèn)啟動(dòng)子，其他亞基相互配合。 對(duì)啟動(dòng)子的研究，

14、常采用一種巧妙的方法即對(duì)啟動(dòng)子的研究，常采用一種巧妙的方法即RNA pol保護(hù)法保護(hù)法。 目錄目錄 nRNA pol 保護(hù)法保護(hù)法 n用用RNA聚合酶保護(hù)法研究轉(zhuǎn)錄起始區(qū)聚合酶保護(hù)法研究轉(zhuǎn)錄起始區(qū) 啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu) 目錄目錄 0 25 50 75 100 Frequency of nucleotides at each position (%) G A T C TTAGCATATAAT 15-19 nucleotides-35-10 目錄目錄 共有序列：共有序列：原核生物基因各操縱子轉(zhuǎn)錄上游區(qū)段的序原核生物基因各操縱子轉(zhuǎn)錄上游區(qū)段的序 列有一致性，列有一致性，-35-35區(qū)的共有序列是

15、區(qū)的共有序列是TTGACATTGACA，-10-10區(qū)的共區(qū)的共 有序列是有序列是TATAATTATAAT，又名又名PribnowPribnow盒（盒（PribnowPribnow box)box)。 識(shí)別序列識(shí)別序列: : -35-35區(qū)是原核生物轉(zhuǎn)錄起始時(shí)區(qū)是原核生物轉(zhuǎn)錄起始時(shí)RNA polRNA pol的識(shí)別的識(shí)別 序列，一旦序列，一旦RNA polRNA pol識(shí)別并與此序列結(jié)合后即向下游移識(shí)別并與此序列結(jié)合后即向下游移 動(dòng)至動(dòng)至PribnowPribnow盒，形成相對(duì)穩(wěn)定的酶盒，形成相對(duì)穩(wěn)定的酶-DNA-DNA復(fù)合物而開始復(fù)合物而開始 轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄。 目錄目錄 轉(zhuǎn)錄起始是指轉(zhuǎn)錄起始是指

16、RNA pol識(shí)別并結(jié)合到識(shí)別并結(jié)合到DNA 模板上，然后模板上，然后DNA 雙鏈局部解開，再加入第雙鏈局部解開，再加入第 1個(gè)個(gè)NTP形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的過程。形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的過程。 （二）轉(zhuǎn)錄起始（二）轉(zhuǎn)錄起始 目錄目錄 2. DNA雙鏈局部解開，形成雙鏈局部解開，形成開放轉(zhuǎn)錄復(fù)合物開放轉(zhuǎn)錄復(fù)合物 (open transcription complex) ；在；在RNA聚合酶聚合酶 作用下發(fā)生第一次聚合反應(yīng)，形成首個(gè)磷酸二作用下發(fā)生第一次聚合反應(yīng)，形成首個(gè)磷酸二 酯鍵：酯鍵： 1. RNA聚合酶全酶依賴聚合酶全酶依賴 因子因子與啟動(dòng)子結(jié)合，形與啟動(dòng)子結(jié)合，形 成成閉合轉(zhuǎn)錄復(fù)合物閉合轉(zhuǎn)錄

17、復(fù)合物(closed transcription complex) ； 5 -pppG -OH + NTP 5 -pppGpN - OH 3 + ppi n轉(zhuǎn)錄起始過程：轉(zhuǎn)錄起始過程： n大腸埃希菌轉(zhuǎn)錄的起始、延長(zhǎng)及終止過程大腸埃希菌轉(zhuǎn)錄的起始、延長(zhǎng)及終止過程 目錄目錄 轉(zhuǎn)錄全過程，轉(zhuǎn)錄全過程，DNA模板解鏈范圍通常是模板解鏈范圍通常是17+1。 與復(fù)制不同，轉(zhuǎn)錄起始無需引物。與復(fù)制不同，轉(zhuǎn)錄起始無需引物。 第一個(gè)磷酸二酯鍵生成后，第一個(gè)磷酸二酯鍵生成后，亞基即從轉(zhuǎn)錄起亞基即從轉(zhuǎn)錄起 始復(fù)合物上脫落，核心酶連同始復(fù)合物上脫落，核心酶連同5-pppGpN- OH-3，繼續(xù)結(jié)合于，繼續(xù)結(jié)合于DNA

