沙門氏菌檢驗

1、作業(yè)指導(dǎo)書文件編號：YCCDC/BZFF06-2016第1頁共7頁文件名稱：沙門氏菌檢驗方法第1版第0次修改生效日期：2016年6月6日沙門氏菌檢驗1. 范圍本法適用于食品中沙門氏菌的檢驗。2. 設(shè)備和材料處微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：2.1冰箱：2 C5 C。22 恒溫培養(yǎng)箱：36C 1C, 42C 1C。2.3均質(zhì)器。2.4振蕩器。2.5電子天平：感量 0.1g。2.6無菌錐形瓶：容量 500mL 250mL。2.7無菌吸管：1mL （具O.OImL刻度）、10mL （具O.ImL刻度）或微量移液器及吸頭。2.8無菌培養(yǎng)皿：直徑 90mm2.9 無菌試管：3mnX

2、 50mm 10mnX 75mm2.10無菌毛細管。2.11 pH計或pH比色管或精密pH試紙。2.12全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)。3. 培養(yǎng)基和試劑3.1緩沖蛋白胨水（BPVV。3.2四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液。3.3亞硒酸鹽胱氨酸（SC增菌液。3.4亞硫酸鉍（BS）瓊脂。3.5 HE瓊脂。3.6木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD瓊脂。3.7沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基。3.8三糖鐵（TSI）瓊脂。3.9蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑。3.10尿素瓊脂（pH7.2 ）。3.11氰化鉀（KCN培 ，養(yǎng)基。3.12賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基。3.13糖發(fā)酵管。3.14鄰硝基苯B -D-半乳糖苷（ONPG培養(yǎng)基。3.15半固

3、體瓊脂。3.16丙二酸鈉培養(yǎng)基。3.17沙門氏菌O和H診斷血清。3.18生化鑒定試劑盒。4. 檢驗程序沙門氏菌檢驗程序見圖1。作業(yè)指導(dǎo)書文件名稱：沙門氏菌檢驗方法第1版第0次修改生效日期：2016年6月6日圖1沙門氏菌檢驗程序文件編號：YCCDC/BZFF06-2016 第2頁共7頁作業(yè)指導(dǎo)書文件編號：YCCDC/BZFF06-2016第3頁共7頁文件名稱：沙門氏菌檢驗方法第1版第0次修改生效日期：2016年6月6日5. 操作步驟5.1前增菌稱取25g （ mL樣品放入盛有 225mLBPW的無菌均質(zhì)杯中，以 8000r/min10000r/min 均質(zhì)1min2min，或置于盛有225mLB

4、PW勺無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打 1min2min。 若樣品為液態(tài)，不需要均質(zhì)，振蕩混勻。如需測定pH值，用1mol/mL無菌NaOH或HCI調(diào)pH至6.8 0.2.無菌操作將樣品轉(zhuǎn)至 500mL錐形瓶中，如使用均質(zhì)袋，可直接進行培養(yǎng)，于 36C 1C培養(yǎng) 8h18h。如為冷凍產(chǎn)品，應(yīng)在 45C以下不超過15min,或2C5C不超過18h解凍。5.2增菌輕輕搖動培養(yǎng)過的樣品混合物，移取1mL,轉(zhuǎn)種于10mLTTB內(nèi)，于42C 1 C培養(yǎng)18h24h。同時，另取 1mL轉(zhuǎn)種于10mL SC內(nèi)，于36C 1 C培養(yǎng)18h24h。5.3分離分別用接種環(huán)取增菌液 1環(huán)，劃線接種于一個 BS瓊脂平

5、板和一個XLD瓊脂平板（或HE 瓊脂平板或沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板）。與36C 1C分別培養(yǎng)18h24h （XLD平板、HE瓊脂平板或沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板）或40h48h （ BS瓊脂平板），觀察各個平板上生長的菌落，各個平板上的菌落特征見表1。表1沙門氏菌屬在不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征選擇性瓊脂平板沙門氏菌BS瓊脂菌落為褐色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周圍培養(yǎng)基可成黑色或棕色；有些 菌株成灰綠色的菌落，周圍培養(yǎng)基不變。HE瓊脂藍綠色或藍色，多數(shù)菌落中心黑色或幾乎全黑色；有些菌株為黃色，中心黑色或 幾乎全黑色。XLD瓊脂菌落呈粉紅色，帶或不帶黑色中心，有些菌株可呈現(xiàn)大的帶光澤的黑色中

6、心，或 呈現(xiàn)全部黑色的菌落；有些菌株為黃色菌落，帶或不帶黑色中心。沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基按照顯色培養(yǎng)基的說明進行判定。5.4生化試驗5.4.1自選擇性瓊脂平板上分別挑取 2個以上典型或可以菌落， 接種三糖鐵瓊脂，先在斜面 劃線，再于底層穿刺；接種針不要滅菌，直接接種懶氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂平板， 于36 C 1C培養(yǎng)18h24h，必要時可延長至48h。在三糖鐵瓊脂和懶氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng) 基內(nèi)，沙門氏菌屬的反應(yīng)結(jié)果見表2。表2沙門氏菌屬在三糖鐵瓊脂和懶氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基內(nèi)的反應(yīng)結(jié)果三糖鐵瓊脂懶氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基初步判斷斜面底層產(chǎn)氣硫化氫KA+ ( )+ ()可疑沙門氏菌屬KA+ ( )

