綠色熒光蛋白(GFP)基因的克隆和表達(新手詳細注釋版)

1、參考醫(yī)學綠色熒光蛋白(GFP)基因的克隆和表達背景知識綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一類存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔腸動物體內(nèi)的生物發(fā)光蛋白。當受到紫外或藍光激發(fā)時，GFP 發(fā)射綠色熒光。它產(chǎn)生熒光無需底物或輔因子。發(fā)色團是其蛋白質一級序列固有的。GFP 由3 個外顯子組成，長2.6kb；GFP 是由238 個氨基酸所組成的單體蛋白,相對分子質量為27. 0kMr，其蛋白性質十分穩(wěn)定，能耐受60處理。1996 年GFP 的晶體結構被解出，蛋白質中央是一個圓柱形水桶樣結構，長420 nm，寬240 nm，由11 個圍繞中心螺旋的反平行折疊組成，熒光

2、基團的形成就是從這個螺旋開始的，桶的頂部由3 個短的垂直片段覆蓋，底部由一個短的垂直片段覆蓋，對熒光活性很重要的生色團則位于大空腔內(nèi)。發(fā)色團是由其蛋白質內(nèi)部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身環(huán)化和氧化形成.實驗一 質粒DNA的分離與純化一、實驗目的掌握一種最常用的質粒DNA提取方法：堿裂解法。該法用于從小量培養(yǎng)物中抽提質粒DNA，比較方便、省時，提取的質粒DNA質量較高，可用于DNA的酶切、PCR甚至測序。二、基本原理質粒是一類在細菌細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的獨立于染色體外，能夠自主復制的穩(wěn)定的遺傳單位。迄今為止，從細菌中分離得到的質粒都是環(huán)型雙鏈DNA分子，分子量范圍從1kb到200kb。質粒DN

3、A可持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，但在一定條件下又會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復制而復制，并通過細胞分裂傳遞到后代。在大多數(shù)情況下質粒DNA復制中的酶體系和細菌染色體復制時所用的酶是相同的。有些質粒復制受宿主細胞復制作用的嚴格限制，因此每個細胞中只含一個或幾個拷貝，稱為嚴謹型質粒，有的質粒的復制受宿主細胞的控制不嚴，稱為松弛型質粒，它們在每個細胞中的數(shù)目可達10-200個拷貝。當宿主細胞的蛋白質合成受到抑制時（例如經(jīng)氯霉素處理），細菌染色體雖不再增加，但松弛型質粒DNA可繼續(xù)被復制，以至每個細胞內(nèi)的拷貝數(shù)可以增至一千到幾千。質粒具有一定的生物功能，它們往往帶有一些抗藥標記，當質

4、粒DNA用人為的方法轉化進細菌時，轉化后的細菌會表現(xiàn)出質?；蛩哂械男碌纳锉憩F(xiàn)型，例如，把一個含有抗藥基因的質粒轉入細菌后，原來無抗藥性的細菌則表現(xiàn)出抗藥的新表型。借助轉化菌獲得的新表型特征，可證實質粒已轉入宿主細菌中，這樣就可以作為轉化菌的選擇性標記。質粒作為基因克隆載體分子的重要的條件是獲得批量的純化的質粒DNA分子。目前已有許多方法可用于質粒DNA的提取，它們都包括三個基本的步驟：細菌的生長和質粒的擴增；菌體的收集裂解，質粒DNA的分離；質粒DNA的純化。1、 細菌的生長和質粒的擴增從瓊脂培養(yǎng)基平板上挑取一個單菌落，接種到含適當抗生素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。對于松弛型質粒（如pUC系列）

5、來說，只要將培養(yǎng)物放到標準的LB或2YT培養(yǎng)基中生長到對數(shù)晚期，就可以大量提取質粒，而不必選擇性地擴增質粒DNA。但對于嚴謹型質粒（如pBR322）來說，則需在得到部分生長的細菌培養(yǎng)物中加入氯霉素繼續(xù)培養(yǎng)若干小時，以便對質粒進行選擇性擴增。2、菌體的收集、裂解和質粒DNA的分離質粒分離的基本原理是利用宿主菌（一般是大腸桿菌菌株）DNA與質粒DNA之間的兩種主要性質差異：（1）大腸桿菌的染色體較一般的載體質粒DNA大得多。（2）從細胞中提取得到的大腸桿菌DNA主體是變性的線性分子，而大多數(shù)質粒DNA是共價閉合的環(huán)狀分子。這里主要介紹堿裂解法的基本原理：在細菌懸浮液中加入SDS（十二烷基硫酸鈉）和