18、模板上，酶沿模板上，酶沿DNA 鏈前移，進(jìn)入延長(zhǎng)階段。鏈前移，進(jìn)入延長(zhǎng)階段。 轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物：轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物： RNA-pol ( 2) - DNA - pppGpN- OH 3 目錄目錄 復(fù)制復(fù)制轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 模板模板兩股鏈均復(fù)制兩股鏈均復(fù)制模板鏈轉(zhuǎn)錄（不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄）模板鏈轉(zhuǎn)錄（不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄） 原料原料dNTPNTP 酶酶DNA聚合酶聚合酶RNA聚合酶聚合酶 產(chǎn)物產(chǎn)物子代雙鏈子代雙鏈DNA (半保留復(fù)制半保留復(fù)制) 單鏈單鏈RNA 配對(duì)配對(duì)A-T, G-CA-U, T-A, G-C 引物引物需要需要不需要不需要 復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的比較復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的比較 目錄目錄 二、二、 原核生物轉(zhuǎn)錄的延長(zhǎng)原核生物轉(zhuǎn)錄的延

19、長(zhǎng) 1. 亞基脫落，亞基脫落，RNA pol核心酶變構(gòu)，與模板結(jié)核心酶變構(gòu)，與模板結(jié) 合松弛，沿著合松弛，沿著DNA模板前移；模板前移； 2. 在在核心酶核心酶作用下，作用下，NTP不斷聚合，不斷聚合，RNA鏈鏈 不斷延長(zhǎng)。不斷延長(zhǎng)。 (NMP) n + NTP (NMP) n+1 + PPi RNA pol-DNA-RNA轉(zhuǎn)錄復(fù)合物（轉(zhuǎn)錄空泡）轉(zhuǎn)錄復(fù)合物（轉(zhuǎn)錄空泡） 配對(duì)的方式和穩(wěn)定性配對(duì)的方式和穩(wěn)定性: GCA=TA=U 目錄目錄 目錄目錄 n原核生物轉(zhuǎn)錄過程中的共翻譯現(xiàn)象原核生物轉(zhuǎn)錄過程中的共翻譯現(xiàn)象 在同一在同一DNA模板上，有多個(gè)轉(zhuǎn)錄同時(shí)在進(jìn)行；模板上，有多個(gè)轉(zhuǎn)錄同時(shí)在進(jìn)行； 轉(zhuǎn)錄尚

20、未完成，翻譯已在進(jìn)行。轉(zhuǎn)錄尚未完成，翻譯已在進(jìn)行。 這種形狀說明：這種形狀說明： 目錄目錄 n原核生物轉(zhuǎn)錄過程中的共翻譯現(xiàn)象原核生物轉(zhuǎn)錄過程中的共翻譯現(xiàn)象 目錄目錄 依賴依賴Rho 因子的轉(zhuǎn)錄終止因子的轉(zhuǎn)錄終止 非依賴非依賴Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止因子的轉(zhuǎn)錄終止 三、原核生物轉(zhuǎn)錄三、原核生物轉(zhuǎn)錄 的終止的終止 n依據(jù)是否需要蛋白質(zhì)因子的參與，原核生物依據(jù)是否需要蛋白質(zhì)因子的參與，原核生物 轉(zhuǎn)錄終止分為：轉(zhuǎn)錄終止分為： 目錄目錄 （一）（一） 不依賴不依賴 因子的轉(zhuǎn)錄終止因子的轉(zhuǎn)錄終止 此種轉(zhuǎn)錄終止方式無需外加因子參與，此種轉(zhuǎn)錄終止方式無需外加因子參與， 核心酶能在特定位點(diǎn)上停止轉(zhuǎn)錄，這些位點(diǎn)核心酶

