解淀粉芽孢桿菌PEBA20生物膜表型特征及其與抑菌活性的關(guān)系匯總

1、山東農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文解淀粉芽抱桿菌peba20物膜表型特征及其與抑菌活性的關(guān)系姓名：范素素申請學位級別：碩士專業(yè)：森林保護指導教師：劉振宇2011-06-02山東農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文中文摘要植物病害生防細菌的研究是生物防治領(lǐng)域的研究熱點，但是生防菌的應用卻受到防 治效果不穩(wěn)定、抑菌活性易下降甚至喪失的限制，這在很大程度上與人工培養(yǎng)條件改變 了其自然屬性有關(guān)。同時也有越來越多的證據(jù)表明，在自然生境下，大多數(shù)微生物是以 生物膜(biofilm)形式而不是浮游形式存在，微生物生活史中的大部分是在生物膜的狀 態(tài)下完成的?；谏鲜鰞牲c，本實驗對一株楊樹內(nèi)生生防菌 bacillus amyloliqu

2、efaciens peba20進 行了生物膜表型特征的測定，并研究了與生防細菌抗菌活性的相關(guān)性。首先對peba20的野生型菌株 peba20-w0314的生物膜表型進行了系統(tǒng)闡述。 peba20-w0314在na固體平板上培養(yǎng)5d時，其生物膜表型為 鳥巢狀”，向四周擴展 范圍較小，向上隆起明顯，為近圓形；peba20-w0314在nb液體培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)48h 時，其生物膜表型為致密，堅固，完整，表面有波浪狀紋理。對實驗室規(guī)則人工繼代過程中生物膜表型與抑菌活性的變化進行同步檢測的結(jié)果 顯示：整個過程約以第9代為分界，在第9代之前其生物膜表型及抑菌活性的變化較緩 慢，而在第9代之后生物膜表型和抑

3、菌活性均開始發(fā)生顯著變化。截止至第 9代， peba20對玉米小斑病菌(bipolaris maydis)、蘋果腐爛病菌(valsa mali)、楊樹潰瘍病菌 (botryosphaeria dothidea)和禾谷絲核菌(rizoctonia cerealis)的抑菌率僅依次下降了 9.1%、13.2%、5.4%和2.4% 。而其生物膜表型的變化也是從第 9代開始發(fā)生顯著變化： 前期單菌落類型呈多樣化，共先后出現(xiàn) 8類菌落類型，而后期單菌落類型逐漸減少，最 后只保留2種具有截然不同特性的單菌落；同時在氣-液界面形成生物膜的厚度與堅固 性也呈逐漸下降趨勢。表明野生型生防菌株w0314在實驗室長

4、期繼代保存時會發(fā)生生物膜表型與抑菌活性的同步變化，且兩者變化規(guī)律存在相關(guān)性。對于peba20不同生物膜狀態(tài)下發(fā)酵液抑菌活性的檢測，同時進行了皿內(nèi)實驗和楊樹愈傷組織上對楊樹潰瘍病 菌的抑制實驗。比較了 w0314和nm0705的生物膜表型和抑菌活性，結(jié)果顯示：與 w0314相比， nm0705的單菌落平坦，擴展面積較大，在氣-液界面成膜較稀薄，堅固性差，生物膜半 定量法檢測顯示nm0705成膜菌的數(shù)量約為 w0314的1/2。同時nm705的抑菌活性相 對w0314其抑菌活性也顯著下降，對四種指示病原真菌的菌絲生長抑制率分別下降了589.3%, 56.9%, 38.5%, 92.3%。對 nm0

5、705 進行 16srrna 和 tasa 基因的鑒定，測序結(jié) 果顯示：nm0705的該兩段序列與其野生株 w0314相比相似度為99%,為進一步利用 該菌株進行生物膜特性的研究奠定了基礎(chǔ)，保證了菌株生物膜表型特征不同、但菌株種 類同一的準確性。關(guān)鍵詞：解淀粉芽抱桿菌；生物膜；表型；抑菌活性；相關(guān)性abstractresearches on bacteria with bio-control acticity has become a hot topic about the biological control, but it s application was confined due to

6、 the unstable of the antibacterialactivity .this can be attributable to the difference environment between laboratory culture and natural conditions to a great degree. there are also increasing evidence demonstrate that, in natural habitats, most microbes exist as biofilm rather than as plankton. mo

7、st time of the microbial life is under the condition of biofilm.based on the above two points, this experiment is about the relationship between the biofilm phenotype and antibacterial activities of a single bacillus amyloliquefaciens bacterial strain peba20 which is isolated from poplar.at first, w

8、e elaborated the biofilm phenotype of peba20-w0314 systematically. when cultivated on na solid medium for 5 days, the biofilm phenotype of peba20-w0314 liked the “ bird s nest ” . they didn t expand to a large space, heaved skyward obviously and were sub-orbicular. when cultivated in nb liquid mediu

9、m for 2 days statically, the biofilm phenotype of peba20-w0314 was compact, strong, integrity and had wave-like pattern on the surface.the result of artificial subculture showed that the whole process could be separated by f9. the biofilm phenotype and antibacterial activity changed slowly during th