6、NaOH使菌體裂解（有時需要先使用溶菌酶水解細胞壁）。此處理可破壞堿基配對，故可使細菌的線狀染色體DNA變性，但閉環(huán)質粒DNA鏈由于處于拓撲纏繞狀態(tài)而不能彼此分開。當條件恢復正常時（如加入酸性的NaAc或Kac中和堿性NaOH），質粒DNA鏈迅速得到準確配對，重新恢復成天然的超螺旋分子。通過離心，可以使染色體DNA與變性蛋白質、RNA分子一起沉淀下來，而質粒超螺旋分子仍滯留于上清中。3、質粒DNA的提純對于小量制備的質粒DNA，經(jīng)過苯酚抽提、RNA酶消化和酒精沉淀等簡單步驟除去殘余蛋白質及RNA，達到純化的目的。質粒DNA分子具有三種構型：共價閉合環(huán)形DNA（cccDNA，SC構型）、開環(huán)DN

7、A（OC構型）和線性分子（L構型）。在細菌體內(nèi)，質粒DNA是以負超螺旋構型存在的。在瓊脂糖凝膠電泳中不同構型的同一種質粒DNA，盡管分子量相同，但具有不同的電泳遷移率。其中走在最前沿的是SC DNA，其后依次是L DNA和OC DNA。三、實驗材料、儀器及試劑1. 在含有pEGFPN3質粒的DH5平板上菌落上挑取菌種，置于含有5mL LB培養(yǎng)基的試管中。搖晃過夜。 （DH5是一種大腸桿菌的誘變菌株，主要表現(xiàn)對外源DNA的免疫缺乏，是用于基因工程的菌種）在含有pET-28a質粒的平板上挑取單菌落于另外一個試管中，同樣搖蕩培養(yǎng)過夜。2、使用儀器 恒溫培養(yǎng)箱，超凈臺，恒溫搖床，制冰機，臺式離心機，小

8、型混合器，冰箱四、實驗步驟1. 取1.5ml DH5培養(yǎng)液倒入1.5mL eppendorf 管（一種離心管）中, 13000rpm離心1min。2. 重復1。3. 棄上清,將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘,使液體流盡。 4. 菌體沉淀重懸浮于100L溶液中(需劇烈振蕩),室溫下放置10min。 （溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液I的作用；mM為mmol/L。任何生物化學反應，首先要控制好溶液的pH，因此用適當濃度的和適當pH值的Tris-Cl溶液。50 mM葡萄糖最大的好處是懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部。EDTA是Ca

9、2+和Mg2+等二價金屬離子的螯合劑，配在分子生物學試劑中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生長。在溶液I中加入高達 10 mM 的EDTA，無非就是要把大腸桿菌細胞中的所有二價金屬離子都螯合掉。菌體一定要懸浮均勻，不能有結塊。 ）5. 加入新配制的溶液200l, 蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf 管5次,以混勻內(nèi)容物(千萬不要振蕩),冰浴5min。 （溶液II，0.2 M NaOH / 1% SDS；溶液II的作用；這是用新鮮的0.4 N的NaOH和2的SDS等體積混合后使用的。要新從濃NaOH稀釋制備0.4N的NaOH，保證NaOH沒有吸收空氣中的CO2而減弱堿性。其

10、實破細胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。事實上NaOH是最佳的溶解細胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動物細胞，碰到了堿都會幾乎在瞬間就溶解，這是由于細胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結構向micelle（微囊）結構的相變化所導致。用了不新鮮的0.4 N NaOH，即便是有SDS也無法有效溶解大腸桿菌（不妨可以自己試一下），自然就難高效率抽提得到質粒。這一步要記住兩點：第一，時間不能過長，因為堿性條件下基因組DNA片斷會慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合，不然基因組DNA也會斷裂。）6. 加入150L預冷的溶液,蓋緊管口，并倒置離心管，溫和振蕩3次,使沉淀混勻,冰浴中15分鐘,1300

