提高先導(dǎo)化合物活性重現(xiàn)性試驗(yàn)

1、提高先導(dǎo)化合物活性重現(xiàn)性試驗(yàn)DOI：10.14088/jki.issn0439-8114.2016.23.032： In view of the instable reproducibility ofre-fermentation activities in screening of lead compounds， the effects of storage time on the reproducibility of activity in screening process were studied. Several batches of re-fermentation samples

2、were used to test against 3 insecticide targets and 4 herbicide targets. The results showed that in screening of strains in storage for 1 year ， about 60%of screening samples lost their initial activities ， but in screening of strains with half a years storage ， only about 40% of strains lost activi

3、ties. Adjusting re-fermentation intervals according to the results ， and changing the concentrated re-fermentation into a decentralized re-fermentation in synchronization，the re-fermentation in accordance with the preliminary screening concluded that about 81.56% strains could realize the preliminar

4、y screening activity ， which greatly improved the detection efficiency of alternative compounds.微生物源先導(dǎo)化合物源于微生物發(fā)酵代謝產(chǎn)物， 常規(guī)的篩選流程持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)數(shù)月。 由于發(fā)酵產(chǎn)物的不穩(wěn)定性， 微生物源先 導(dǎo)化合物的初篩、復(fù)篩、化合物分離、純化和制備都需要新鮮的 發(fā)酵液， 對(duì)于每年近一百萬(wàn)份的高通量篩選體系， 不可能對(duì)每個(gè) 菌株預(yù)先進(jìn)行大量發(fā)酵， 制備足量的發(fā)酵液用于整個(gè)流程。 近幾 年的篩選結(jié)果顯示，每一輪重復(fù)發(fā)酵，有近50%的提取物無(wú)法重現(xiàn)活性。 重現(xiàn)活性的提取物中， 大部分含有殺粉蝶素或

5、格爾德霉 素類的高產(chǎn)量、高毒性、廣譜的已知化合物，低產(chǎn)量、低毒性的 化合物在重復(fù)發(fā)酵過(guò)程中更容易丟失。 本研究為提高活性化合物 的重現(xiàn)性，對(duì) 3 個(gè)殺蟲活性篩選靶標(biāo)和 4 個(gè)除草活性篩選靶標(biāo)進(jìn) 行了試驗(yàn)，以提高先導(dǎo)化合物的篩選效率。1 材料與方法1.1 試驗(yàn)材料1.1.1 先導(dǎo)化合物 篩選靶標(biāo)：狗芽根、油菜、擬南芥、浮 萍、小菜蛾、棉鈴蟲、蚜蟲，共 7 個(gè)靶標(biāo)。1.1.2 瓊脂粉 北京鼎昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，型 號(hào) DH010-4。1.1.3 試劑 丙酮、乙醇、二甲基亞砜（DMSO、N N-二甲 基甲酰胺（DMF、吐溫-80試劑，以上試劑均為市售分析純化 學(xué)試劑。1.1.4 供篩選試驗(yàn)

6、樣品 放線菌、真菌發(fā)酵提取物，由湖北 省生物農(nóng)藥工程研究中心微生物工程研究室提供； 提取物組分及 純化樣品由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心化學(xué)分析研究室提供；供試靶標(biāo)由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心養(yǎng)蟲室提供。1.1.5 主要儀器設(shè)備 B100-1F 蠕動(dòng)泵、 BIOHIT eLINE 八能 道電子移液器、 Intega96 通道移液機(jī)、 96 孔組織培養(yǎng)板、 24 孔 組織培養(yǎng)板、人工氣候室。1.2 試驗(yàn)方法1.2.1 菌株的選擇及分組 長(zhǎng)期冷凍保藏的菌株為 2014 年212月完成初篩的菌株。選擇初篩有殺蟲或除草活性的菌株進(jìn) 行分組， 僅對(duì)一個(gè)靶標(biāo)有活性的菌株為第一組， 對(duì)兩個(gè)及兩個(gè)以 上靶標(biāo)有活