10、e early stage. but obvious changes appeared during the later stage. by the time of f9, the antibacterial activity of peba20 against bipolaris maydis 、valsa mali、botryosphaeria dothidea and rizoctonia cerealis descended 9.1% 13.2%、5.4% and 2.4% respectively. also, the change of biofilm phenotype beca

11、me obviously after f9. the diversity of single colonies was notable but this feature turned into inconspicuous during the later stage. there are 8 kinds of single colonies before f9, but developed into 2 kinds which had distinct feathers from each other. meanwhile, the thickness and sturdiness desce

12、nded gradually. the above results showed that the biofilm phenotype and antibacterial activity of the wild biocontrol bacteria w0314 changed synchronously during subculture in laboratory, the law of there change had relevance. the detections about antibacterial activity against b. dothidea of peba20

13、 with differentbiofilm phenotype was carried on both petri dish and poplar callus.we compared the biofilm phenotype and antibacterial activity of w0314 and nm0705. the results showed that, compared with w0314, nm0705 had smoother but larger single colonies. the biofilm formed on the liquid gas inter

14、face was thinner and fertilizer. half quantitative method detection showed that the amount of bacteria individuals of nm0705 was about the one half of w0314. meanwhile, the antibacterial activity of nm0705 also descended. the inhibition rates of hypha growth against the four plantpathogenicfungi dec

15、lined by 89.3%, 56.9%, 38.5% and 92.3% respectively. the result of nucleotide sequence analysis of 16srrna and tasa from nm0705 which root in our laboratory by repeatedly subculture shows that the sequence similarity between w0314 and nm0705 is 99%. the above results formed the foundation for more r

16、each on biofilm feature by peba20. the result also given evidence about same strain presented different biofilm phenotype.key words: bacillus amyloliquefaciens ; biofilm; phenotype; antibacterial activity; correlation英文縮略詞及中文對照表英文縮寫英文全稱中文名稱edtasdstemed trispcr x-galiptgrnaseebamp oddntp te min sec m

17、ln l0c6-ba2,4-dethylene diamine tetraacetic acid sodium dodecyl sulfate tetramethyl ethylene diamine tris droxymethy aminomethane polymerase chain reaction5-bromo-4-chloro-3-indolyl- &d- galactosideisopropylthio- &d-galactoside ribounclease ethidium bromide ampicillinoptical densitydeoxyribonucleosi

18、de triphoshatetris/edta bufferminutesecondmicrolitermillilitercentigrade6-benzylaminopurine2,4-dichlorophenoxy已二胺四乙酸十二烷基硫酸鈉四甲基乙二胺二羥甲基氨基甲烷 聚合酶鏈反應5-澳-4-氯-3引珠-b -d-半乳糖 甘異丙基硫代-b-d-半乳糖甘核糖核酸酶澳化乙錠氨卞青毒素光密度脫氧核甘三磷酸t(yī)ris/edta緩沖液分鐘秒毫升微升攝氏度6-基喋吟2, 4-二氯苯氧乙酸酯i關(guān)于學位論文原創(chuàng)性和使用授權(quán)的聲明本人所呈交的學位論文，是在導師指導下，獨立進行科學研究所取得 的成果。對在論文

19、研究期間給予指導、幫助和做出重要貢獻的個人或集體, 均在文中明確說明。本聲明的法律責任由本人承擔。本人完全了解山東農(nóng)業(yè)大學有關(guān)保留和使用學位論文的規(guī)定，同意學 校保留和按要求向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文紙質(zhì)本和電子版，允許論 文被查閱和借閱。本人授權(quán)山東農(nóng)業(yè)大學可以將本學位論文的全部或部分 內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或其他復制手段保存 論文和匯編本學位論文，同時授權(quán)中國科學技術(shù)信息研究所將本學位論文 收錄到中國學位論文全文數(shù)據(jù)庫，并向社會公眾提供信息服務。保密論文在解密后應遵守此規(guī)定。論文作者簽名：導師簽名：日期：山東農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文1 .弓i言越來越多的證據(jù)表明，在自

20、然條件下，大多數(shù)微生物是以生物膜( biofilm)形式存 在，而不是以浮游狀態(tài)存在，微生物生活史中的大部分是在生物膜的狀態(tài)下完成的。1.1 細菌生物膜研究概況1.1.1 細菌生物膜的概念在自然生境下，大多數(shù)微生物是以生物膜(biofilm)形式存在，而不是以浮游狀態(tài) 存在，微生物生活史中的大部分是在生物膜的狀態(tài)下完成的。細菌生物膜是菌體附著到生物或者非生物物體表面后分泌粘性胞外聚合物并在其 中生長繁殖而形成的細菌群落，是一個連續(xù)、組成成分復雜、具有三維結(jié)構(gòu)和信息傳遞 系統(tǒng)的復雜的細菌群體(shapiro 1998; costerton et al. 1999; ram et al. 2005