11、0rpm離心5min。 （溶液III，3 M 醋酸鉀 / 2 M 醋酸。溶液含3M 醋酸鉀 / 2M 醋酸。溶液III加入后就會有大量的沉淀，這其實是SDS遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀（PDS），而PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。而高濃度的鹽，使得沉淀更完全。SDS易與蛋白質結合，平均兩個氨基酸上結合一個SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質沉淀。大腸桿菌的基因組DNA也會一起被共沉淀，因為基因組DNA太長，容易被PDS共沉淀，注意SDS并不與DNA分子結合。 2M的醋酸是為了中和NaOH，因為長時間的堿性條件會打斷DNA，所以要中和之?；蚪MDNA一旦發(fā)生斷裂，

12、只要是50100 kb大小的片斷，就沒有辦法再被PDS共沉淀了。所以堿處理的時間要短，而且不得激烈振蕩，不然最后得到的質粒上總會有大量的基因組DNA混入，瓊脂糖電泳可以觀察到一條濃濃的總DNA條帶。很多人誤認為是溶液III加入后基因組DNA無法快速復性就被沉淀了，這是天大的誤會，因為變性的也好復性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH本來是為了溶解細胞而用的，DNA分子的變性其實是個副產(chǎn)物，與它是不是沉淀下來其實沒有關系。溶液III加入并混合均勻后在冰上放置，目的是為了PDS沉淀更充分一點。）7. 上清液移入干凈eppendorf 管中,加入等體積的氯仿/異戊醇(24：1),振蕩混

13、勻, 13000rpm離心2min。 （PDS沉淀的形成后有些蛋白質不能被沉淀，因此要用酚/氯仿/異戊醇進行抽提，然后進行酒精沉淀才能得到質量穩(wěn)定的質粒DNA，不然時間一長就會因為混入的DNase而發(fā)生降解。這里用25：24：1的酚/氯仿/異戊醇是有很多道理的。酚（Phenol）對蛋白質的變性作用遠大于氯仿，但是水飽和酚的比重略比水重，碰到高濃度的鹽溶液（比如4M的異硫氰酸胍），離心后酚相會跑到上層，不利于含質粒的水相的回收；加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始終在下層，方便水相的回收；還有一點，酚與水有很大的互溶性，如果單獨用酚抽提后會有大量的酚溶解到水相中，而酚會抑制很多酶反應（比如限制

14、性酶切反應），而用酚/氯仿的混合液進行抽提，跑到水相中的酚則少得多，微量的酚在乙醇沉淀時就會被除干凈而不必擔心酶切等反應不能正常進行。至于異戊醇的添加，其作用主要是為了讓離心后上下層的界面更加清晰，也方便了水相的回收。）8. 將水相移入干凈eppendorf 管中,加入等體積的氯仿/異戊醇(24：1)振蕩混勻, 13000rpm離心2min。 9. 將水相移入干凈eppendorf 管中,加入2 倍體積的無水乙醇,振蕩混勻后，置于室溫下2min，然后13000rpm離心5min。 （回收后的水相含有足夠多的鹽，因此只要加入2倍體積的乙醇，在室溫放置幾分鐘后離心就可以將質粒DNA沉淀出來。）10

15、. 棄上清,將管口敞開倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出,加入1mL 70乙醇洗沉淀一次, 振蕩混勻后，13000rpm離心5min。 （高濃度的鹽會水合大量的水分子，因此DNA分子之間就容易形成氫鍵而發(fā)生沉淀。如果感覺發(fā)生了鹽的沉淀，就用70的乙醇多洗幾次，每次在室溫放置一個小時以上，并用移液槍槍頭（tip）將沉淀打碎，就能得到好的樣品。）11. 吸除上清液,將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡,室溫干燥。 12. 將沉淀溶于30L TE緩沖液(pH8.0，含20g/mL RNaseA)中，保存在-20冰箱中。 （溶解已經(jīng)講解的RNA，防止未降解的RNA會干擾電泳結果。）13. 按照同樣的流程和方法將pE