7、性的菌株為第二組。 未經(jīng)長(zhǎng)期冷凍保藏的菌株選擇范 圍為 2015年6月至 2016年 2月完成初篩的菌株， 選擇初篩有殺 蟲或除草活性的菌株按活性進(jìn)行分組， 僅對(duì)一個(gè)靶標(biāo)有活性的菌 株為第三組，對(duì)兩個(gè)及兩個(gè)以上靶標(biāo)有活性的菌株為第四組。1.2.2 菌株活化和重復(fù)發(fā)酵及提取 對(duì)“1.2.1 ”選擇的 4 組菌株進(jìn)行活化和重復(fù)發(fā)酵。 發(fā)酵液立即進(jìn)行凍干、 提取和干燥， 每一個(gè)提取物分別用甲醇溶解后分成 3 等份，其中一份用于生物 測(cè)定，一份用于高效液相色譜分析， 一份冷凍保存。 1.2.3 重復(fù)發(fā)酵提取物的篩選及與原始發(fā)酵提取物的篩選結(jié)果比較1）提取物的生物測(cè)定。把各提取物配制成母液，濃度以發(fā)酵液

8、體積為基準(zhǔn)，每4 mL發(fā)酵液的提取物為一個(gè)單位， 加入0.1 mL乙醇溶解，然后加入0.9 mL無(wú)菌水制成母液。以人工飼料表 面涂布法進(jìn)行小菜蛾和棉鈴蟲的生物測(cè)定 1 ，以浸葉法進(jìn)行蚜 蟲的生物測(cè)定，以瓊脂表面涂布法進(jìn)行油菜、狗芽根、擬南芥除草活性的生物測(cè)定 2 ，以浸漬法進(jìn)行浮萍除草活性的生物測(cè)定。各組織培養(yǎng)板中加入人工飼料或瓊脂量為 0.2 mL/ 孔，表面 涂布提取物溶液量為 0.02 mL/ 孔，每個(gè)濃度設(shè) 2 個(gè)重復(fù)。培養(yǎng) 條件為：溫度25 C,相對(duì)濕度70%-80%光照時(shí)間14 h/d 。7 d 后檢查并記錄結(jié)果。2）活性評(píng)價(jià)指標(biāo)。根據(jù)活性反應(yīng)的不同，使用兩項(xiàng)指標(biāo)標(biāo) 記除草活性 3

9、 ：種子不萌芽的標(biāo)記為 9，植株長(zhǎng)勢(shì)（株高）不 及空白對(duì)照的標(biāo)記為 5，與空白對(duì)照相近則標(biāo)記為 0；第二種以 植株黃化為指標(biāo)進(jìn)行標(biāo)記，按 0、5Y、9Y 分級(jí)。殺蟲活性分為三 級(jí)4 ，幼蟲全部死亡標(biāo)記為 9，幼蟲部分死亡或生長(zhǎng)緩慢標(biāo)記 為 5，與空白對(duì)照相近標(biāo)記為 0。3）活性結(jié)果比對(duì) 5 。比較原始提取物與重復(fù)發(fā)酵提取物的 活性吻合率。在本試驗(yàn)中，只要復(fù)篩活性發(fā)生變化，無(wú)論靶標(biāo)增 加或減少， 都統(tǒng)計(jì)為復(fù)篩活性與初篩活性不吻合。 而在實(shí)際篩選 流程中，只要對(duì)任一靶標(biāo)有活性，均視為重復(fù)有活性，可以進(jìn)入 下一步篩選步驟。1.2.4 根據(jù)初篩結(jié)果選擇有活性的菌株， 同步進(jìn)行重復(fù)發(fā)酵 常規(guī)的復(fù)篩流程，

10、需要集中一批初篩有活性的樣品，通常 6090 個(gè)，然后同時(shí)進(jìn)行搖瓶發(fā)酵、提取、干燥、分析。每次發(fā)酵 都要進(jìn)行菌種活化、二級(jí)發(fā)酵、提取、干燥、生物測(cè)定等，整個(gè) 流程時(shí)間長(zhǎng)， 而且各環(huán)節(jié)之間有時(shí)間間隔， 重復(fù)發(fā)酵時(shí)間間隔通 常在 25 周以上。本試驗(yàn)根據(jù)每周初篩結(jié)果，對(duì)初篩有活性的樣品，同步進(jìn)行重復(fù)發(fā)酵；所用菌種為近期進(jìn)行第一次發(fā)酵，菌種 只經(jīng)過(guò)短期低溫保存（4 C），初篩與重復(fù)發(fā)酵間隔時(shí)間為56 周。2 結(jié)果與分析2.1長(zhǎng)期冷凍保藏（-20 C）菌株，經(jīng)過(guò)重新活化、發(fā)酵、 提取后進(jìn)行篩選的結(jié)果2.1.1 長(zhǎng)期冷藏殺蟲活性樣品重復(fù)篩選結(jié)果 為準(zhǔn)確地比較 復(fù)篩活性重現(xiàn)， 把殺草活性和殺蟲活性分別進(jìn)行