21、; stewart and franklin 2008)。1.1.2 細菌生物膜的形成動態(tài)現(xiàn)在已經(jīng)知道，與浮游狀態(tài)的細菌相比，生物膜狀態(tài)下細菌啟動一套完全不同的基 因系統(tǒng)，二者的生理狀態(tài)顯著不同。生物膜多細胞結(jié)構(gòu)的形成是一個動態(tài)過程，包括細 菌起始粘附、生物膜粘附期(attachment)生長期(development)、成熟期(maturation)和 播散期(detachment污階段。細菌感受環(huán)境信號激發(fā)生活方式發(fā)生改變開始形成生物膜 (fletcher 1976; stanley 1983; wang et al. 1996; palmer and white 1997; wimpen

22、ny and cofasanti 1997; otoole and kolter 1998; pratt and kolter 1998; stoodley et al. 1999; watnick and kolte 1999; otoole et al. 2000)。對宿主表面的粘附是細菌在宿主體內(nèi)形成 生物膜的第一步。這種粘附作用主要是細菌表面特定的粘附素蛋白識別宿主表面受體的 結(jié)果，因此具有選擇性和特異性。宿主組織表面的蛋白、糖蛋白和糖脂?？勺鳛槭荏w， 而選擇性地吸附特定種類的細菌。palmer和white概述生物膜形成的早期階段包括細胞 與表面及細胞與細胞之間的相互作用，而后才發(fā)展成

23、為成熟的生物膜(palmer and white1997)。前人研究認為，簡單的化學模型可以解釋菌體初始粘附階段的行為(palmer andwhite 1997)。盡管這些相互作用對細胞與表面之間的互作做出了貢獻，然而這些過程是 比較復雜的。例如，可能許多參與粘附過程的生物膜細菌在各階段則具有不同的生理生 化特性，有不同的基因表達與調(diào)控，基因在各階段起到不同的作用 (kobayashi 2007; monds and otoole 2009)。形成生物膜對細菌有諸多益處，最重要的是抵御不良環(huán)境的 侵害(davey and otoole 2000)。1.1.3 細菌生物膜的特征生物膜在最近十年成

24、為了微生物研究的一個熱點領(lǐng)域，因為形成這一結(jié)構(gòu)后，聚集 成團的群體細胞能夠具有類似多細胞組織的功能及特性(shapiro 199$ ,同時，生物膜實際上是一個微小生境，該生境與周圍環(huán)境可能有著明顯的區(qū)別，從而使其中的細胞 展現(xiàn)出區(qū)別于游離細胞的特性 (davey and o toole 2000目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)生物膜是微生 物在自然界中的主要存在形式。和浮游細胞的表型特征明顯不同的是細菌生物膜具備三維結(jié)構(gòu)。胞外聚合物是生物膜的標志性特征，其主要成分是胞外聚多糖(exopolysaccharide、tasa蛋白和dna。 由15個連續(xù)的基因組成 epsa-o操縱子負責胞外聚多糖的形成，分泌蛋白tas

25、a由yqxm-sipw-tasa操縱子控制合成(branda et al. 2006; vlamakis et al. 2008)。胞外聚合物 不僅是細菌生物膜的結(jié)構(gòu)組分和胞外基質(zhì)的骨架，而且參與了細菌結(jié)構(gòu)形成、侵染、對 外界刺激應答反應等很多重要生物學功能。1.1.4 調(diào)控生物膜形成的相關(guān)基因生物膜的形成是一個復雜過程，涉及多個基因、多個細胞因子，以及微生態(tài)環(huán)境中 細菌之間的相互作用。近年來，采用 dna微矩陣、突變體等研究手段，對一些醫(yī)學致 病菌，包括 escherichia coli, pseudomonas aeruginosa vibrio cholerae, streptococc

26、ussp., staphylococcussp., candida sp.等的生物膜形成的分子機制開展了大量研究，不少種類 細菌已經(jīng)揭示出生物膜形成相關(guān)基因及其調(diào)控回路的基本框架(lazazzera 2005; stewartand franklin 2008)。枯草芽抱桿菌(b. subtilis)是重要的生防因子，也是一種模式細菌?；?b. subtilis 168菌株生物膜形成的調(diào)控機制的基礎(chǔ)上，科學家目前發(fā)現(xiàn) b. subtilis生物膜形成過程 存在6個基因調(diào)節(jié)子，即 abrb、spo0a、立ccpa、degu和sinr。其中spo0a, sigh和degu是正調(diào)控因子，而abrb

27、, ccpa和sinr為負調(diào)控因子。spo0a調(diào)節(jié)細菌穩(wěn)定期的生物行為，包括生物膜形成、芽抱形成等，其調(diào)控的基因 表達具有劑量的依賴性(fujita et al. 2005)。abrb阻遏spo0a基因的活化，而 spo0a則 抑制abrb的基因轉(zhuǎn)錄，spo0a調(diào)控生物膜形成的功能受到 abrb轉(zhuǎn)錄的抑制。另外， abrb抑制了 yqxm-sipw-tasa操縱子的轉(zhuǎn)錄，而tasa是細菌生物膜胞外聚合物的主要 蛋白成分(branda 2006; verhammeet al. 2009)。degu是控制細菌生物膜形成的關(guān)鍵基因，一個正調(diào)控因子，目前，degu的調(diào)控靶標已經(jīng)被鑒定，包括 poly-