16、T-28a的質粒也提出來，保存在-20冰箱中。五、實驗結果實驗二 質粒DNA濃度的測定一、實驗目的學習利用核酸蛋白測定儀測算核酸的濃度和純度。二、基本原理核酸分子在260nm下有最大吸光值，因此可以通過260nm下核酸的吸光值計算核酸濃度（mg/ml），并通過測定與280nm和230nm的比值，估算DNA的純度。（除了核酸濃度,分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度,如 A 260 / A 280的比值,用于評估樣品的純度，因為蛋白的吸收峰是 280 nm.純凈的樣品,比值大于 1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于 1.8 或者2.0，表示存在蛋白質或者酚類物質的影響

17、。A 230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物,多肽,苯酚等，較純凈的核酸 A 260 / A 230 的比值大于 2.0。A 320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，A 320 一般是 0。）三、實驗材料與儀器1、實驗材料pEGFPN3和pET-28a DNA2.使用儀器Eppendorf核酸蛋白測定儀，移液槍四、實驗步驟1. 按下Eppendorf核酸蛋白測定儀dsDNA，比色皿中加入100l ddH2O，blank空白對照。2. 取一0.5ml離心管，吸取質粒DNA 5l，然后再加入95l ddH2O，混勻。3. 將100l的溶液轉移到比色皿中，注意不要出現(xiàn)氣泡。4. 按下sa

18、mple，記錄260nm下DNA的濃度（mg/ml）。并同時記錄OD260nm/280nm，OD260nm/230nm的比值，估測DNA的純度。5. 計算質粒DNA母液的濃度=OD260nm下的濃度20（mg/ml），DNA的純度：OD260nm/280nm=1.80.1(如果低于1.7，說明樣品中蛋白質去除的不完全，或樣品中有苯酚的污染；如果高于1.9，說明樣品中RNA去除的不完全。) 正常OD260nm/230nm約為2.5，OD260nm/230nm 小于2.0，表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物,多肽,苯酚等鹽和小分子。實驗三 瓊脂糖凝膠電泳一、實驗目的學習掌握一種最常用的分離、鑒

19、定、純化DNA片段的比較方便、省時的技術：瓊脂糖凝膠電泳的基本原理和操作方法。二、基本原理影響DNA在瓊脂糖凝膠中遷移速率的因素主要有：（1）DNA分子的大小 雙鏈DNA分子在凝膠基質中遷移的速率與其堿基對數(shù)的常用對數(shù)成反比。分子越大，遷移的越慢，因為摩擦阻力越大，也因為大分子通過凝膠孔徑的效率低于較小的分子。（2）瓊脂糖濃度 給定大小的線狀DNA片段在不同濃度的瓊脂糖凝膠中遷移速率不同。在DNA電泳遷移速率的對數(shù)和凝膠濃度之間存在線性相關。（3）DNA的構象 超螺旋環(huán)狀（型）、切口環(huán)狀（型）和線狀（型）DNA在瓊脂糖凝膠中以不同速率遷移。其相對遷移速率主要取決于瓊脂糖凝膠的濃度和類型，其次是

20、電流強度、緩沖液離子強度和型超螺旋絞緊的程度或密度。一些條件下，型DNA比型遷移得快；在另一些條件下，順序可能相反。（4）所用的電壓 低電壓時，DNA片段遷移率與所用的電壓成正比。電場強度升高時，高分子量片段的遷移率遂不成比例的增加。所以，當電壓增大時瓊脂糖凝膠分離的有效范圍反而減小。要獲得大于2kb DNA片段的良好分辨率，所用電壓不應高于5-8V/cm。（5）電泳緩沖液 DNA的泳動受電泳緩沖液的組成和離子強度的影響。缺乏離子則電導率降低，DNA或者不動或者遷移很慢。高離子強度時（如10buffer），電導率升高，使得應用適中的電壓也會產(chǎn)生大量的熱能，最嚴重時凝膠會熔化，DNA變性。三、實