21、能在特定位點(diǎn)上停止轉(zhuǎn)錄，這些位點(diǎn) 被稱為內(nèi)源性終止子（被稱為內(nèi)源性終止子（intrinsic terminator)。 目錄目錄 5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3 5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3 RNA 5 TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT. 3 DNA (coding strand) UUUU. UUUU. 5UUGCAGCCUGACAA

22、AUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3 結(jié)構(gòu)特征結(jié)構(gòu)特征1：DNA模板靠近轉(zhuǎn)錄終止處有回文結(jié)模板靠近轉(zhuǎn)錄終止處有回文結(jié) 構(gòu)，能形成發(fā)夾構(gòu)，能形成發(fā)夾(hairpin)結(jié)構(gòu)，且富含結(jié)構(gòu)，且富含GC配對(duì)。配對(duì)。 目錄目錄 結(jié)構(gòu)特征結(jié)構(gòu)特征2：DNA 模板轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)有高模板轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)有高 度保守的度保守的3A重復(fù)序列重復(fù)序列 ，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的 3末端常有末端常有6個(gè)以上連個(gè)以上連 續(xù)的續(xù)的U，與發(fā)夾結(jié)構(gòu)一，與發(fā)夾結(jié)構(gòu)一 起阻止轉(zhuǎn)錄繼續(xù)進(jìn)行起阻止轉(zhuǎn)錄繼續(xù)進(jìn)行. 目錄目錄 原核生物轉(zhuǎn)錄終止蛋白，原核生物轉(zhuǎn)錄終止蛋白，有有ATP酶活性

23、和解酶活性和解 螺旋酶螺旋酶(helicase)的活性。的活性。在依賴在依賴r r因子的轉(zhuǎn)因子的轉(zhuǎn) 錄終止中需要錄終止中需要r r因子參與。因子參與。 因子是由相同亞基組成的六聚體蛋白質(zhì)，因子是由相同亞基組成的六聚體蛋白質(zhì)， 亞基分子量亞基分子量46kD。 因子能結(jié)合因子能結(jié)合RNA，又以對(duì)，又以對(duì)poly C的結(jié)合力的結(jié)合力 最強(qiáng)。最強(qiáng)。 （二）依賴（二）依賴因子的轉(zhuǎn)錄終止因子的轉(zhuǎn)錄終止 n因子：因子： 目錄目錄 rut位點(diǎn)：新合成的RNA在轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)上游出現(xiàn)富含C的序列, 能夠被r因子識(shí)別和結(jié)合，促使轉(zhuǎn)錄終止。 n依賴依賴因子的轉(zhuǎn)錄終止因子的轉(zhuǎn)錄終止 r r因子到達(dá)轉(zhuǎn)錄空泡將因子到達(dá)轉(zhuǎn)錄空

24、泡將RNARNA水水 解下來這一過程，發(fā)揮了解下來這一過程，發(fā)揮了ATPATP 酶活性及酶活性及ATPATP依賴性依賴性RNA-RNA- DNADNA解旋酶活性。解旋酶活性。 目錄目錄 目前認(rèn)為，目前認(rèn)為，因子終止轉(zhuǎn)錄的作用是：與因子終止轉(zhuǎn)錄的作用是：與RNA轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 錄產(chǎn)物結(jié)合，結(jié)合后錄產(chǎn)物結(jié)合，結(jié)合后因子和因子和RNA聚合酶都可發(fā)聚合酶都可發(fā) 生構(gòu)象變化，從而使生構(gòu)象變化，從而使RNA聚合酶停頓，解螺旋聚合酶停頓，解螺旋 酶的活性使酶的活性使DNA/RNA雜化雙鏈拆離，利于產(chǎn)物雜化雙鏈拆離，利于產(chǎn)物 從轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中釋放從轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中釋放 。 目錄目錄 轉(zhuǎn)錄，模板，模板鏈，編碼鏈，不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄

25、，模板，模板鏈，編碼鏈，不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄 原核生物原核生物RNA Pol：核心酶和全酶：核心酶和全酶, 因子因子 真核生物真核生物RNA Pol：I, II, III, 羧基末端結(jié)構(gòu)域羧基末端結(jié)構(gòu)域 (CTD) 原核生物轉(zhuǎn)錄過程：原核生物轉(zhuǎn)錄過程： 目錄目錄 真核生物真核生物RNARNA的生物合成的生物合成 The Process of Transcription in Eukaryote 第三節(jié)第三節(jié) 目錄目錄 真核生物真核生物RNA Pol不能直接與模板不能直接與模板DNA結(jié)合，結(jié)合， 需要輔助因子協(xié)助。需要輔助因子協(xié)助。 真核生物真核生物DNA模板位于核內(nèi)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物必須轉(zhuǎn)模板位于核內(nèi)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物

26、必須轉(zhuǎn) 運(yùn)出核外才能作為翻譯模板。運(yùn)出核外才能作為翻譯模板。 真核生物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物必須經(jīng)過加工才能成為有功真核生物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物必須經(jīng)過加工才能成為有功 能的產(chǎn)物。能的產(chǎn)物。 n真核生物基因序列示意圖真核生物基因序列示意圖: 目錄目錄 真核生物轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游真核生物轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-25區(qū)常有共同的區(qū)常有共同的 TATAAAA序列，稱為序列，稱為TATA盒盒(TATA box)， 與轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)一起形成與轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)一起形成核心啟動(dòng)子核心啟動(dòng)子。 轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)序列也稱為轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)序列也稱為起始子起始子 (initiator, Inr)。 一、真核生物轉(zhuǎn)錄的起始一、真核生物轉(zhuǎn)錄的起始 目錄目錄 目錄目錄 啟動(dòng)子上

27、游元件啟動(dòng)子上游元件是位于是位于TATA盒上游的盒上游的DNA序列，序列， 多在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游約多在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游約-40-100nt的位置，比較的位置，比較 常見的是常見的是GC盒和盒和CAAT盒。盒。 增強(qiáng)子增強(qiáng)子(enhancer)是能夠結(jié)合特異基因調(diào)節(jié)蛋白，是能夠結(jié)合特異基因調(diào)節(jié)蛋白， 促進(jìn)鄰近或遠(yuǎn)隔特定基因表達(dá)的促進(jìn)鄰近或遠(yuǎn)隔特定基因表達(dá)的DNA序列。序列。 真核生物轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游具有調(diào)控轉(zhuǎn)錄功能的真核生物轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游具有調(diào)控轉(zhuǎn)錄功能的 DNA序列，如啟動(dòng)子，啟動(dòng)子上游元件和增強(qiáng)子序列，如啟動(dòng)子，啟動(dòng)子上游元件和增強(qiáng)子 等，這些序列統(tǒng)稱為等，這些序列統(tǒng)稱為順式作用元件順式作用元件(

28、cis-acting element)。 目錄目錄 UAS = upstream activator sequence RE = regulatory elements INR = initiator sequence DPE = downstream promoter elements 目錄目錄 （一）（一） 轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子 能直接或間接識(shí)別和結(jié)合啟動(dòng)子順式作用元件，能直接或間接識(shí)別和結(jié)合啟動(dòng)子順式作用元件， 以參與或調(diào)控真核生物轉(zhuǎn)錄起始過程的蛋白質(zhì)以參與或調(diào)控真核生物轉(zhuǎn)錄起始過程的蛋白質(zhì) 稱為稱為轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子(transcriptional factor, TF), 也稱也稱 為為反