28、t-glutamic acid、yuab 和 yvca 等(stanley and lazazzera 2005; murray et al. 2009)。在細菌的雙組分 degs-degu信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)中，degs是膜相關(guān)組 氨酸激酶(membrane-associatedhistidine kinase)感受外界信號，degu是細胞質(zhì)響應調(diào) 節(jié)子(cytoplasmic response regulator) degu經(jīng)磷酸化作用后，調(diào)控一系列的基因轉(zhuǎn)錄來 調(diào)控細胞反應，包括運動性、簇集性、胞外蛋白酶分泌，以及生物膜的胞外聚合物的合 成、菌膜和菌落復雜結(jié)構(gòu)的形成等，degu的突變體不能形成完

29、整的生物膜(stanley and lazazzera 2005; brandaet al. 2006; kobayashi 2007; verhamme et al. 2007; verhamme et al. 2009)。然而，關(guān)于degu中生物膜形成中的作用并沒有完全清晰。sinr是一個負調(diào)控子，對yqxm-sipw-tasa操縱子和epsa-o操縱子起著直接的負調(diào) 控作用,sinr的缺失會形成多皺的生物膜 (kearns et al. 2005; chu et al. 2006)。而sinr 介導的阻遏作用受到sini轉(zhuǎn)錄調(diào)控。sini是一種小肽，它通過結(jié)合到sinr上而抑制sinr

30、的蛋白活性。sinr還是某些鞭毛基因轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控因子，因此，人們推論sini/r系統(tǒng)是支配細菌從浮游態(tài)轉(zhuǎn)變成為生物膜狀態(tài)的主要調(diào)控系統(tǒng)(kobayashi 2008)。但是，它們在生物膜形成過程中的精確作用尚需要進一步研究。細菌從浮游狀態(tài)轉(zhuǎn)變成為生物膜形式經(jīng)歷了一個非常深刻的變化，其基因的表達具有不同于浮游態(tài)細菌的獨特格局(vilainand brzel 2006; verhammeet al. 2009)。關(guān)于枯草芽抱桿菌的生物膜相關(guān)基因的調(diào)控網(wǎng)絡如圖1所示(jared 2009。51ex* pperon叫口$ opnron4 * . r.事:，-rerna / 工remb:f tasa j

31、 fps *酊時im圖1枯草芽抱桿菌生物膜形成相關(guān)基因調(diào)控網(wǎng)絡fig 1 model of b. subtilis biofilm matrix operon regulation.1.1.5 群體感應機制從浮游狀態(tài)到細菌生物膜，細菌經(jīng)歷了從低密度到高密度、從無組織狀態(tài)到有組織狀 態(tài)的過程。在細菌完成了表面附著后，細菌群體感應機制就在生物膜的形成中發(fā)揮重要的 作用。群體感應(quorum sensing)是細菌根據(jù)細胞密度變化進行基因表達調(diào)控的一種生 理行為，具有群體感應的細菌能產(chǎn)生并釋放稱為自體誘導物(autoinducer)的信號分子,它隨著細胞密度的增加而增加，當積累到一定閾值時可與調(diào)控

32、蛋白結(jié)合從而啟動細菌中 特定基因的表達。細菌細胞通過群體感應信號分子與周圍環(huán)境進行信息交流，從而改變 其生理活性，如共生、細菌毒性、運動性、抱子及生物膜的形成等。現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)許多細菌 利用該系統(tǒng)調(diào)控體內(nèi)特定的功能，如根瘤菌與植物共生(wisniewski and downie 2002), 藍細菌中異形胞的分化(yoon and goldenj 1998),芽胞桿菌中感受態(tài)與芽胞的形成 (lazazzera 2001)病原細菌胞外酶與毒素產(chǎn)生(von 2003),次生代謝物hcn、胞外蛋白 酶、幾丁質(zhì)酶、抗生素形成等(pierson 1994; pierson 1996; wood 1997; l

33、eonid 1998;whistler 2003)功能都受到細菌群體感應信號系統(tǒng)所調(diào)節(jié)，其中多種功能具有生防作用。1.1.6 細菌生物膜研究現(xiàn)狀近十年來，在醫(yī)學上，生物膜狀態(tài)下的細菌因為具有更強的毒力、耐藥性和對抗宿 主免疫防御的能力而備受關(guān)注；在工業(yè)上，也因為細菌生物膜的食品污染、管道腐蝕等， 引起人們重視；在農(nóng)業(yè)上，人們逐漸認識到病原細菌的侵染與生物膜關(guān)系密切。作為致 病因子和環(huán)境損害因素，細菌生物膜起著關(guān)鍵和特殊作用的事實已經(jīng)被科學家所公認， 激發(fā)人們對細菌生物膜的關(guān)注達到了前所未有的高度并仍有上升趨勢(danhorn andfuqua 2007; stewart and frankli