11、分析。 試驗(yàn)結(jié)果（表 1 ）顯示，除了對(duì)蚜蟲、小菜蛾和棉鈴蟲具有廣譜活性的樣 品外，其他活性樣品復(fù)篩活性重現(xiàn)率均較低，平均重現(xiàn)率為 39.02%。2.1.2 長(zhǎng)期冷藏除草活性樣品重復(fù)篩選結(jié)果2014年 2 1 2月擬南芥尚未進(jìn)行常規(guī)篩選，所以本批樣品 復(fù)篩中沒(méi)有擬南芥進(jìn)行復(fù)篩。結(jié)果（表2）顯示， 除了對(duì)油菜、浮萍和狗芽根具有廣譜活性的樣品外， 其他樣品復(fù)篩活性重現(xiàn)率 均低，平均重現(xiàn)率為 33.92%。2.2短期低溫保藏（4 C）菌株重復(fù)發(fā)酵后進(jìn)行篩選的結(jié)果2.2.1 短期冷藏殺蟲活性樣品重復(fù)篩選結(jié)果 表 3 顯示，對(duì) 蚜蟲、小菜蛾和棉鈴蟲具有廣譜活性的樣品重現(xiàn)率達(dá)到100%，其他活性樣品復(fù)篩活

12、性重現(xiàn)率均大于50%，平均重現(xiàn)率為59.85%。2.2.2 短期冷藏除草活性樣品重復(fù)篩選結(jié)果 表 4?示，對(duì)擬南芥、油菜、浮萍和狗芽根具有廣譜活性的樣品重現(xiàn)率為100%，其他活性樣品復(fù)篩活性重現(xiàn)率均高于 50%，平均重現(xiàn)率為 66.95%。2.3 復(fù)篩菌株進(jìn)行同步發(fā)酵的結(jié)果從 2016 年 4 月開(kāi)始，對(duì)初篩有活性的菌株進(jìn)行重復(fù)發(fā)酵， 連續(xù) 7 周。每周進(jìn)行重復(fù)發(fā)酵樣品 20株左右。重復(fù)發(fā)酵和第一 次發(fā)酵時(shí)間間隔為 6 周左右。選擇具有殺蟲或除草活性的 182個(gè) 菌株進(jìn)行重復(fù)發(fā)酵。重復(fù)發(fā)酵成功 179 株， 3 株生長(zhǎng)不正常，復(fù) 篩重現(xiàn)活性的樣品共 146 個(gè)，活性重現(xiàn)率為 81.56%。3 討論以生物測(cè)定活性為導(dǎo)向的微生物源先導(dǎo)化合物篩選， 需要經(jīng) 過(guò)初次發(fā)酵、生物測(cè)定、重復(fù)發(fā)酵和活性確認(rèn)，然后進(jìn)行大量發(fā) 酵，對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行預(yù)選、分離、純化和結(jié)構(gòu)分析。獲得一個(gè) 新化合物的整個(gè)篩選流程持續(xù)時(shí)間需要 40 周以上。在整個(gè)流程 中，經(jīng)過(guò)幾次重復(fù)發(fā)酵、提取和純化后，其間不斷有活性化合物 流失。從本研究結(jié)果可以看出， 重復(fù)發(fā)酵對(duì)活性樣品的流失影響 很大，隨著重復(fù)發(fā)酵間隔時(shí)間的減小，活性重現(xiàn)率提高；在實(shí)際 篩選中，菌種活化、二級(jí)發(fā)酵、提取、生物活性測(cè)定、高效液相 色譜分析等，每個(gè)步