21、驗材料、儀器及試劑1、實驗材料質粒DNA2、使用儀器核酸電泳儀，小型混合器，冰箱，藍盾可見光透射儀四、實驗步驟1、 1%瓊脂糖凝膠的配制（1） 加20ml 1TBE緩沖液于三角瓶中。（TBE緩沖液為Tris硼酸-EDTA緩沖溶液，適合長時間電泳，但測得分子質量大于實際分子質量，；TAE緩沖液為Tris醋酸-EDTA緩沖溶液，運用最廣泛，較準確但不適合長時間；TPE緩沖液為Tris磷酸-EDTA緩沖溶液，磷酸鹽易在乙醇沉淀過程中析出，不適合DNA回收。）（2）精確稱取0.2g瓊脂糖加到三角瓶中，于微波爐中加熱至完全熔化，（3）冷卻至60左右，（4）輕緩倒入封好兩端和加上梳子的電泳膠板中，靜置冷卻

22、30分鐘以上，（5）將膠板除去封膠帶，放入電泳緩沖液（TBE）中，使電泳緩沖液剛好沒過凝膠約1mm，輕輕拔除梳子，（6）取5l質粒DNA及2l Genefinder混勻上樣。（也可使用GelRed熒光核酸凝膠染色試劑，用凝膠成像儀顯影）（7）50-100v約電泳0.5-1小時。（8）藍盾可見光透射儀觀察結果。五、實驗結果實驗四 酶切及連接1. 實驗目的學習使用限制型內(nèi)切酶進行DNA酶切的原理和方法。2. 實驗原理迄今已發(fā)現(xiàn)了3000多種限制性內(nèi)切酶。傳統(tǒng)上將限制性內(nèi)切酶按照亞基組成、酶切位置、識別位點、輔助因子等因素劃分為三大類。II型酶在其識別位點之中或臨近的確定位點特異地切開DNA鏈。它們

23、產(chǎn)生確定的限制片段，因此是三類限制性內(nèi)切酶中唯一用于DNA分析和克隆的一類。5-GAATTC-33-CTTAAG-5II型限制性內(nèi)切酶中最普遍的是象EcoR I、Hind III、BamHI和Not I這樣在識別序列中進行切割的酶。這一類酶是構成商業(yè)化酶的主要部分。大部分這類酶都以同二聚體的形式結合到DNA上，因而識別的是對稱序列；但有極少的酶作為單聚體結合到DNA上，識別非對稱序列。一些酶識別連續(xù)的序列（如EcoR I識別GAATTC；Hind III識別AAGCTT;BamHI識別GGATCC; Not I識別GCGGCCGC）；而另一些識別不連續(xù)的序列（如Bgl I識別GCCNNNNNG

24、GC）。限制性內(nèi)切酶酶切DNA后形成兩種類型的末端：(i)兩條鏈斷裂的位置是交錯地，產(chǎn)生粘性末端，如EcoR I酶切后產(chǎn)生末端；(ii)兩條鏈的斷裂位置處在一個對稱結構5-GGCC-33-CCGG-5。的中心，產(chǎn)生平末端，如HaeIII酶切后產(chǎn)生 DNA連接酶能夠催化在兩條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵，這種酶需要在一條DNA鏈的3-末端具有一個游離的羥基（-OH），和在另一條DNA鏈的5-末端具有一個磷酸基團（-P）。ligase53533. 實驗材料、儀器及試劑3.1 實驗材料 pEGFPN3和pET-28a DNA3.2 儀器準備水浴鍋、移液器、電泳槽、電泳儀、振蕩器、制冰機、藍盾可見光透射

25、儀、凝膠成像儀3.3 試劑BamH I(10U/L) (TaKaRa公司); Not I(10U/L) (TaKaRa公司),T4 ligase4. 操作步驟4.1 酶切按如下雙酶切體系（30L）混合 ：反應物（L）pEGFP-N3 pET-28a 質粒 1818 BamH I 2 2 Not I 2 2 10buffer K 3 3 0.1%BSA緩沖液 3 3 （BSA緩沖液為牛血清白蛋白，穩(wěn)定酶的活性。）1. 離心10s，混勻。2. 37水浴酶切3-4h。3. 配制1.0%（M/V）普通瓊脂糖凝膠30ml。（1%（m/v）指：一般是固體溶于液體的，1g固體溶于100mL水中。）4. 適當