34、n 2008; vlamakiset al. 2008; monds and otoole 2009。但 是現(xiàn)在關(guān)于細菌生物膜的研究主要集中于醫(yī)學領(lǐng)域，對于植物相關(guān)細菌尤其是植物病害 生防菌生物膜的研究甚少。1.2 生防菌的生物膜形成與抗菌活性的關(guān)系目前對于生防菌的研究主要集中在桿菌中，在首先被用于防治害蟲和病原物的生防 因子中就有桿菌屬的成員(powell and jutsum 1993; bais and vivanco 2004。1.2.1 生防菌中芽抱桿菌的研究現(xiàn)狀美國迄今已有4株枯草芽抱桿菌生防菌株獲得環(huán)保局(epa)商品化或有限商品化生 產(chǎn)應用許可，它們是gb03,mbi600 ,

35、 qst713和解淀粉枯草芽抱桿菌變種(b. subtilis var.amyloliquefaciens fzb24)。gb03 0品名為 kodiak)和 mbi600 (商品名為 subtilex)分 別由美國gustafson公司和microbio ltd 公司開發(fā)，根部施用或拌種可防治鐮刀菌屬 (fusarium)、曲霉屬(aspergillus)、鏈格抱屬(alternaria)和絲核菌屬(rhizoctonia)引 起的豆類、麥類、棉花和花生的根部病害。2001年gustafson又將解淀粉枯草芽抱桿菌和枯草芽抱桿菌混合制成混合生防藥劑，稱為 bioyield。taensa公司生

36、產(chǎn)的fzb24,作 為植物促長劑被商品化生產(chǎn)，商品名 taegrotm,施用于溫室或室內(nèi)栽培樹苗、灌木和裝 飾植物根部可防治鐮刀菌和絲核菌引起的枯萎病和根腐病。止匕外，澳大利亞開發(fā)的 b. subtilis a-13對麥類和胡蘿卜立枯病以及其他土傳病害具有很好的防治和增產(chǎn)作用 (baker 1987)。日本東京技術(shù)研究所的 b. subtilis rb 14 和 b. subtilis nb22 分別對 r. solani, f. oxysporum和p. solancearum,引起的番茄病害有良好的防效 (asaka 1996)。中國利用芽抱桿菌防治植物病害的應用研究也達到了世界先進水平，

37、現(xiàn)已開發(fā)成功并投入生產(chǎn)的商品制劑有亞寶、百抗、麥豐寧、紋曲寧等。江蘇省農(nóng)業(yè)科學院陳志誼等 人研究獲得了對多種病原菌有強烈抑制作用、防治水稻紋枯病的效果達50%81%的b.subtilis b-916菌株(陳志誼等，2003 )。謝棟等(1998)分離到枯草芽抱桿菌 (b. subtilis) bs-98能強烈抑制蘋果輪紋病菌(p. piricola)等植物病原真菌的拮抗菌。范青等 (2000) 從北京蘋果園土壤中分離的枯草芽抱桿菌b-912防治柑桔青霉病、綠霉病均取得較好的抑制效果。林東等(2001)發(fā)現(xiàn)枯草芽抱桿菌(b. subtilis ) s0113對水稻白葉枯病菌(xanthomona

38、s oryzaepv.oryza8具有強烈的抑菌作用。何紅等(2002)發(fā)現(xiàn)來自辣椒體 內(nèi)的枯草芽抱桿菌(b. subtilis) bs-1和bs-2菌株對香蕉炭疽病菌菌絲生長、 分生抱子形 成及萌發(fā)等有較強的抑制作用。目前，芽抱桿菌作為生防菌仍存在許多問題。大多數(shù)芽抱桿菌的生防研究總體上還 處于實驗室階段。在生產(chǎn)應用時，由于易受土壤溫濕度、ph值、作物生長狀況及土壤中生態(tài)系統(tǒng)等微環(huán)境因素的影響，防效不穩(wěn)，因此，影響了芽抱桿菌的大面積推廣應用。1.2.2 芽抱桿菌生物膜形成與芽抱形成的關(guān)系長久以來，人們將芽抱形成作為區(qū)別細菌的依據(jù)，但是在單個細胞的研究中，它也 具有重要意義(masaaki 2

39、006)。一個控制抱子形成的后期階段的基因，sspe ,被證實 在枯草芽抱桿菌生物膜中空結(jié)構(gòu)的末端顯著表達(branda 2001另外，dna結(jié)合蛋白 spo0a是細胞從營養(yǎng)生長期進入芽抱形成時期的關(guān)鍵應答調(diào)節(jié)(master response regulator)蛋白，細胞是否開始形成芽抱最終由內(nèi)外環(huán)境條件來決定，內(nèi)外界環(huán)境是否 適宜開始形成芽抱最終反映為 spo0a的含量和磷酸化水平。只有當spo0a的含量和磷 酸化水平達到一定閾值，芽抱才開始形成。影響芽抱形成的外界因素主要是細胞密度和 營養(yǎng)狀態(tài)(hibert and piggot 2004)。而spo0a基因在枯草芽抱桿菌中已被證實是調(diào)控