7、+ ()可疑沙門氏菌屬AA+ ( )+ ()可疑沙門氏菌屬AA+ / + / 非沙門氏菌作業(yè)指導(dǎo)書文件編號：YCCDC/BZFF06-2016第4頁共7頁文件名稱：沙門氏菌檢驗方法第1版第0次修改生效日期：2016年6月6日KK+ / + / + / 非沙門氏菌注：K:產(chǎn)堿，A:產(chǎn)酸；+:陽,性,:陰性；+（）:多數(shù)陽性，少數(shù)陰性；+ / :陽性或陰性。542接種三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基的同時，可直接接種蛋白胨水（供做靛基質(zhì)試驗）、尿素瓊脂（pH7.2 ）、氰化鉀（KCN培養(yǎng)基，也可在初步判斷結(jié)果后從營養(yǎng)瓊脂平 板上挑取可疑菌落接種。于 36 C 1C培養(yǎng)18h24h，必要時可延長至

8、 48h，按表3判定結(jié) 果。將已挑菌落的平板儲存于2C5 C或室溫至少保留24h，以備比必要時復(fù)查。表3沙門氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表反應(yīng)序號硫化氫（H2S）靛基質(zhì)pH7.2尿素氰化鉀（KCN懶氨酸脫羧酶A1+A2+A3+ / 注：+陽性；一陰性；+/ 陽性或陰性。5.4.2.1 反應(yīng)序號A1:典型反應(yīng)判定為沙門氏菌屬。如尿素、KCN和懶氨酸脫羧酶3項中有 1項異常，按表4可判定為沙門氏菌。如有2項異常為非沙門氏菌。表4沙門氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表pH7.2尿素氰化鉀（KCN懶氨酸脫羧酶判定結(jié)果甲型副傷寒沙門氏菌（要求血清學(xué)鑒定結(jié)果）沙門氏菌W或V （要求符合本群生化特征）沙門氏菌個別變體（要求

9、血清學(xué)鑒定結(jié)果）注：+表示陽性；一表示陰性。542.2 反應(yīng)序號 A2:補做甘露醇和山梨醇試驗，沙門氏菌靛基質(zhì)陽性變體兩項實驗結(jié)果 均為陽性，但需要結(jié)合血清學(xué)鑒定結(jié)果進行判定。542.3 反應(yīng)序號A3:補做ONPG ONPG急形為沙門氏菌，同事賴氨酸脫羧酶陽性，甲型副 傷寒沙門氏菌為賴氨酸脫羧酶陰性。5.4.2.4 必要時按表5進行沙門氏菌生化群的鑒別。表5沙門氏菌屬生化群的鑒別項目InmIVV衛(wèi)矛醇+山梨醇水楊苷ONPG丙二酸鹽KCN注：+表示陽性；一表示陰性。5.4.3如選擇生化鑒定試劑盒或全自動微生物鑒定系統(tǒng)，可根據(jù)5.4.1的初步判斷結(jié)果，從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落，用生理鹽水制備成

10、濁度適當?shù)木鷳乙海褂蒙b定試劑盒作業(yè)指導(dǎo)書文件編號：YCCDC/BZFF06-2016第5頁共7頁文件名稱：沙門氏菌檢驗方法第1版第0次修改生效日期：2016年6月6日或全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)進行鑒定。5.5血清學(xué)鑒定5.5.1 抗原的準備般米用1.2%1.5%瓊脂培養(yǎng)物作為玻片凝集試驗用的抗原。0血清不凝集時，講菌株接種在瓊脂量較高的（如22/3%培養(yǎng)基上再檢查；如果是由于Vi抗原的存在而阻止了0凝集反應(yīng)時，可挑取菌苔于1mL生理鹽水中做成濃菌液，于酒精燈火焰上煮沸后再檢查。H抗原發(fā)育不良時，將菌株接種在0.55%0.65%半固體瓊脂平板的中央，俟菌落蔓延生長時，在其邊緣部分取菌檢查；

11、或?qū)⒕晖ㄟ^裝有0.3%0.4%半固體瓊脂的小試管1次2次，自遠端取菌培養(yǎng)后再檢查。5.5.2多價菌體抗原（O鑒定再玻片上劃出2個約1cmx 2cm的區(qū)域，挑取1環(huán)待測菌，各放1/2環(huán)于玻片上的每一 區(qū)域上部，在其中一個區(qū)域下部加1滴多價菌體（O抗血清，在另一區(qū)域下部加入1滴生理鹽水，作為對照。再用無菌的接種環(huán)或針分別將兩個區(qū)域內(nèi)的菌落研成乳狀液。將玻片傾斜搖動混合1min，并對著黑暗背景進行觀察，任何程度的凝集現(xiàn)象皆為陽性反應(yīng)。5.5.3多價鞭毛抗原（H）鑒定同 5.5.2。5.5.4 血清學(xué)分型（選做項目）5.5.4.1 O 抗原的鑒定用AF多價O血清做玻片凝集試驗，同時用生理鹽水做對照。