26、放置冷卻，45左右倒于電泳膠板上，插好梳子。5. 待凝膠凝固好以后，撥下梳子。6. 酶切樣品中加入5l溴酚藍-GeneFinder混合液混勻，上樣。7. 1TBE Buffer，80V(3-4V/cm)下電泳30min。8. 熒光激發(fā)器觀察質粒DNA條帶的酶切情況，并照像。4.2 回收酶切產(chǎn)物（采用天為時代DNA回收試劑盒進行回收） 1) 配30mL 1進口瓊脂糖凝膠，盡量長一些（用粗梳子），對酶切產(chǎn)物進行電泳分離； 2) 將酶切產(chǎn)物全部加入加樣孔中 3) 跑膠，觀察結果，并且拍照。 4) 用干凈的刀片將需要的DNA條帶從凝膠上切下來，稱取重量。 5) 以0.1g凝膠對應300L的體積加入PN

27、（溶膠液）。 6) 50水浴放置10min，期間不斷溫和上下翻動離心管至膠完全融解。 7) 將上一步得到的溶液加入到一個吸附柱中，吸附柱再放入收集管，13000rpm離心60s，棄掉廢液。（吸附柱，用于吸附層析）8) 加入800L漂洗液PW，13000rpm離心60s，棄掉廢液。（PW是去鹽的洗脫液，目的是洗脫脂類、蛋白及鹽類等雜質）9) 加入500L漂洗液PW，13000rpm離心60s，棄掉廢液。 10) 將離心吸附柱放回收集管，13000rpm離心2min。 11) 取出吸附柱，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間位置加入適量洗脫緩沖液EB 30L，洗脫緩沖液先在65水浴預熱，室溫放置

28、2min，13000rpm離心1min，然后將離心的溶液重新加回離心吸附柱中，13000rpm離心1min。 12) 置于20保存。 4.3 連接按照連接體系進行，16連接過夜。 反應物 體積/L 回收純化的pET-28a質粒 5gfp基因片段 12 T4連接酶 1 緩沖液（10） 2 實驗五 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉化一、實驗目的了解和掌握大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備方法的原理和操作要點，以及質粒DNA轉化大腸桿菌細胞的原理和方法。二、基本原理外源DNA只有轉化到大腸桿菌細胞內(nèi)才能得到擴增。感受態(tài)指細菌細胞具有的能夠接受外源DNA的一種特殊生理狀態(tài)。大腸桿菌的感受態(tài)可用CaCl2處理而誘導產(chǎn)

29、生：將正在生長的大腸桿菌細胞在0下加入到低滲的CaCl2溶液中，便會使細胞膜的透性發(fā)生改變，此時的細胞即呈現(xiàn)為感受態(tài)。這一方法可以用于批量制備感受態(tài)細胞，其轉化效率可達到5106-2107個轉化克隆子/g超螺旋質粒DNA。制備好的大腸桿菌感受態(tài)細胞可在-70凍存。在0下外源DNA可吸附到感受態(tài)細胞表面，短時間的熱刺激（42，90s）誘導細胞吸收DNA。(Ca2+會使細胞膜磷脂雙分子層形成液晶結構，促使細胞外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶解離開來，離開所在區(qū)域，誘導細胞成為感受態(tài)細胞。將該體系熱激，細胞膜的液晶結構會發(fā)生劇烈擾動，并隨機出現(xiàn)許多間隙，外源DNA就可能被細胞吸收。進入細胞的外源DNA分

30、子通過復制、表達，實現(xiàn)遺傳信息的轉移，使受體細胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。) 轉化了質粒DNA的大腸桿菌隨后在培養(yǎng)基中37培養(yǎng)1hr，可使質粒DNA中編碼抗生素抗性的基因得以表達，因此，轉化了質粒DNA的大腸桿菌細胞可在含有相應抗生素的培養(yǎng)基上生長，而沒有轉化的細胞則無法生長。三. 實驗材料、儀器1. 實驗材料DH5，BL21，pET-28a重組質粒DNA2. 使用儀器水浴鍋，高壓滅菌鍋、移液器、超凈工作臺、離心機、振蕩培養(yǎng)箱，制冰機四、操作步驟1. LB（Luria-Bertain）液體和固體培養(yǎng)基的配制（參考附錄）氨芐青霉素和卡那霉素等抗生素不抗熱，如果培養(yǎng)基溫度過高，容易導致抗生素失效，應使培養(yǎng)

