蛋白酶的鹽析沉淀實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、蛋白酶的鹽析沉淀實(shí)驗(yàn)報(bào)告班級(jí)：生工1005 學(xué)號(hào)：0203100520姓名：朱同輝實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?掌握使蛋白質(zhì)膠體溶液保持穩(wěn)定的因素；2. 了解蛋白質(zhì)沉淀的幾種方法及其意義；3. 掌握測(cè)定蛋白酶活力的原理和方法；4學(xué)習(xí)酶活力的計(jì)算方法。實(shí)驗(yàn)原理：鹽析法在蛋白質(zhì)溶液中加入少量中性鹽，蛋白質(zhì)溶解度增加，稱為鹽溶；而加入大量中性鹽達(dá) 一定濃度，蛋白質(zhì)就會(huì)沉淀，稱為鹽析。原理：大量鹽加入后，能與蛋白質(zhì)爭(zhēng)奪水分子，去除水膜；大量鹽能中和蛋白質(zhì)分子表面電荷，使分子間靜電斥力減弱，疏水作用增強(qiáng)，使蛋白 質(zhì)沉淀。鹽析效果：二價(jià)離子 一價(jià)離子離子半徑小 離子半徑大陽離子：Mg2+Ca2+Ba2+NH4+Na+K+P

2、b+Cs+陰離子：PO43-SO42-CI-Br-NO3-I-SCN-log S 二 - K sI蛋白質(zhì)的溶解度與鹽離子強(qiáng)度間的關(guān)系可以用 式中：s蛋白質(zhì)的溶解度I離子強(qiáng)度B 常數(shù)，與溫度和pH有關(guān).1 y2丨二 2 CiZiKs 鹽析常數(shù)，與蛋白質(zhì)和鹽的種類有關(guān)二匚其中I根據(jù)下式計(jì)算:式中：cii離子的濃度（mol/L） zii離子所帶的電荷蛋白酶活力的測(cè)定福林（Folin）試劑在堿性條件下可被酪氨酸還原成蘭色化合物，蛋白酶水解酪蛋白產(chǎn)生 酪氨酸，將產(chǎn)物中未被水解的酪蛋白除去后與福林試劑作用，根據(jù)顯蘭色的深淺可以計(jì)算出 酪氨酸的產(chǎn)生量，從而推斷酶活力的大小。蛋白酶液的稀釋、酶活測(cè)定和計(jì)算K

3、在酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線上 0.D值為I時(shí)酪氨酸的微克數(shù)（卩g）, K值為108.53N酶液稀釋倍數(shù)4酶反應(yīng)液為4 ml，取出1 ml測(cè)定，故乘以410反應(yīng)時(shí)間為10 min參考稀釋倍數(shù)：原酶、飽和度20%，30%，40%，50%，60%, 70%的上清液分別為 1000，200，150，100，100，100，50 倍實(shí)驗(yàn)步驟：1）蛋白質(zhì)鹽析分兩個(gè)大組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每大組取6只燒杯編號(hào)，分別加入50 ml蛋白酶液，分別稱量5.70,8.80，12.16，15.66，19.5和23.6固體硫酸銨粉末（對(duì)應(yīng) 20%，30%，40%，50%，60%，70%飽和度），在磁力攪拌器不 斷攪拌下，將其緩慢加入酶液中

4、，加完后再攪拌5 min，使硫酸銨完全溶解。然后靜置使蛋白酶沉淀完全。將含有沉淀的酶液小心倒入離心管中，在天平上稱重平衡，用高速冷凍離心機(jī)離心于10C, 10,000 r/min離心20 min。將上層清液倒入量筒記錄其體積，并分別測(cè)定酶活（u/ml），即為該酶的溶解度 S。2）蛋白酶活力的測(cè)定：1將2%酪蛋白溶液40C預(yù)熱3-5min2.取3支試管編號(hào)0、1、2，分別吸取待測(cè)酶液 1ml放入試管中，40C水浴中預(yù)熱1-2min3往0號(hào)試管加入0.4mol/L三氯醋酸2ml，再往3支試管中加入2%酪蛋白1ml，計(jì)時(shí)搖勻，40C反應(yīng) 10mi n4往1、2號(hào)試管中加入0.4mol/L三氯醋酸2m

5、l，搖勻，取出3支試管靜置10min5. 另取3支試管，分別吸取上述清液1ml，各加入0.4mol/L碳酸鈉溶液5ml，福林試劑1ml，于40 C水浴中保溫20min顯色。6. 以0號(hào)管為對(duì)照，在波長(zhǎng) 680nm處測(cè)定1、2號(hào)管的吸光度，求出平均值。3）蛋白酶液的稀釋、酶活測(cè)定和計(jì)算計(jì)算出各種硫酸銨飽和度下的硫酸銨濃度，離子強(qiáng)度，蛋白酶溶解度和上清液酶活殘留，并填表。以log S為縱坐標(biāo)，I為橫坐標(biāo)作圖，將直線部分線性回歸，求出Ks和3的數(shù)值，建立起蛋白酶的鹽析曲線。數(shù)據(jù)記錄及實(shí)驗(yàn)結(jié)果：編號(hào)O.D680平均值上清液體積/mL4酶活力 二丄 K N O .D原酶液10.3880.40620.42

6、4飽和度20%11.0691.12155.821.173飽和度30%10.8190.82155.420.823飽和度40%10.9520.98553.021.018飽和度50%10.0210.22056.220.418飽和度60%10.0620.05158.520.040飽和度70%10.0910.15162.120.211編號(hào)(NH4)2SO4 濃度 mol/L離子強(qiáng)度1上清液酶活蛋白酶溶解度SlogS原酶液00飽和度20%0.822.464866271522.85.43飽和度30%1.233.697128394891.25.59飽和度40%1.644.926414339942.05.53飽

7、和度50%2.056.1595553671.04.72飽和度60%2.467.3822112928.54.11飽和度70%2.878.6132820368.84.31討論：通過本次試驗(yàn)，初步掌握了蛋白酶鹽析沉淀及其酶活測(cè)定的方法。在開始實(shí)驗(yàn)時(shí)，對(duì)實(shí) 驗(yàn)的整體思路沒有理解，僅僅盲目的按照步驟進(jìn)行，導(dǎo)致浪費(fèi)了很多時(shí)間，并且實(shí)驗(yàn)結(jié)果不 理想。希望老師能在實(shí)驗(yàn)的前一周把講義發(fā)給大家，進(jìn)行充分的預(yù)習(xí)，對(duì)提高實(shí)驗(yàn)效率和準(zhǔn) 確度會(huì)有幫助。清代 紅頂商人”胡雪巖說： 做生意頂要緊的是眼光，看得到一省，就能做一省的生意；看得到天下，就能做天下的生意；看得到外國(guó)，就能做外國(guó)的生意。”可見，一個(gè)人的心胸和眼光，決定了他志向的短淺或高遠(yuǎn)；一個(gè)人的希望和夢(mèng)想，決定了他的人生暗淡或輝煌。人生能有幾回搏，有生不搏待何時(shí)！所有的機(jī)遇和成功，都在充滿陽光，充滿希望的大道之上！我們走過了黑夜，就迎來了黎明；走過了荊棘，就迎來了花叢；走過了