29、式作用因子反式作用因子(trans-acting factors)。 反式作用因子中，直接或間接結(jié)合反式作用因子中，直接或間接結(jié)合RNA Pol的，的， 則稱為則稱為通用轉(zhuǎn)錄因子通用轉(zhuǎn)錄因子(general transcriptional factors, TF)。 目錄目錄 上游因子上游因子（upstream factor): 真核基因的轉(zhuǎn)錄起真核基因的轉(zhuǎn)錄起 始過程中有一些與啟動(dòng)子上游原件如始過程中有一些與啟動(dòng)子上游原件如GC盒，盒， CAAT盒等順式作用原件結(jié)合的蛋白質(zhì)。盒等順式作用原件結(jié)合的蛋白質(zhì)。 可誘導(dǎo)因子可誘導(dǎo)因子（inducible factor): 在某些特殊生理在某些特殊生

30、理 或病理情況下被誘導(dǎo)產(chǎn)生的反式作用因子，參與或病理情況下被誘導(dǎo)產(chǎn)生的反式作用因子，參與 調(diào)控真核基因的轉(zhuǎn)錄起始過程。調(diào)控真核基因的轉(zhuǎn)錄起始過程。 目錄目錄 起始子起始子 TATATATA盒盒 核心啟動(dòng)子核心啟動(dòng)子 GCGC盒盒 CAATCAAT盒盒 啟動(dòng)子上啟動(dòng)子上游元件游元件 （近端）（近端） 增強(qiáng)子增強(qiáng)子遠(yuǎn)端調(diào)控序列遠(yuǎn)端調(diào)控序列 順式作用原件順式作用原件 ciscis-acting element-acting element 上游因子上游因子 可誘導(dǎo)因子可誘導(dǎo)因子 轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子 oror 反式作用因子反式作用因子 transtrans-acting factor-acting fa

31、ctor 通用轉(zhuǎn)錄因子通用轉(zhuǎn)錄因子 oror 基本轉(zhuǎn)錄因子基本轉(zhuǎn)錄因子 參與參與RNA-pol轉(zhuǎn)錄起始的轉(zhuǎn)錄起始的TF 目錄目錄 型基因中的四類轉(zhuǎn)錄因子型基因中的四類轉(zhuǎn)錄因子 轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子 具體組分具體組分 結(jié)合序列結(jié)合序列 功能功能 基本組分基本組分 TBP,TFA,B, E,G,F和和H TBP結(jié)合結(jié)合 TATA盒盒 轉(zhuǎn)錄起始定位；轉(zhuǎn)錄起始定位； 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 錄起始和延長(zhǎng)錄起始和延長(zhǎng) 輔激活因子輔激活因子 TAFs和中介和中介 子子 在可誘導(dǎo)因子和上游在可誘導(dǎo)因子和上游 因子與通用轉(zhuǎn)錄因子因子與通用轉(zhuǎn)錄因子 /RNA聚合酶結(jié)合中聚合酶結(jié)合中 起聯(lián)結(jié)和中介作用起聯(lián)結(jié)和中介作用 上游因子上游因子

32、 SP1、ATF、 CTF等等 啟動(dòng)子上游啟動(dòng)子上游 元件元件 協(xié)助通用轉(zhuǎn)錄因子，協(xié)助通用轉(zhuǎn)錄因子， 提高轉(zhuǎn)錄效率和專一提高轉(zhuǎn)錄效率和專一 性性 可誘導(dǎo)因子可誘導(dǎo)因子 如如MyoD、 HIF-1等等 增強(qiáng)子等遠(yuǎn)增強(qiáng)子等遠(yuǎn) 隔調(diào)控序列隔調(diào)控序列 時(shí)間和空間（組織）時(shí)間和空間（組織） 特異性地調(diào)控轉(zhuǎn)錄特異性地調(diào)控轉(zhuǎn)錄 TBP: TATA binding protein; TAF: TBP associated factor 目錄目錄 目錄目錄 （二）（二） 轉(zhuǎn)錄起始轉(zhuǎn)錄起始 真核生物真核生物RNA-pol不與不與DNA分子直接結(jié)合，分子直接結(jié)合， 而需依靠眾多的轉(zhuǎn)錄因子，形成而需依靠眾多的轉(zhuǎn)錄因子