12、在生理鹽水中自凝者為 粗糙型菌株，不能分型。被AF多價O血清凝集者，依次用 04; 03 010 07; 08; 09; 02和011因子血清做 凝集試驗。根據(jù)試驗結(jié)果，判定0群。被03、010血清凝集的菌株，再用 010 015 034019單因子血清做凝集試驗，判定E1、E2、E3、E4各亞群，每一個 0抗原成分的最后確定均應(yīng)根據(jù)0單因子血清的檢查結(jié)果，沒有0單因子血清的要用兩個 0復(fù)合因子血清進行核對。不被AF多價0血清凝集者，先用 9種多價0血清檢查，如有其中一種血清凝集，則 用這種血清所包括的 0群血清逐一檢查，以確定0群。每種多價0血清所包括的0因子如下：0多價1A , B, C，

13、D,E, F群（并包括6,14 群）0多價213,16,17,18,21群0多價328,30,35,38,39群0多價440,41,42,43群0多價544,45,47,48群0多價650,51,52,53群0多價755,56,57,58群0多價859,60,61,62群0多價963,65,66,67群5.5.4.2 H 抗原的鑒定屬于AF各0群的常見菌型，依次用表 6所述H因子血清檢查第1相和第2項的H抗 原。表2AF群常見菌型H抗原表0群第1相第2相作業(yè)指導(dǎo)書文件編號：YCCDC/BZFF06-2016第6頁共7頁文件名稱：沙門氏菌檢驗方法第1版第0次修改生效日期：2016年6月6日Aa無

14、Bg,f,s無Bi,b,d2C1k,v,r,c5, z15C2b,d,r2,5D （不產(chǎn)氣的）d無D （產(chǎn)氣的）g,m,p,q無E1h,v6, w, xE4g,s,t無E4i不常見的菌型，先用8種多價H血清檢查，如有其中一種或兩種血清凝集，則再用這一種或兩種血清所包括的各種H因子血清逐一檢查，以第1相和第2相的H抗原。8種多價H血清所包括的H因子如下:H 多價1a,b,c,d,ii5,fg,gms,gpu,gp,gq,mt,gzio,lv,lw,lz13,lz 28,lz 4051H多價2eh,enx,enzH多價3k,r,y,z,zH多價 41,2； 1,5 ； 1,6 ； 1,7 ； Z6

15、H 多價5z4z23,z 4z24,z4z32,z29,z 35,z 36,z 38H多價6z39,z41 ,z42,z44H 多價7z52,z53,z54,z55H多價8z56,z57,z60,z61,z62每一個H抗原成分的最后確定均應(yīng)根絕H單因子血清的檢查結(jié)果，沒有H單椅子血清的要用兩個H復(fù)合因子血清進行核對。檢出第1相H抗原而未檢出第2相H抗原的或檢出第 2相H抗原而未檢出啊第1相H 抗原的，可在瓊脂斜面上移種12代后再檢查。如仍只檢出一個相的H抗原，要用位相變異的方法檢查其另一個相。單相菌不必做位相變異檢查。位相變異試驗方法如下：小玻管法：將半固體管（每管約1mL2mL）在酒精燈上溶

16、化并冷至 50C，取已知相的H因子血清0.05mL0.1mL，加入于溶化的半固體內(nèi)，混勻后，用毛細吸管吸取分裝于供位 相變異試驗的小玻管內(nèi)，俟凝固后，用接種針挑取待檢菌，接種于一端。將小玻管平放在平皿內(nèi)，并在其旁放一團濕棉花，以防瓊脂中水分蒸發(fā)而干縮，每天檢查結(jié)果，待另一相細菌 解離后，可以從另一端挑取細菌進行檢查。培養(yǎng)基內(nèi)血清的濃度應(yīng)有適當?shù)谋壤?，過高時細菌不能生長，過低時同一相細菌的動力不能抑制。一般按原血清1:2001:800的量加入。小倒管法：將兩端開口的小玻管（下端開口要留一個缺口， 不要平齊）放在半固體管內(nèi)， 小玻管的上端應(yīng)高出于培養(yǎng)基的表面，滅菌后備用。臨用時在酒精燈上加熱融化，冷至50C,挑取因子血清1環(huán)，加入小套管中的半固體內(nèi)，略加攪動，使其混勻，俟凝固后，將待檢菌 株接種于小套管中的半固體表層內(nèi)，每天檢查結(jié)果，待另一相細菌解離后， 可從套管外的半固體表面取菌檢查，或轉(zhuǎn)種 1澈瓊脂斜面，于 37 C培養(yǎng)后再做凝集試驗。簡易平板法：將0.35%0.4%半固體瓊脂平板烘干表面水分，挑取因子血清1環(huán)，滴在半固體平板表面，放置片刻，待血清吸收到瓊脂內(nèi)，在血清部位的中