31、基降溫至60左右后，再加入抗生素。但也不應使培養(yǎng)基的溫度過低，否則容易出現(xiàn)氣泡。75mm直徑的培養(yǎng)皿約需15ml培養(yǎng)基。2感受態(tài)細胞的制備 (CaCl2法) （1） 挑一大腸桿菌單菌落放入3ml LB液體培養(yǎng)基（含Kan+），37培養(yǎng)過夜。（2） 活化大腸桿菌：取3ml新鮮的LB液體培養(yǎng)基加入50-150l的過夜菌，培養(yǎng)2-3個小時。（3） 將昨夜搖出來的DH5或BL21培養(yǎng)液轉入離心管中,冰上放置10min,然后于4下4000rpm離心5min。 （4） 棄去上清,用預冷的0.1mol/L 的CaCl2溶液600L輕輕懸浮細胞,冰上放置20min, 4下4000rpm離心5min。 （5）

32、棄去上清,加入300L預冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液,輕輕懸浮細胞,冰上放置5min,即成感受態(tài)細胞懸液，可-80長期保存。3. 轉化涂板 （1）取2個無菌離心管，分別加入100L DH5感受態(tài)細胞懸液，第1管加5l無菌水，第2管加入質粒DNA溶液5l,輕輕搖勻,冰上放置30min。（2）42水浴中熱激90s,熱激后迅速置于冰上冷卻5min。 （3）分別向管中加入100L LB液體培養(yǎng)基,混勻后在37振蕩培養(yǎng)30min。 （4）從管1中取50L涂布于含抗生素和不含抗生素的平板上,從管2中取50L和100L涂布于含抗生素的平板上。正面向上放置約10分鐘,待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)

33、皿,37培養(yǎng)20小時。（50L和100L構成濃度梯度，便于后續(xù)篩選菌落密度合適的平板）Kan-Kan+Kan+Kan+管1 管1 管2 管250L 50L 50L 100L實驗六 重組質粒DNA的鑒定（雙酶切法和菌落PCR法）一、實驗目的掌握雙酶切法鑒定重組質粒DNA的基本原理和操作步驟，以及菌落PCR法鑒定重組質粒DNA的基本原理。了解菌落PCR法鑒定菌落及保存的操作方法。二、基本原理重組質粒DNA是利用限制性內(nèi)切酶（如BamH I和Not I）分別酶切基因片段和質粒后，利用基因片段和質粒DNA一端帶有相同的粘性末端連接起來的重組質粒，如果再利用相同的限制性內(nèi)切酶識別重組基因片段兩側的酶切位

34、點，通過酶切下的重組片段的大小與連接的基因片段大小是否相同判斷質粒DNA是否為重組質粒。單菌落或提取的質粒DNA也可以通過PCR方法鑒定正確克隆。聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，簡稱PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法。典型的PCR由高溫變性、低溫退火和適溫延伸等三步反應組成一個循環(huán)周期，通過多次循環(huán)反應，使目的DNA得以迅速擴增。其主要步驟是：將待擴增的DNA置于高溫下使之解鏈，人工合成的兩個寡核苷酸引物在低溫下分別在目的片段兩側與DNA兩條鏈互補結合；DNA聚合酶在72將單核苷酸從引物的3端開始摻入，沿模板從53方向延伸，合成DNA的新互補鏈。

35、具體地說，PCR反應系統(tǒng)有寡核苷酸引物，反應緩沖液，熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶），脫氧核苷三磷酸底物和靶序列（即模板）等五部分組成，缺一不可。PCR技術能在試管中建立反應，經(jīng)數(shù)小時之后，就能將極微量的某一特定的目的DNA片段擴增106倍以上，而無需經(jīng)過煩瑣的基因克隆程序便可獲得足夠數(shù)量的精確的DNA拷貝。它操作簡單，易于掌握，結果也較為可靠，為基因的分析和研究提供了一種強有力的手段，對整個生命科學的研究與發(fā)展都有深遠的影響。因此，PCR技術產(chǎn)生的時間雖不長，卻以驚人的速度廣泛地應用于分子生物學的各個領域。它可用于基因的分離、克隆和核苷酸序列分析、突變體和重組體的構建、基因表達調控的研究、基因