33、，形成轉(zhuǎn)錄前起始復(fù)合轉(zhuǎn)錄前起始復(fù)合 物物(pre-initiation complex, PIC) 。 nRNA pol II 催化的催化的 轉(zhuǎn)錄過程轉(zhuǎn)錄過程 TFIIHTFIIH具有解旋酶和蛋白激酶活性，具有解旋酶和蛋白激酶活性， 使使CTDCTD磷酸化磷酸化 目錄目錄 二二 、真核生物轉(zhuǎn)錄的延長(zhǎng)、真核生物轉(zhuǎn)錄的延長(zhǎng) 真核生物轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)過程與原核生物大致相似，真核生物轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)過程與原核生物大致相似， 但因有核膜相隔，沒有轉(zhuǎn)錄與翻譯同步的現(xiàn)象。但因有核膜相隔，沒有轉(zhuǎn)錄與翻譯同步的現(xiàn)象。 需要延長(zhǎng)因子協(xié)助。需要延長(zhǎng)因子協(xié)助。 RNA Pol前移處處都遇上核小體。前移處處都遇上核小體。 轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)過程

34、中可以觀察到核小體移位和解聚轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)過程中可以觀察到核小體移位和解聚 現(xiàn)象?，F(xiàn)象。 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 錄錄 延延 長(zhǎng)長(zhǎng) 中中 的的 核核 小小 體體 移移 位位 目錄目錄 RNA-Pol RNA-Pol RNA-Pol nucleosome moving direction 目錄目錄 三、真核生物轉(zhuǎn)錄的終止三、真核生物轉(zhuǎn)錄的終止 真核生物的轉(zhuǎn)錄終止，是和轉(zhuǎn)錄后修飾密切相真核生物的轉(zhuǎn)錄終止，是和轉(zhuǎn)錄后修飾密切相 關(guān)的。關(guān)的。 真核生物真核生物mRNA有聚腺苷酸有聚腺苷酸(poly A)尾巴結(jié)構(gòu)，尾巴結(jié)構(gòu)， 是轉(zhuǎn)錄后才加進(jìn)去的。是轉(zhuǎn)錄后才加進(jìn)去的。 轉(zhuǎn)錄不是在轉(zhuǎn)錄不是在poly A的位置上終止，而是超出數(shù)的位

35、置上終止，而是超出數(shù) 百個(gè)乃至上千個(gè)核苷酸后才停頓。已發(fā)現(xiàn)，在百個(gè)乃至上千個(gè)核苷酸后才停頓。已發(fā)現(xiàn)，在 讀碼框架的下游，常有一組共同序列讀碼框架的下游，常有一組共同序列AATAAA， 再下游還有相當(dāng)多的再下游還有相當(dāng)多的GT序列。這些序列稱為序列。這些序列稱為 轉(zhuǎn)錄終止的修飾點(diǎn)轉(zhuǎn)錄終止的修飾點(diǎn)。 n真核生物的轉(zhuǎn)錄終止及加尾修飾真核生物的轉(zhuǎn)錄終止及加尾修飾 目錄目錄 RNA RNA PolPol沒有校對(duì)功能的沒有校對(duì)功能的3-53-5核酸外切酶活核酸外切酶活 性，因此轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中發(fā)生差錯(cuò)比復(fù)制多。由于一性，因此轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中發(fā)生差錯(cuò)比復(fù)制多。由于一 個(gè)基因可轉(zhuǎn)錄出多個(gè)個(gè)基因可轉(zhuǎn)錄出多個(gè)RNA,RNA,