40、 生物膜形成的關(guān)鍵基因，并與枯草芽抱桿菌6051中表面活性素的分泌有關(guān)(bais et al.2004; schweitzer 2008)。在芽抱形成過程中，spo0asfp, yveq口 yver, spo0h,是四個關(guān)鍵基因，spo0a抑制 abrb的表達，它結(jié)合abrb的啟動子(hamon and lazazzera 2001)而sigma-h可能直接 抑制abrb的表達，刺激生物膜的形成，因為已知 sigma-h可以激活spo0a (predich et al. 1992)。進一步試驗表明，編碼一個堿性蛋白酶的基因apre和一個二肽酶的基因dppa/b/c/d/e均受abrb的調(diào)控，而

41、胞外蛋白酶活性，包括apre和npre,已被證明對菌體 聚集和生物膜的形成是必需的(connelly et al. 2004)。1.2.3 芽抱桿菌生物膜形成及抗菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生在植物根圍，枯草芽抱桿菌可以促進植物生長并起到生物防治的作用(emmert andhandelsman 1999)。最近的研究表明生物膜模式對細菌作為生物防治因素起著至關(guān)重要 的作用(bais and vivanco 2004)。這種抗菌作用的機制還不明確，但是我們已經(jīng)知道枯 草芽抱桿菌可以產(chǎn)生多種抗菌因子。其中包括多種脂肽類化合物，比如枯草菌脂肽就是 一種重要的表面活性素，它對維持生物膜的中空結(jié)構(gòu)也用重要作用(bra

42、nda 2001)。bais等人曾經(jīng)報道枯草芽抱桿菌 6051對丁香假單胞菌的生防作用與根系表面枯草菌脂肽的 形成有關(guān)(bais and vivanco 2004綜合現(xiàn)有的資料，枯草芽抱桿菌 6051生物膜中產(chǎn)生 的枯草脂肽可以用來防止浮游細胞及其他微生物在植物根系等生物表面定殖。masaaki認為，在根部定植時，枯草芽抱桿菌6051形成穩(wěn)定的大規(guī)模的生物膜，并且分泌枯草脂肽，這兩種因素均對致病細菌對植物的侵染起抵抗作用(masaaki 2006)。bais等人發(fā)現(xiàn)作為革蘭氏陽性生防細菌的 b. subtilis能夠在植物根際形成強大的生物膜而抑制其它 微生物的定殖與侵入，同樣革蘭氏陰性生防細

43、菌pseudomonas fluorescen也具有這種特性(bais et al. 2004; ongenaet al. 2005; danhorn and fuqua 2007; schweitzeet al. 2008)。 bais等(2004)和schweitzer等(2008)證實，b. subtilis 6051能夠在植物根際以生物 膜形式定殖，并分泌具有殺菌作用的表面活性肽surfactin, surfactin與細菌生物膜的形成有關(guān)，它由由磷酸泛酰琉基乙胺基轉(zhuǎn)移酶(pptase)的編碼基因sfp控制，而sfp由細菌生物膜形成的關(guān)鍵調(diào)控子 spo0a所調(diào)控。1.3 生防細菌生物膜

44、表型與其抗菌活性的關(guān)系目前尚沒有直接證據(jù)表明生防細菌生物膜的形成與其抗菌活性具有相關(guān)性。但是， 人體、動物、植物致病菌生物膜的研究證實，生物膜狀態(tài)下的細菌比浮游狀態(tài)下細菌具 有更強大的毒力和致病性，毒力因子的產(chǎn)生與細菌生物膜的形成具有相關(guān)性(danhornand fuqua 2007; stewart and franklin 2008; monds and otoole 2009 因此理論上，可以 形成假設(shè)：生防菌生物膜形成與拮抗活性有相關(guān)性。而近來的研究也證實了這個假設(shè)。眾所周知，在實驗室內(nèi)，很多微生物分離物在持續(xù)搖瓶培養(yǎng)的情況下，會停止產(chǎn)生 抗菌化合物，并且有研究發(fā)現(xiàn)野生型枯草芽抱桿菌形

45、成的生物膜比多次次培養(yǎng)之后的實 驗室菌株強壯，而且它依賴于胞外抗菌脂肽表面活性素的產(chǎn)生。其主要原因應該歸咎于 人工培養(yǎng)條件很大不同于自然環(huán)境(natural environment)。科學家發(fā)現(xiàn)，設(shè)置培養(yǎng)條件， 將菌株在形成生物膜的狀態(tài)下培養(yǎng)，b. subtilis和b. pumilus能夠產(chǎn)生在浮游狀態(tài)下所不 能產(chǎn)生的一些復雜的抗菌化合物，能夠恢復在浮游狀態(tài)下不斷培養(yǎng)而喪失的產(chǎn)生抗生素 的能力(yan et al. 2003; bruhn et al. 2007)。生防菌株在生產(chǎn)上的實際應用效果往往不夠穩(wěn)定，其根本原因尚在于生防菌所釋放 環(huán)境的復雜性，影響了生防菌的定殖、生長、發(fā)育，以及活性