36、多態(tài)性的分析、遺傳病和傳染病的診斷、腫瘤機制的探索及法醫(yī)鑒定等諸多方面。三、實驗材料、儀器及試劑1. 實驗材料pET-28a重組質粒DNA或菌落2. 使用儀器PCR儀，掌中寶離心機，冰箱，小型混合器，電泳槽和電泳儀，1.5ml離心管，移液器及吸頭，藍盾可見光透射儀，恒溫培養(yǎng)箱3. 試劑BamH I(10U/L) (TaKaRa公司); Not I(10U/L) (TaKaRa公司)四、實驗步驟1. 雙酶切法（1） 隨機挑取2個單菌落，接種，37振蕩培養(yǎng)過夜。（2） 質粒DNA的提取（堿裂解法）。（3） 雙酶切鑒定體系(10l)。反應物(l) 管1 管2 質粒DNA 22 BamH I 0.5

37、0.5 Xho I 0.5 0.5 10buffer K 1 1 ddH2O/l 6 6 （4） 室溫酶切2.5-3h。（5） 配制1.0%（M/V）普通瓊脂糖凝膠20ml。（6） 酶切樣品中加入5l溴酚藍-GeneFinder混合液混勻，上樣。（7） 1TBE Buffer，80V(3-4V/cm)下電泳30min。（8） 熒光激發(fā)器觀察質粒DNA條帶的酶切情況，并照像。并確定最終的陽性克隆2. 菌落PCR法（1） 挑取菌落隨機挑取5個菌落。首先使用無菌槍頭挑取菌落，在已準備好的含有卡那抗菌素，分好區(qū)的固體培養(yǎng)基中輕劃一下（為保菌種），然后將余下菌置于eppendorf管中（作為PCR反應模

38、板）。（2） PCR反應體系（20l）反應物 體積/ dNTP（10mM）2 左引物0.5 右引物0.5 Taq酶（5U/L）0.5 MgCl2(25mM)1.210Buffer 2 ddH2O13.3 （3） PCR循環(huán)： 95 5min予變性（95 60s；58 60s；72 90s）30cycles 72 10min延伸（4） PCR產(chǎn)物的檢測PCR產(chǎn)物加入5l溴酚藍-GeneFinder混合液，分別按編號加入DNA瓊脂糖凝膠電泳的加樣孔，使用1%瓊脂糖電泳分離。（5） 用熒光激發(fā)器看結果，確定陽性克隆的位置。五、實驗結果實驗七 GFP蛋白的誘導表達一、實驗目的掌握用IPTG誘導GFP基

39、因表達的基本原理及基本操作步驟。二、實驗原理IPTG（異丙基硫代-L半乳糖苷）是一種常見的誘導基因表達的誘導劑，結構類似乳糖。GFP基因連接到pET-28a的多克隆位點（MCS），GFP基因的表達受其上游T7啟動子和操縱基因O位點以及結合到這些順式作用元件的蛋白因子的控制。LacI基因編碼調節(jié)蛋白，可以四聚體的形式結合到操縱基因O位點上，關閉GFP基因的表達。IPTG可與四聚體調節(jié)蛋白結合，從而改變調節(jié)蛋白的構象，使調節(jié)蛋白不再與O位點結合。接著BL21編碼的T7 RNA聚合酶結合到T7啟動子位點，從而啟動GFP基因的表達。三、實驗材料和儀器1.實驗材料BL21，pET-28a重組質粒DNA2.使用儀器離心機，冰箱，小型混合器，移液器，恒溫培養(yǎng)箱，手持式紫外燈，超凈工作臺。四、實驗步驟1. 取陽性克隆質粒DNA轉化BL21；2. 在含有Kan的固體培養(yǎng)基上，37培養(yǎng)20h；3. 挑取單菌落，37振蕩培養(yǎng)過夜；