36、且轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有一定的半且轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有一定的半 壽期，最終會(huì)被清除，故轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的差錯(cuò)對(duì)細(xì)胞壽期，最終會(huì)被清除，故轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的差錯(cuò)對(duì)細(xì)胞 的影響比復(fù)制少得多。的影響比復(fù)制少得多。 目錄目錄 Cold-inducible Zfp516 activates UCP1 transcription to promote browning of white fat and development of brown fat. Molecular Cell, 2015, 57, 235. Reporter AssayReporter Assay 熒光素酶報(bào)告基因分析熒光素酶報(bào)告基因分析 目錄目錄 Chromatin

37、Chromatin ImmunoprecipitationImmunoprecipitation 染色質(zhì)免疫沉淀染色質(zhì)免疫沉淀 ( (ChIPChIP) ) Gel Shift AssayGel Shift Assay ElectrophoreticElectrophoretic Mobility Shift Assay Mobility Shift Assay 電泳遷移率改變分析電泳遷移率改變分析 Molecular Cell, 2015, 57, 235. 目錄目錄 真核生物的轉(zhuǎn)錄后加工真核生物的轉(zhuǎn)錄后加工 Post-transcriptional Modification of Euka

38、ryotic RNA 第四節(jié)第四節(jié) 目錄目錄 真核生物轉(zhuǎn)錄生成的真核生物轉(zhuǎn)錄生成的RNA分子是初級(jí)分子是初級(jí)RNA轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 錄物錄物(primary RNA transcript)，幾乎所有的初，幾乎所有的初 級(jí)級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄物都要經(jīng)過加工，才能成為具有功轉(zhuǎn)錄物都要經(jīng)過加工，才能成為具有功 能的成熟的能的成熟的RNA。 加工主要在細(xì)胞核中進(jìn)行。加工主要在細(xì)胞核中進(jìn)行。 目錄目錄 一、一、mRNA的轉(zhuǎn)錄后加工的轉(zhuǎn)錄后加工 （一）（一）5-端的修飾端的修飾 大多數(shù)真核大多數(shù)真核mRNA的的5-末端有末端有7-甲基鳥嘌呤甲基鳥嘌呤 的帽結(jié)構(gòu)。的帽結(jié)構(gòu)。 這個(gè)真核這個(gè)真核mRNA加工過程的起始步驟由加工過程

39、的起始步驟由5-帽帽 合成酶合成酶(capping enzyme)催化完成，它是由催化完成，它是由鳥鳥 苷酸轉(zhuǎn)移酶（苷酸轉(zhuǎn)移酶（guanylytransferase)和和甲基轉(zhuǎn)移甲基轉(zhuǎn)移 酶酶(methyltransferase) 形成的復(fù)合體，與形成的復(fù)合體，與RNA Pol的的CTD末端相結(jié)合。末端相結(jié)合。 目錄目錄 n5-帽結(jié)構(gòu)：帽結(jié)構(gòu)： 5帽合成酶：鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶 鳥嘌呤-7-甲基轉(zhuǎn)移酶 n5-帽結(jié)構(gòu)的合成：帽結(jié)構(gòu)的合成： n5-帽結(jié)構(gòu)在帽結(jié)構(gòu)在CTD 末端合成：末端合成： cap-binding protein 目錄目錄 n帽子結(jié)構(gòu)的意義：帽子結(jié)構(gòu)的意義： 可以使可以使mRNA免遭核酸