46、物質(zhì)的產(chǎn)生、釋放和作用， 而諸多證據(jù)表明，生物膜狀態(tài)下的細菌更有利于其生防能力的發(fā)揮，因此，可以通過模 擬其自然狀態(tài)的生物膜格局，使生防菌形成有益的抗生素類次生代謝產(chǎn)物，更有利于其 定殖并發(fā)揮抗病作用。1.4 本研究的目的意義植物內(nèi)生生防菌，因為其具有特殊的生活生境、更穩(wěn)定和持久的作用效果、產(chǎn)生特 殊活性代謝產(chǎn)物等特征，已經(jīng)成為國內(nèi)外生物防治研究的熱點( chao et al. 2007; conn et al. 2008)。生物膜是細菌更適應于自然界中的一個決定性策略。長期以來，科學家僅 對浮游細菌進行研究，卻忽視了細菌生物膜研究。因此，在生物膜框架下開展研究，必 將促進人們對細菌更深刻的了

47、解，甚至得到前所未見的信息。解淀粉芽抱桿菌是否也具有生物膜現(xiàn)象。目前尚未見相關(guān)研究報道。從生物膜角度 入手，探討生物膜狀態(tài)下解淀粉芽抱桿菌 peba20的特征，也許能夠獲得研究浮游狀態(tài) 下細菌所未顯現(xiàn)的原本的自然屬性， 而這些自然屬性，對了解peba20的生防活性存在 重要意義。本實驗室已經(jīng)較系統(tǒng)地研究了楊樹內(nèi)生細菌的內(nèi)生生態(tài)特征，發(fā)現(xiàn)和篩選得到了具有良好生防潛力的菌株，并測定了楊樹內(nèi)生解淀粉芽抱桿菌 peba20的分類學、生物學、 生理學等特性，測定了其活體和發(fā)酵液對楊樹潰瘍病的作用效果，證實該菌株是具有很 大應用潛力的楊樹內(nèi)生生防細菌。本研究就是著眼于作為一種對楊樹潰瘍病具有良好生防潛力的

48、內(nèi)生細菌，解淀粉芽抱桿菌peba20的生物膜與其抗菌活性的相關(guān)性，這對利用生物膜發(fā)揮其在植物病害防 治中的作用具有重要意義。2.材料與方法2.1 供試材料2.1.1 菌株2.1.1.1 生防細菌本研究中所用生防菌株 peba20為本實驗室分離的一株對多種植物病原細菌和真 菌具有良好抑菌效果的楊樹內(nèi)生解淀粉芽抱桿菌(bacillus amyloliquefaciens),將其野生型菌株命名為peba20-w0314,另外一株經(jīng)實驗室不規(guī)則繼代保存后產(chǎn)生的生物膜表型 自然突變株命名為peba20-nm0705。2.1.1.2 指示植物病原菌供試真菌菌種：楊樹水泡潰瘍病菌(b. dothidea)、

49、禾谷絲核菌(r. cerealis)、蘋 果腐爛病菌(v. mali)均為本實驗室保存。供試細菌菌種：白菜軟腐病菌(erwinia carotovora )、煙草青枯病菌 (ralstoniasolanacearum)、馬鈴薯環(huán)腐病菌 (clavibacter sepedonicum)均為本實驗室保存。2.1.21口刁下百號nb培養(yǎng)基：牛肉浸膏 3.0g、蛋白陳10.0g、nacl 15g、蒸儲水1000ml,調(diào)ph至 7.2。na培養(yǎng)基：牛肉浸膏3.0g、蛋白陳10.0g、nacl 15g、瓊脂15g、蒸儲水1000ml, 調(diào)ph至7.2。pda培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0g、葡萄糖15.0g、

50、瓊脂15.0g、蒸儲水1000ml。lb培養(yǎng)基：胰蛋白凍10g,酵母抽提物5g, nacl 10g,蒸儲水1000ml,調(diào)ph至 7.2。ms 培養(yǎng)基：kno3 1.9g nh4no3 1.65g、kh2po3 0.17g、mgso4 - 7h2o 0.37g cacl2 - 2h2o 0.44g ki 0.00083g、h3bo3 0.0062g、mnso4 - 4ho 0.0223g、znso4 7ho0.0086。na2mno4 2ho 0.00025g、cuso4 5ho 0.000025g、c0ci2 - 6ho 0.000025g、 edta 0.0373g、feso4 7h2o

51、0.0278g 肌醇 0.1g、甘氨酸 0.002g、鹽酸硫胺素(vbi) 0.0005g 鹽酸叱哆醇(vb6)0.0005g、煙酸(vb5) 0.0005g、蔗糖 30g、6-ba 0.0005g、 2,4-d 0.002g、去離子水1000ml、瓊脂8g,調(diào)節(jié)ph值至5.8。ms培養(yǎng)基母液配制見表 1。表1 ms培養(yǎng)基母液試劑用量table 1. the agentia of the medium ms stock solution試劑名稱用量（g）體積（ml）大里兀系（10x）kno3 191000nh4no3 161000kh2p5 1.710007水硫酸鎂（100x）mgso4 7h