40、酶的攻擊；免遭核酸酶的攻擊； 與帽結(jié)合蛋白質(zhì)復(fù)合體與帽結(jié)合蛋白質(zhì)復(fù)合體(cap-binding complex of protein)結(jié)合，并參與結(jié)合，并參與mRNA和核糖體的結(jié)合，和核糖體的結(jié)合， 啟動(dòng)蛋白質(zhì)的生物合成。啟動(dòng)蛋白質(zhì)的生物合成。 目錄目錄 尾部修飾是和轉(zhuǎn)錄終止同時(shí)進(jìn)行的過程。尾部修飾是和轉(zhuǎn)錄終止同時(shí)進(jìn)行的過程。 poly A的有無與長(zhǎng)短，是維持的有無與長(zhǎng)短，是維持mRNA作為翻譯模作為翻譯模 板的活性，以及增加板的活性，以及增加mRNA本身穩(wěn)定性的因素。本身穩(wěn)定性的因素。 一般真核生物在胞漿內(nèi)出現(xiàn)的一般真核生物在胞漿內(nèi)出現(xiàn)的mRNA，其，其poly A 長(zhǎng)度為長(zhǎng)度為100至至2

41、00個(gè)核苷酸之間，也有少數(shù)例外。個(gè)核苷酸之間，也有少數(shù)例外。 （二）（二）3-poly (A)的添加的添加 真核真核mRNA 3-poly(A)的生成過程的生成過程 聚腺苷酸化特異性因子，CPSF 斷裂激動(dòng)因子，CStF 斷裂因子I/II，CF I/II 多聚腺苷酸聚合酶， PAP 多聚腺苷酸結(jié)合蛋白II，PAB II 目錄目錄 目錄目錄 DNA分子上能轉(zhuǎn)錄出分子上能轉(zhuǎn)錄出RNA的區(qū)段，稱為的區(qū)段，稱為結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因 (structural gene)。 斷裂基因斷裂基因(splite gene)： 真核生物結(jié)構(gòu)基因由若干真核生物結(jié)構(gòu)基因由若干 個(gè)外顯子和內(nèi)含子互相間隔連接而成，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物個(gè)

42、外顯子和內(nèi)含子互相間隔連接而成，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 去除內(nèi)含子再連接后，可轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒烊コ齼?nèi)含子再連接后，可轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒靘RNAmRNA，后者，后者 才能作為翻譯模板，這樣的基因稱為斷裂基因。才能作為翻譯模板，這樣的基因稱為斷裂基因。 CABD 外顯子外顯子 A、B、C、D 內(nèi)含子內(nèi)含子 （三）（三）mRNA的剪接與剪切的剪接與剪切 目錄目錄 外顯子外顯子(exon)和內(nèi)含子和內(nèi)含子(intron) 外顯子：外顯子：在真核生物初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及成熟在真核生物初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及成熟mRNA 中均出現(xiàn)的核酸序列。中均出現(xiàn)的核酸序列。 內(nèi)含子：內(nèi)含子：真核生物基因中隔斷基因的線性表達(dá)而真核生物基因中隔斷基因的線性表達(dá)而

43、 在剪接過程中被除去的核酸序列。在剪接過程中被除去的核酸序列。 卵卵 清清 蛋蛋 白白 基基 因因 及及 其其 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 錄、錄、 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 錄錄 后后 加加 工工 目錄目錄 雞卵清蛋白成熟雞卵清蛋白成熟mRNA與與DNA雜交電鏡圖雜交電鏡圖 DNA mRNA 目錄目錄 目錄目錄 mRNA的剪接的剪接 除去除去hnRNAhnRNA中的內(nèi)含子，將外顯子連接。中的內(nèi)含子，將外顯子連接。 剪接中的二次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)剪接中的二次轉(zhuǎn)酯反應(yīng) 目錄目錄 snRNP: mRNA剪接是在剪接體上進(jìn)行的，它是剪接是在剪接體上進(jìn)行的，它是 一種核內(nèi)特異的一種核內(nèi)特異的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體蛋白質(zhì)復(fù)合體,稱為核小核稱為核小核 糖核蛋白顆粒。糖核蛋白顆粒。 每一種每一種snRNP含有一種核小含有一種核小RNA（small nuclear RNA,