52、2o 371000微量元素母液（100x）ki 0.0831000h3bo3 0.621000mnso4 - 4ho 2.231000znso4 - 7to 0.861000氯化鉆（100x）cocl2 - 62o 0.00251000鋁酸鈉（100x）na2mno4 2ho 0.0251000無水氯化鈣（100 x）cacl2 33.1510005水硫酸銅（400x）cuso4 - 52o 0.011000鐵鹽母液（100x）edta 3.731000feso4- 7h2o2.781000有機物母液（100x）甘氨酸0.2 1000vb10.51000vb60.51000vb50.51000

53、6-ba 母液(100x)6-ba 0.0510002,4-d 母液(100x)2,4-d 0.210002.1.3 溶液配制0.5m edta : 18.61g edta加入80ml水中，磁力攪拌器強力攪拌，用 naoh （約 2g）調(diào)ph值至8.0,定容至100ml,分裝，高壓滅菌。5xtbe 緩沖液：稱取 tris 54g、硼酸 27.5g,并加入 0.5mol/l edta （ph8.0） 20ml, 定容至1000ml o1mol/l tris-hcl : 80ml水中?解12.1g tris堿，用濃鹽酸調(diào)ph值至8.0,混勻后， 定容至100ml。x-gal貯備液：將x-gal溶于

54、二甲基甲酰胺中，配成20mg/ml濃度的溶液，裝入玻 璃瓶或聚丙烯管中，用錫紙包裹，貯存于-20 c。iptg（20%, w/v）溶液：將2g iptg ,溶于水中，定溶至10ml。用0.22仙m過濾器 除菌。分裝成1ml小份，貯存于-20c。amp （50mg/ml）溶液：稱取1g amp溶于20ml去離子水中，用0.22pm過濾器 過濾除菌，分裝，-20 c保存使用。0.1mol/l cacl2：將 2.2198g無水 cac1溶于 200ml h2o,過濾除菌，4c保存。2.1.4 儀器與試劑（1）主要儀器紫外分光光度計采用日本津島 uv-1601型；5804r高速冷凍離心機（德國epp

55、endorf 公司）；sw-cj-icu型凈化工作臺（江蘇安泰空氣技術(shù)有限公司）；wp900sl23型微波爐（順德格蘭仕電器廠有限公司）；thz-82臺式恒溫振蕩器（購自江蘇太倉市實驗 設(shè)備廠）；spx型智能生化培養(yǎng)箱（購自寧波江南儀器廠）；dyy-10c型電泳儀（購自北京市六一儀器廠）；dyczp-33a型電泳槽（購自北京市六一儀器廠）；8302型恒 溫水浴鍋（北京長風儀器儀表廠）；xw-80a微型漩渦混合儀（購自上海滬西分析儀器 廠）；可調(diào)式移液器（上海雷勃分析儀器有限公司）；ldzx-40bi立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋（上海中安醫(yī)療器械廠）；體視顯微鏡（leica公司）；pcr儀（美國伯

56、樂mycycler）； himaccr21e日本日立高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠制造）；bio-best140e凝膠自動成像系統(tǒng)（美國sim公司）；細胞培養(yǎng)板（美國corning公司）。（2）主要試劑pcr引物等合成自北京華大基因有限公司；dna回收試劑盒購自上海生物工程有限公司、pmd18-t vector試劑盒購自大連寶生物有限公司等；大腸桿菌（escherichia coli） e.coli dh5a、bl21菌株購自北京全式金；克隆載體為pmd-18t（大連寶生物公司）以及 表達載體為peasy-e1 vector （北京transgen公司）。其余試劑為進口或國產(chǎn)分析純，還 包

57、括te, sds, 20mg/ml的蛋白酶k, ctab/nacl,氯仿/異戊醇，酚/氯仿/異戊醇，無 水乙醇，70%乙醇，taqdna聚合酶，d.d.w,tbe緩沖液，eb染液，1%瓊脂糖凝膠， 異丙醇，iptg, x-gal等。2.2試驗方法2.2.1 w0314和nm0705的分子鑒定為進一步確定 w0314和nm0705是否為peba20具有不同生物膜表型的兩個菌株， 并檢測其生物膜相關(guān)基因tasa是否發(fā)生變異，根據(jù)徐亮（徐亮等，2008）等的分類方法， 對其tasa和16srrna進行克隆測序并與野生型菌株進行 blast比對。2.2.1.1 引物設(shè)計16s rrna擴增引物：采用16s rrna的通用引物：16sp3s8： agagtttgatcmtggctcag16sp5s15： acggytaccttgttacgactttasa克隆引物：根據(jù)genbank上所有芽抱tasa基因，采用dnaman軟件和primer5.0軟件分析、